Ein<em> In Vitro</em> Modell der Blut-Hirn-Schranke Mit Impedanzspektroskopie: Ein Fokus auf T-Zell-Endothelzellinteraktion

Summary

Here, we describe an in vitro murine model of the blood-brain barrier that makes use of impedance cell spectroscopy, with a focus on the consequences on endothelial cell integrity and permeability upon interaction with activated T cells.

Abstract

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). This process is characterized by the transmigration of activated T cells across brain endothelial cells (ECs), the main constituents of the BBB. However, the consequences on brain EC function upon interaction with such T cells are largely unknown. Here we describe an assay that allows for the evaluation of primary mouse brain microvascular EC (MBMEC) function and barrier integrity during the interaction with T cells over time. The assay makes use of impedance cell spectroscopy, a powerful tool for studying EC monolayer integrity and permeability, by measuring changes in transendothelial electrical resistance (TEER) and cell layer capacitance (Ccl). In direct contact with ECs, stimulated but not naïve T cells are capable of inducing EC monolayer dysfunction, as visualized by a decrease in TEER and an increase in Ccl. The assay records changes in EC monolayer integrity in a continuous and automated fashion. It is sensitive enough to distinguish between different strengths of stimuli and levels of T cell activation and it enables the investigation of the consequences of a targeted modulation of T cell-EC interaction using a wide range of substances such as antibodies, pharmacological reagents and cytokines. The technique can also be used as a quality control for EC integrity in in vitro T-cell transmigration assays. These applications make it a versatile tool for studying BBB properties under physiological and pathophysiological conditions.

Introduction

Die Blut-Hirn – Schranke trennt den systemischen Kreislauf aus dem zentralen Nervensystem (ZNS) ^{von 1 bis 3.} Es stellt eine physikalische Barriere, die die freie Bewegung von Zellen und die Diffusion von wasserlöslichen Molekülen und schützt das Gehirn vor Krankheitserregern und potenziell schädlichen Substanzen hemmt. Zusätzlich zu seiner Barrierefunktion ermöglicht die BBB die Abgabe von Sauerstoff und Nährstoffen an das Hirnparenchym, das einwandfreie Funktionieren des neuronalen Gewebes gewährleistet. Funktionelle Eigenschaften der BHS durch ihre zellulären und azellulären Komponenten stark reguliert, mit hochspezialisierten ECs sein Hauptstrukturelement zu sein. ECs der BBB sind durch die Anwesenheit von tight junction (TJ) -Komplexe, der Mangel an fenestrations, extrem niedrige pinocytic Aktivität und permanent aktive Transportmechanismen aus. Andere Komponenten des BBB die EG Basalmembran, pericytes Einbetten des Endothels, astrozytären Ende Füße und = zugehöriges parenchymal Basalmembran tragen auch zur Entwicklung, Wartung und Funktion der BHS ^{2,4 – 6} und zusammen mit Neuronen und Mikroglia, bilden die neurovaskuläre Einheit (NVU), das reibungslose Funktionieren des ZNS ⁷ ermöglicht ^{– 9.}

In einer Vielzahl von neurologischen Erkrankungen, wie von neurodegenerativen, entzündlichen oder Infektionskrankheiten wird die Funktion der BBB ^2,5,10 kompromittiert. Dysregulation von TJ Komplexe und molekulare Transportmechanismen führt BHS-Permeabilität, Leukozytenextravasation, Entzündungen und neuronaler Schädigung erhöht. Um BBB Eigenschaften unter solchen pathophysiologischen Bedingungen, verschiedene in vitro BBB Modelle wurden ^9,11,12 etabliert haben zu studieren. Gemeinsam haben sie wertvolle Einblicke in die Veränderungen der Integrität der Barriere, Permeabilität sowie Transportmechanismen zur Verfügung gestellt. Diese Modelle beschäftigen Endothelzellen von Mensch, Maus, Ratte, Schwein oder bSchafen Ursprung ^13-18; primären endothelialen Zellen oder Zelllinien kultiviert werden entweder als Monokultur oder zusammen mit Perizyten und / oder Astrozyten , um genauer die BBB in vivo ¹⁹ nachzuahmen ^{– 25.} In den letzten Jahren Messung der transendothelialen elektrische Widerstand (TEER) hat Eigenschaften ^26,27 ein weithin akzeptiertes Werkzeug zur Beurteilung Endothelbarriere werden.

