<em> In Vitro</em> Модель гематоэнцефалического барьера Использование импедансной спектроскопии: основноевнимание- Т-клеток-эндотелиальной клеточное взаимодействие

Summary

Here, we describe an in vitro murine model of the blood-brain barrier that makes use of impedance cell spectroscopy, with a focus on the consequences on endothelial cell integrity and permeability upon interaction with activated T cells.

Abstract

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). This process is characterized by the transmigration of activated T cells across brain endothelial cells (ECs), the main constituents of the BBB. However, the consequences on brain EC function upon interaction with such T cells are largely unknown. Here we describe an assay that allows for the evaluation of primary mouse brain microvascular EC (MBMEC) function and barrier integrity during the interaction with T cells over time. The assay makes use of impedance cell spectroscopy, a powerful tool for studying EC monolayer integrity and permeability, by measuring changes in transendothelial electrical resistance (TEER) and cell layer capacitance (Ccl). In direct contact with ECs, stimulated but not naïve T cells are capable of inducing EC monolayer dysfunction, as visualized by a decrease in TEER and an increase in Ccl. The assay records changes in EC monolayer integrity in a continuous and automated fashion. It is sensitive enough to distinguish between different strengths of stimuli and levels of T cell activation and it enables the investigation of the consequences of a targeted modulation of T cell-EC interaction using a wide range of substances such as antibodies, pharmacological reagents and cytokines. The technique can also be used as a quality control for EC integrity in in vitro T-cell transmigration assays. These applications make it a versatile tool for studying BBB properties under physiological and pathophysiological conditions.

Introduction

Гематоэнцефалический барьер отделяет системный кровоток от центральной нервной системы (ЦНС) , ^{1 – 3.} Она обеспечивает физический барьер, который препятствует свободному движению клеток и диффузии водорастворимых молекул и защищает мозг от патогенов и потенциально опасных веществ. В дополнение к барьерной функции, ГЭБ обеспечивает доставку кислорода и питательных веществ к паренхиме головного мозга, что обеспечивает надлежащее функционирование нервной ткани. Функциональные свойства ГЭБ высоко регулируются его клеточных и межклеточных компонентов, с узкоспециализированными КЭ является ее основным структурным элементом. КЭ ГЭБ характеризуются наличием плотного контакта (TJ) комплексов, отсутствие фенестраций, крайне низкой пиноцитозные активностью и постоянно активных транспортных механизмов. Другие компоненты ВВВ базальная мембрана EC, перицитов вложения эндотелий, астроцитов концевые ноги и = ассоциированных парenchymal базальная мембрана также внести свой вклад в развитие, поддержание и функции ВВВ ^{2,4 – 6} и, вместе с нейронами и микроглии, образуют сосудисто – нервный узел (НВУ), что позволяет надлежащее функционирование ЦНС ^{7 – 9.}

В различных неврологических заболеваний, таких как нейродегенеративные, воспалительные или инфекционные заболевания, функция ГЭБ скомпрометирован ^2,5,10. Дисрегуляция TJ комплексов и механизмов молекулярных транспорта приводит к повышению проницаемости ГЭБ, лейкоцитов, воспаление и повреждение нейронов. Для изучения свойств ГЭБ при таких патофизиологических условиях, различные модели в пробирке ВВВ были установлены ^9,11,12. Вместе они предоставили ценную информацию о изменениях целостности барьера, проницаемости, а также транспортных механизмов. Эти модели используют эндотелиальные клетки человека, мыши, крысы, свиньи или бовечьего происхождения ^{13 – 18;} Первичные эндотелиальные клетки или клеточные линии культивируют либо в виде монокультуры или вместе с перицитов и / или астроцитов, чтобы более точно имитировать ГЭБ в естественных условиях ^{19 – 25.} В последние годы, измерение трансэндотелиальном электрического сопротивления (Тир) стала широко распространенным инструментом для оценки эндотелиальной барьерных свойств ^26,27.

TEER отражает полное сопротивление ионного потока через клеточный монослой и его снижение обеспечивает чувствительное измерение целостности эндотелиальной скомпрометированы барьера и, следовательно, повышенной проницаемости. Различные системы измерения Teer были разработаны, в том числе эпителиальной Voltohmmeter (EVOM), электрический Cell-подложка импеданса зондированию (ВЕ) и клеточного анализа в реальном масштабе времени ^{15,28 – 30.} TEER отражает сопротивление потока ионов между соседними КЭ (парацеллюлярная маршрута) и прямо пропорциональнацелостности барьера. В импедансной спектроскопии ^27,31, комплексное полное сопротивление (Z) измеряется, которая обеспечивает дополнительную информацию о целостности барьера путем измерения CCL. Ccl относится к емкостной ток через клеточную мембрану (трансцеллюлярного маршрут): Клеточный слой действует как конденсатор в эквивалентной электрической цепи, разделяющей заряды на обеих сторонах мембраны и обратно пропорционален целостности барьера. При выращивании на проницаемые вставок, КЭ прилипать, пролиферируют и распространяются на микропористой мембраны. Это противодействует фоновый емкостного тока вставки (который сам по себе действует как конденсатор) и приводит к уменьшению емкости до тех пор, пока не достигнет своего минимального уровня. За этим следует путем создания TJ комплексов, которые перекрывают пространство между соседними КЧС. Это ограничивает поток ионов через маршрут парацеллюлярной и ТЭЭУ увеличивается, пока не достигнет своего плато. При воспалительных процессах, однако, endotheliаль барьер скомпрометирована: TEER уменьшается по мере TJ комплексы получают нарушается и Ccl возрастает по мере емкостной составляющей вставки снова поднимается.

