Un<em> In vitro</em> Modèle de la barrière hémato-encéphalique utilisant la spectroscopie d'impédance: un regard sur T Cell-endothélial cellulaire Interaction
Summary
Here, we describe an in vitro murine model of the blood-brain barrier that makes use of impedance cell spectroscopy, with a focus on the consequences on endothelial cell integrity and permeability upon interaction with activated T cells.
Abstract
Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). This process is characterized by the transmigration of activated T cells across brain endothelial cells (ECs), the main constituents of the BBB. However, the consequences on brain EC function upon interaction with such T cells are largely unknown. Here we describe an assay that allows for the evaluation of primary mouse brain microvascular EC (MBMEC) function and barrier integrity during the interaction with T cells over time. The assay makes use of impedance cell spectroscopy, a powerful tool for studying EC monolayer integrity and permeability, by measuring changes in transendothelial electrical resistance (TEER) and cell layer capacitance (Ccl). In direct contact with ECs, stimulated but not naïve T cells are capable of inducing EC monolayer dysfunction, as visualized by a decrease in TEER and an increase in Ccl. The assay records changes in EC monolayer integrity in a continuous and automated fashion. It is sensitive enough to distinguish between different strengths of stimuli and levels of T cell activation and it enables the investigation of the consequences of a targeted modulation of T cell-EC interaction using a wide range of substances such as antibodies, pharmacological reagents and cytokines. The technique can also be used as a quality control for EC integrity in in vitro T-cell transmigration assays. These applications make it a versatile tool for studying BBB properties under physiological and pathophysiological conditions.
Introduction
La barrière hémato-encéphalique sépare la circulation systémique du système nerveux central (SNC) 1 – 3. Il fournit une barrière physique qui empêche la libre circulation des cellules et la diffusion des molécules solubles dans l'eau et protège le cerveau contre les agents pathogènes et des substances potentiellement nocives. En plus de sa fonction de barrière, la BHE permet l'apport d'oxygène et de nutriments pour le parenchyme du cerveau, ce qui assure le bon fonctionnement du tissu neuronal. Propriétés fonctionnelles du BBB sont très réglementés par ses composants cellulaires et acellulaires, avec CEs hautement spécialisé étant son principal élément structurel. CEs de la BHE sont caractérisés par la présence de jonctions serrées (TJ) de complexes, le manque de fenestrations, très faible activité pinocytaire, et les mécanismes de transport actives en permanence. D'autres composantes du BBB La membrane basale CE, péricytes enrobage de l'endothélium, astrocytaires pieds d'extrémité et = par associémembrane basale de enchymal contribuent également au développement, la maintenance et le fonctionnement du BBB 2,4 – 6 et, de concert avec les neurones et les microglies, forment l'unité neurovasculaire (NVU), qui permet le bon fonctionnement du CNS 7-9.
Dans une variété de maladies neurologiques, telles que la neuro – dégénératives, des maladies inflammatoires ou infectieuses, la fonction de la BHE est compromise 2,5,10. Dysrégulation de TJ complexes et les mécanismes de transport moléculaire entraîne une augmentation de la perméabilité BBB, leucocytaire extravasation, l'inflammation et des lésions neuronales. Afin d'étudier les propriétés BBB dans de telles conditions physiopathologiques, divers modèles in vitro de BBB ont été établies 9,11,12. Ensemble, ils ont fourni des indications précieuses sur les changements de l'intégrité de la barrière, la perméabilité ainsi que des mécanismes de transport. Ces modèles utilisent des cellules endothéliales humaines, de souris, de rat, de porc ou de borigine ovine 13 – 18; les cellules endothéliales primaires ou de lignées de cellules sont cultivées soit en monoculture ou conjointement avec les péricytes et / ou des astrocytes dans le but d'imiter plus étroitement la BHE in vivo 19-25. Ces dernières années, la mesure de la résistance électrique transendothéliale (TEER) est devenu un outil largement accepté pour évaluer les propriétés de barrière endothéliale 26,27.