TEER reflektiert die Impedanz für den Ionenfluss durch die Zellmonoschicht und die Abnahme ein empfindliches Maß für kompromittiert endothelialen Integrität der Barriere und damit eine erhöhte Durchlässigkeit. Verschiedene TEER Messsysteme wurden entwickelt, darunter Epithelial Cell (Evom), E – Zell-Substrat – Impedanz – Mess (ECIS) und Echtzeit – Zellanalyse ^{15,28 – 30.} TEER reflektiert den Widerstand gegenüber der Ionenfluss zwischen benachbarten ECs (parazellulärer Weg) und ist direkt proportional zu derBarriere Integrität. In der Impedanzspektroskopie ^27,31, komplexe Gesamtimpedanz (Z) gemessen wird , die durch die Messung Ccl zusätzliche Informationen über die Integrität der Barriere zur Verfügung stellt. CCL bezieht sich durch die Zellmembran (transzelluläre Route) mit dem kapazitiven Strom: die Zellschicht wirkt wie ein Kondensator in der elektrischen Ersatzschaltung, die Ladungen auf beiden Seiten der Membran trennt und ist umgekehrt proportional zu der Barrierenintegrität. Wenn auf durchlässigen Einsätzen gewachsen, haften ECs, vermehren und die mikroporöse Membran verteilt. Dies widersteht dem Hintergrund kapazitive Strom des Einsatzes (das sich wie ein Kondensator wirkt), und führt zu einer Abnahme in der Kapazität, bis er seinen minimalen Pegel erreicht. Dies wird durch die Errichtung von TJ gefolgt Komplexe, die Dichtung aus dem Raum zwischen benachbarten ECs. Dies beschränkt den Ionenfluss durch den parazellulären Weg und TEER erhöht, bis es seine Plateau erreicht. Unter entzündlichen Bedingungen wird jedoch die endothelial Barriere beeinträchtigt: TEER abnimmt, wenn TJ erhalten gestört Komplexen und Ccl zunimmt, wenn die kapazitive Komponente des Einsatzes wieder ansteigt.

Unsere TEER Messung nutzt die automatisierte Zellenüberwachung ³² System: Es folgt dem Prinzip der Impedanzspektroskopie und erweitert seine bisherigen Anwendungen. Hier beschreiben wir ein in vitro BBB Modell, das die Untersuchung der Barriereeigenschaften ermöglicht, einschließlich der Interaktion von Hirn Endothel mit Immunzellen; insbesondere aktivierte T-Zellen. ^{37 –} solche pathophysiologischen Bedingungen sind bei Autoimmunerkrankungen des ZNS, wie Multiple Sklerose und seine Tiermodell experimenteller Autoimmun – Enzephalomyelitis ³³ beobachtet. Hierbei ist ein entscheidender Schritt ist die Transmigration von enzephalitogenen, Myelin-spezifischen T-Zellen über die BBB. Dies wird durch die Reaktivierung im perivaskulären Raum und den Eintritt in das Hirnparenchym gefolgt, wo sie rekrutieren andere Immunzellen und mirschen Entzündung und anschließender Demyelinisierung ^1,35,38. Jedoch molekularen Mechanismen der Wechselwirkung zwischen diesen T-Zellen und Endothelzellen, die wichtigsten Bestandteile der BBB, sind nicht gut verstanden. Unser Protokoll zielt darauf ab , diese Lücke zu füllen und neue Erkenntnisse über die Auswirkungen auf die Endothelzellen (dh Barriere Integrität und Permeabilität) auf ihren direkten Kontakt und komplexe Zusammenspiel mit aktivierten T – Zellen geben.