Наше измерение TEER использует автоматизированную систему мониторинга ячейки ^32: он следует принципу импедансной спектроскопии и расширяет свои предыдущие приложения. Здесь мы опишем экстракорпорального ВВВ модели в том , что позволяет исследовать барьерных свойств, в том числе взаимодействие мозга эндотелий с иммунными клетками; в частности, активированных Т-клеток. Такие патофизиологических условиях наблюдаются при аутоиммунных заболеваниях центральной нервной системы , таких как рассеянный склероз и его модели для животных экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита ^{33 – 37.} Здесь решающим шагом является трансмиграция энцефалитогенных, миелин-специфических Т-клеток через ВВВ. Это сопровождается их реактивации в периваскулярной пространстве и вступление в паренхиме головного мозга, где они принимают на работу других иммунных клеток и меняственной воспаления и последующего демиелинизация ^1,35,38. Однако молекулярные механизмы взаимодействия таких Т-клеток и эндотелиальных клеток, основными составляющими ГЭБ, не до конца понятны. Наш протокол призван восполнить этот пробел и дать новое понимание последствий на эндотелиальных клетках (то есть, целостность барьера и проницаемости) при их непосредственном контакте и взаимодействии с комплексным активированными Т – клетками.

Протокол, описанный здесь, использует первичный мозга мыши микрососудистой эндотелиальных клеток, выращенных в виде монослоя на проницаемых вставках с микропористым мембранам. Эндотелиальные клетки культивировании совместно с CD4 ⁺ Т – клеток, которые могут быть предварительно активированными либо поликлонально или в моде антиген-специфической. Совместное культивирование MBMECs с предварительно активированные, но не наивным Т-клеток индуцирует снижение TEER и увеличение в БКК, которая обеспечивает количественную меру дисфункции и разрушения барьера MBMEC. техникаявляется неинвазивным: он использует встроенный вместо Chopstick электродов, которые предотвращают серьезное нарушение общественного порядка монослоя ЕС; он может быть использован для мониторинга барьерной функции без использования клеточных маркеров. Это делает непрерывные измерения в автоматическом режиме и позволяет провести независимую оценку двух параметров барьера (Тир и CCL) одновременно с течением времени. Этот метод также достаточно чувствителен, чтобы различать разные уровни активации Т-клеток и эффектов таких Т-клеток на КЧС.

Он может быть использован в широком диапазоне функциональных анализов: различные цитокины и / или хемокины замешанные в воспалительных процессах могут быть добавлены к совместной культуре MBMECs и Т-клеток; можно использовать блокирующие антитела против молекул клеточной адгезии либо на ЕС или стороне Т-клеток; и ингибиторы маркеров активации Т-клеток или их цитолитического свойств могут быть добавлены во время примирования Т-клеток или их совместном культивировании с КЧС. Анализ также полезен для Т-клеток переселенииАнализы, так как он может служить в качестве контроля качества целостности монослоя MBMEC перед добавлением Т-клеток. Все это делает этот метод универсальный и надежный инструмент для изучения ГЭБ в пробирке, с акцентом на эффекте активированных Т – клеток на целостность монослоя EC. Это имеет особое значение для понимания механизмов нарушения ГЭБ в патогенезе аутоиммунных заболеваний, таких как MS и его животной модели EAE, где самореактивными, энцефалитогенных Т-клетки проникает через ГЭБ и вызывать воспаление и повреждение нейронов.