TEER reflète l'impédance au flux d'ions à travers la monocouche cellulaire et sa diminution fournit une mesure sensible de l'intégrité de la barrière endotheliale compromise et par conséquent une plus grande perméabilité. Divers systèmes de mesure de TEER ont été mis au point, y compris épithéliale Voltohmmeter (EVOM), Cell-substrat électrique Impedance Sensing (ECIS), et analyse en temps réel des cellules 15,28 – 30. TEER reflète la résistance au flux d'ions entre CEs adjacentes (voie paracellulaire) et est directement proportionnelle à laintégrité de la barrière. En impédance spectroscopie 27,31, impédance totale complexe (Z) est mesurée, qui fournit des informations supplémentaires sur l'intégrité de la barrière en mesurant Ccl. Ccl se rapporte au courant capacitif à travers la membrane cellulaire (transcellulaire passage): la couche cellulaire se comporte comme un condensateur dans le circuit électrique équivalent, la séparation des charges sur les deux côtés de la membrane et est inversement proportionnelle à l'intégrité de la barrière. Lorsqu'il est cultivé sur des inserts perméables, CEs adhèrent, prolifèrent et étalée sur la membrane microporeuse. Résiste à ce courant capacitif de fond de l'insert (qui lui-même agit comme un condensateur) et conduit à une baisse de la capacité jusqu'à ce qu'elle atteigne son niveau minimal. Elle est suivie par la mise en place de TJ complexes qui joint l'espace entre CEs adjacents. Cela restreint le flux d'ions à travers la voie paracellulaire et TEER augmente jusqu'à ce qu'il atteigne son plateau. Dans des conditions inflammatoires, cependant, le endothelial barrière est compromise: TEER diminue à mesure que les complexes TJ se perturbé et Ccl augmente à mesure que la composante capacitive de l'insert augmente à nouveau.
Notre mesure TEER utilise la surveillance automatisée des cellules 32 du système: il suit le principe de la spectroscopie d'impédance et étend ses applications précédentes. Ici, nous décrivons un modèle in vitro BBB qui permet l'étude des propriétés de barrière, y compris l'interaction de l' endothélium cérébral avec les cellules immunitaires; en particulier les lymphocytes T activés. De telles conditions physiopathologiques sont observées dans les maladies auto – immunes du système nerveux central, telles que la sclérose en plaques et de son modèle animal expérimental encéphalomyélite auto – immune 33-37. Ici, une étape cruciale est la transmigration des cellules T spécifiques de la myéline encéphalitogéniques à travers la BHE. Ceci est suivi par leur réactivation dans l'espace périvasculaire et l'entrée dans le parenchyme du cerveau, où ils recrutent d'autres cellules immunitaires et mel' inflammation diate et démyélinisation ultérieure 1,35,38. Cependant, les mécanismes moléculaires de l'interaction entre les cellules T et les cellules endothéliales, les principaux constituants de la BHE, ne sont pas bien comprises. Notre protocole vise à combler cette lacune et donner de nouvelles perspectives sur les conséquences sur les cellules endothéliales ( par exemple, l' intégrité de la barrière et de perméabilité) lors de leur contact direct et interaction complexe avec les cellules T activées.
Le protocole décrit ici utilise des cellules du cerveau endothéliales microvasculaires de souris primaires, cultivées en monocouche sur des inserts perméables avec des membranes microporeuses. Les cellules endothéliales sont co-cultivées avec des cellules T CD4 +, qui peut être pré-activé soit polyclonale ou d'une manière spécifique de l' antigène. Co-culture de cellules T avec MBMECs pré-activé, mais pas naïf induit une diminution de la TEER et une augmentation de la CCl, qui fournit une mesure quantitative du dysfonctionnement et la rupture de la barrière MBMEC. La techniqueest non-invasive: il utilise intégré à la place d'électrodes de baguettes, qui empêchent perturbation majeure de la monocouche CE; il peut être utilisé pour surveiller la fonction de barrière sans l'utilisation de marqueurs cellulaires. Il effectue des mesures continues de manière automatisée et permet une évaluation indépendante des deux paramètres de barrière (TEER et Ccl) simultanément au fil du temps. Le procédé est également suffisamment sensible pour faire la distinction entre les différents niveaux d'activation des lymphocytes T et les effets de ces cellules T sur CEs.