Das hier beschriebene Protokoll nutzt primäre Mausgehirn mikrovaskulären Endothelzellen, als eine Monoschicht auf durchlässigen Einsätzen mit mikroporösen Membranen gewachsen. Endotheliale Zellen co-kultiviert mit CD4 ⁺ T – Zellen, die voraktiviert entweder polyklonal oder in einer Antigen-spezifischen Art und Weise werden kann. Co-Kultur von MBMECs mit voraktivierten, aber nicht naiver T-Zellen induziert eine Abnahme der TEER und eine Zunahme in CCl, die ein quantitatives Maß für die Störung MBMEC Dysfunktion und Barriere bereitstellt. Die Technikist nicht-invasiv: es statt chopstick Elektroden Einbau-Anwendungen, die große Störung der EC-Monoschicht zu verhindern; es kann Barrierefunktion zu überwachen, ohne die Verwendung von Zellmarker verwendet werden. Es macht kontinuierliche Messungen in einer automatisierten Weise und ermöglicht eine unabhängige Beurteilung der beiden Sperrparameter (TEER und CCL) gleichzeitig über die Zeit. Das Verfahren ist auch empfindlich genug, um zwischen verschiedenen Ebenen der T-Zellaktivierung und Wirkungen solcher T-Zellen auf ECs zu unterscheiden.

Es kann in einem weiten Bereich von funktionellen Assays verwendet werden: verschiedene Cytokine und / oder bei entzündlichen Prozessen beteiligt Chemokine können zur Kokultur von MBMECs und T-Zellen hinzugefügt werden; Antikörper gegen Zelladhäsionsmoleküle entweder auf der EC oder T-Zellenseite Blockierung kann verwendet werden; und Inhibitoren der T-Zellaktivierungsmarker oder ihrer zytolytischen Eigenschaften können während der T-Zell-Priming oder deren Co-Kultur mit ECs hinzugefügt werden. Der Test ist auch nützlich für die T-Zell-TransmigrationsAssays, da es als Qualitätskontrolle der MBMEC einschichtigen Integrität vor der Zugabe von T-Zellen dienen kann. All dies macht diese Methode ein vielseitiges und zuverlässiges Werkzeug , um die BBB in vitro zu studieren, mit einem Fokus auf die Wirkung von aktivierten T – Zellen , die auf EC einschichtigen Integrität. Dies ist von besonderer Bedeutung für das Verständnis der Mechanismen der BBB Störung in der Pathogenese von Autoimmunerkrankungen, wie beispielsweise MS und ihre EAE-Tiermodell, wo selbstreaktive, enzephalitogenen T-Zellen, die BBB durchqueren und Entzündungen und neuronalen Schäden führen.

Protocol

Für alle Versuche wurden die Mäuse gezüchtet und unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen in der zentralen Tieranlage an der Universität Münster, nach den deutschen Richtlinien für die Tierpflege gehalten. Alle Versuche wurden nach den Richtlinien des Tierversuchsethikkommission durchgeführt und von den örtlichen Behörden des Landes Nordrhein-Westfalen, Deutschland (LANUV, AZ 84-02.05.20.12.217) zugelassen. 1. MBMEC Isolierung und Kultur HINWEIS: Isolieren MBMECs wie zuvor im Detail 14</…

Representative Results

Abbildung 1 gibt eine allgemeine Übersicht über die in vitro – Modell BBB die Wechselwirkung zwischen T – Zellen und Endothel – Zellen zu untersuchen verwendet. Das Experiment besteht aus drei Hauptschritten. Der erste Schritt ist die Isolierung von primären MBMECs aus Gehirnrinden, und ihre Kultur für fünf Tage. Wenn sie Konfluenz in der Zellkulturplatte zu erreichen, werden auf MBMECs permeablen Einsätzen trypsinisiert und reseeded, die in der TEER Instr…

Discussion

Mehrere Schritte des beschriebenen Protokolls sind unerlässlich für ein erfolgreiches Experiment. Während der anfänglichen MBMEC Isolierung und Kultur, ist es entscheidend, dass Arbeiten unter sterilen Bedingungen, so viel wie möglich durchgeführt, um die Kontamination der Zellkultur mit Pilzsporen oder Bakterien zu verhindern. Um eine reine Kultur von ECs zu erhalten, wird empfohlen , ein Medium , das Puromycin für die ersten drei Tage zu verwenden, die das Überleben von ECs ermöglicht, nicht aber andere Zellt…