Protocol

Для всех экспериментов мышей разводили и поддерживали под конкретного патогена условий в центральном виварии в Университете Мюнстера, в соответствии с немецкими руководящими принципами для ухода за животными. Все эксперименты проводились в соответствии с руководящими принципами Комитета по э?…

Representative Results

На рисунке 1 представлен общий обзор модели в пробирке ВВВ используется для изучения взаимодействия между Т – клеток и эндотелиальных клеток. Эксперимент состоит из трех основных этапов. Первым шагом является выделение первичных MBMECs из коры головного мо…

Discussion

Несколько шагов описанного протокола имеют важное значение для успешного эксперимента. В ходе первоначальной изоляции и культуры MBMEC, крайне важно, что работа выполняется в стерильных условиях в максимально возможной степени, чтобы предотвратить загрязнение культуры клеток грибковы…

Materials

cellZscope	nanoAnalytics GmbH	www.nanoanalytics.com	including: 24-well Cell Module, Controller, PC with cellZscope software v2.2.2
Ultracentrifuge	Thermo Scientific	www.thermoscientific.com	SORVALL RC 6+; rotor F21S-8x50y; for MBMEC isolation
flow cytometer	Beckman Coulter	www.beckmancoulter.com	for analysis of T cell transmigration
FlowJo7.6.5 software	Tree Star	www.flowjo.com	for analysis of T cell transmigration
Oak Ridge centrifuge tubes, PC	Thermo Fisher Scientific	3118-0050	50 ml; for MBMEC isolation
Transwell membrane inserts – pore size 0.4 µm	Corning	3470	for TEER measurement as the main readout
Transwell membrane inserts – pore size 3 µm	Corning	3472	for TEER measurement as the quality control prior to T-cell transmigration assay
24-well cell culture plate	Greiner	650 180	flat-bottom; for MBMEC culture
96-well cell culture plate	Costar	3526	round-bottom; for immune cell culture
QuadroMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-090-976	for T cell and B cell isolation; supports MACS LS columns
OctoMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-042-109	for dendritic cell isolation; supports MACS MS columns
Neubauer counting chamber	Marienfeld	MF-0640010	for cell counting
Cell strainer, 70 µm	Corning	352350	for immune cell isolation
Cell strainer, 40 µm	Corning	352340	for immune cell isolation
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303	for immune cell isolation
MACS LS separation columns	Miltenyi Biotec	130-042-401	for T cell and B cell isolation
MACS MS separation columns	Miltenyi Biotec	130-042-201	for dendritic cell isolation
Mouse CD4 MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-049-201	for CD4+ T cell isolation
Mouse CD19 MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-052-201	for B cell isolation
Mouse CD11c MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-052-001	for dendritic cell isolation
Collagen type IV from human placenta	Sigma	C5533	for MBMEC coating solution
Fibronectin from bovine plasma	Sigma	F1141-5MG	for MBMEC coating solution
Collagenase 2 (CSL2)	Worthington	LS004176	for MBMEC isolation
Collagenase/Dispase (C/D)	Roche	11097113001	for MBMEC isolation
DNase I	Sigma	DN25	for MBMEC isolation
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma	F7524	for MBMEC isolation
Bovine Serum Albumin (BSA)	Amresco	0332-100G	for MBMEC isolation
Percoll	Sigma	P1644-1L	for MBMEC isolation
DMEM (+ GlutaMAX)	Gibco	31966-021	for MBMEC isolation and MBMEC culture medium
Penicillin/Streptomycin	Sigma	P4333	for MBMEC isolation and MBMEC culture medium
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Sigma	D8537	for MBMEC and immune cell isolation
Heparin	Sigma	H3393	for MBMEC culture medium
Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)	PeproTech	100-18B	for MBMEC culture medium
Puromycin	Sigma	P8833	for MBMEC culture medium; only for the first three days
0.05% Trypsin-EDTA	Gibco	25300-054	for harvesting MBMECs
Collagenase Type IA	Sigma	C9891	for dendritic cell isolation
Trypan Blue solution, 0.4%	Thermo Fisher Scientific	15250061	for cell counting
EDTA	Sigma	E5134	for immune cell isolation
IMDM + 1% L-Glutamin	Gibco	21980-032	for T cell culture medium
X-VIVO 15	Lonza	BE04-418Q	protect from light; for B cell culture medium
β-mercaptoethanol	Gibco	31350-010	for B cell culture medium
L-Glutamine (100x Glutamax)	Gibco	35050-061	for B cell culture medium
mouse MOG35—55 peptide	Biotrend	BP0328	for antigen-specific T cell activation
purified anti-mouse CD3 Ab	BioLegend	100302	clone 145-2C11; for polyclonal T cell activation
purified NA/LE anti-mouse CD28 Ab	BD Pharmingen	553294	clone 37.51; for polyclonal T cell activation
Recombinant Murine IFN-γ	PeproTech	315-05	for T-cell transmigration assays
Recombinant Murine TNF-α	PeproTech	315-01A	for T-cell transmigration assays
NA/LE purified anti-mouse IFN-γ antibody	BD Biosciences	554408	clone XMG1.2; recommended final concentration: 20 µg/ml
Granzyme B Inhibitor II	Calbiochem	368055	recommended final concentration: 10 µM
PE anti-mouse CD4 antibody	Biolegend	116005	clone RM4-4; for analysis of T cell transmigration