Materials

cellZscope	nanoAnalytics GmbH	www.nanoanalytics.com	including: 24-well Cell Module, Controller, PC with cellZscope software v2.2.2
Ultracentrifuge	Thermo Scientific	www.thermoscientific.com	SORVALL RC 6+; rotor F21S-8x50y; for MBMEC isolation
flow cytometer	Beckman Coulter	www.beckmancoulter.com	for analysis of T cell transmigration
FlowJo7.6.5 software	Tree Star	www.flowjo.com	for analysis of T cell transmigration
Oak Ridge centrifuge tubes, PC	Thermo Fisher Scientific	3118-0050	50 ml; for MBMEC isolation
Transwell membrane inserts – pore size 0.4 µm	Corning	3470	for TEER measurement as the main readout
Transwell membrane inserts – pore size 3 µm	Corning	3472	for TEER measurement as the quality control prior to T-cell transmigration assay
24-well cell culture plate	Greiner	650 180	flat-bottom; for MBMEC culture
96-well cell culture plate	Costar	3526	round-bottom; for immune cell culture
QuadroMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-090-976	for T cell and B cell isolation; supports MACS LS columns
OctoMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-042-109	for dendritic cell isolation; supports MACS MS columns
Neubauer counting chamber	Marienfeld	MF-0640010	for cell counting
Cell strainer, 70 µm	Corning	352350	for immune cell isolation
Cell strainer, 40 µm	Corning	352340	for immune cell isolation
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303	for immune cell isolation
MACS LS separation columns	Miltenyi Biotec	130-042-401	for T cell and B cell isolation
MACS MS separation columns	Miltenyi Biotec	130-042-201	for dendritic cell isolation
Mouse CD4 MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-049-201	for CD4+ T cell isolation
Mouse CD19 MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-052-201	for B cell isolation
Mouse CD11c MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-052-001	for dendritic cell isolation
Collagen type IV from human placenta	Sigma	C5533	for MBMEC coating solution
Fibronectin from bovine plasma	Sigma	F1141-5MG	for MBMEC coating solution
Collagenase 2 (CSL2)	Worthington	LS004176	for MBMEC isolation
Collagenase/Dispase (C/D)	Roche	11097113001	for MBMEC isolation
DNase I	Sigma	DN25	for MBMEC isolation
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma	F7524	for MBMEC isolation
Bovine Serum Albumin (BSA)	Amresco	0332-100G	for MBMEC isolation
Percoll	Sigma	P1644-1L	for MBMEC isolation
DMEM (+ GlutaMAX)	Gibco	31966-021	for MBMEC isolation and MBMEC culture medium
Penicillin/Streptomycin	Sigma	P4333	for MBMEC isolation and MBMEC culture medium
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Sigma	D8537	for MBMEC and immune cell isolation
Heparin	Sigma	H3393	for MBMEC culture medium
Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)	PeproTech	100-18B	for MBMEC culture medium
Puromycin	Sigma	P8833	for MBMEC culture medium; only for the first three days
0.05% Trypsin-EDTA	Gibco	25300-054	for harvesting MBMECs
Collagenase Type IA	Sigma	C9891	for dendritic cell isolation
Trypan Blue solution, 0.4%	Thermo Fisher Scientific	15250061	for cell counting
EDTA	Sigma	E5134	for immune cell isolation
IMDM + 1% L-Glutamin	Gibco	21980-032	for T cell culture medium
X-VIVO 15	Lonza	BE04-418Q	protect from light; for B cell culture medium
β-mercaptoethanol	Gibco	31350-010	for B cell culture medium
L-Glutamine (100x Glutamax)	Gibco	35050-061	for B cell culture medium
mouse MOG35—55 peptide	Biotrend	BP0328	for antigen-specific T cell activation
purified anti-mouse CD3 Ab	BioLegend	100302	clone 145-2C11; for polyclonal T cell activation
purified NA/LE anti-mouse CD28 Ab	BD Pharmingen	553294	clone 37.51; for polyclonal T cell activation
Recombinant Murine IFN-γ	PeproTech	315-05	for T-cell transmigration assays
Recombinant Murine TNF-α	PeproTech	315-01A	for T-cell transmigration assays
NA/LE purified anti-mouse IFN-γ antibody	BD Biosciences	554408	clone XMG1.2; recommended final concentration: 20 µg/ml
Granzyme B Inhibitor II	Calbiochem	368055	recommended final concentration: 10 µM
PE anti-mouse CD4 antibody	Biolegend	116005	clone RM4-4; for analysis of T cell transmigration