Il peut être utilisé dans une large gamme de dosages fonctionnels: les différentes cytokines et / ou chimiokines impliquées dans les processus inflammatoires peuvent être ajoutés à la co-culture de MBMECs et les lymphocytes T; blocage des anticorps dirigés contre des molécules d'adhésion cellulaire de chaque côté de la CE, ou des cellules T peuvent être utilisées; et des inhibiteurs de marqueurs d'activation des lymphocytes T ou de leurs propriétés cytolytiques peuvent être ajoutés au cours de l'amorçage des cellules T ou de leur co-culture avec CEs. L'essai est également utile pour la transmigration des cellules Tdes essais, car il peut servir de contrôle de la qualité de l'intégrité de la monocouche MBMEC avant l'addition des cellules T. Tout cela fait de cette méthode un outil polyvalent et fiable pour étudier la BHE in vitro, avec un accent sur l'effet des lymphocytes T activés sur l' intégrité de la monocouche CE. Ceci est d'une importance particulière pour la compréhension des mécanismes de la perturbation BBB dans la pathogenèse des maladies auto-immunes, telles que MS et son modèle animal EAE, où, les cellules T encéphalitogéniques autoréactives traversent la BHE et provoquent une inflammation et des lésions neuronales.
Protocol
Representative Results
Discussion
Plusieurs étapes du protocole décrit sont essentiels pour une expérience réussie. Pendant l'isolement de MBMEC initial et de la culture, il est crucial que le travail est effectué dans des conditions stériles, autant que possible, afin d'éviter la contamination de la culture cellulaire avec des spores fongiques ou bactéries. Afin d'obtenir une culture pure de CEs, il est recommandé d'utiliser un milieu contenant Puromycin pour les trois premiers jours, ce qui permet la survie des CEs, mais pas l…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous sommes reconnaissants à Annika Engbers et Frank Kurth pour leur excellent soutien technique et Dr. Markus Schäfer (nanoAnalytics GmbH) pour des discussions utiles concernant les mesures de TEER. Ce travail a été soutenu par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), SFB1009 projet A03 HW et LK, CRC TR128, projets A08; Z1 et B01 à LK et HW, et le Centre interdisciplinaire pour la recherche clinique (Faculté de médecine de Münster) numéro de subvention Kl2 / 2015/14 à LK.
Materials
| cellZscope | nanoAnalytics GmbH | www.nanoanalytics.com | including: 24-well Cell Module, Controller, PC with cellZscope software v2.2.2 |
| Ultracentrifuge | Thermo Scientific | www.thermoscientific.com | SORVALL RC 6+; rotor F21S-8x50y; for MBMEC isolation |
| flow cytometer | Beckman Coulter | www.beckmancoulter.com | for analysis of T cell transmigration |
| FlowJo7.6.5 software | Tree Star | www.flowjo.com | for analysis of T cell transmigration |
| Oak Ridge centrifuge tubes, PC | Thermo Fisher Scientific | 3118-0050 | 50 ml; for MBMEC isolation |
| Transwell membrane inserts – pore size 0.4 µm | Corning | 3470 | for TEER measurement as the main readout |
| Transwell membrane inserts – pore size 3 µm | Corning | 3472 | for TEER measurement as the quality control prior to T-cell transmigration assay |
| 24-well cell culture plate | Greiner | 650 180 | flat-bottom; for MBMEC culture |
| 96-well cell culture plate | Costar | 3526 | round-bottom; for immune cell culture |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | for T cell and B cell isolation; supports MACS LS columns |
| OctoMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | for dendritic cell isolation; supports MACS MS columns |
| Neubauer counting chamber | Marienfeld | MF-0640010 | for cell counting |
| Cell strainer, 70 µm | Corning | 352350 | for immune cell isolation |
| Cell strainer, 40 µm | Corning | 352340 | for immune cell isolation |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | for immune cell isolation |
| MACS LS separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | for T cell and B cell isolation |
| MACS MS separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | for dendritic cell isolation |
| Mouse CD4 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-049-201 | for CD4+ T cell isolation |
| Mouse CD19 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-052-201 | for B cell isolation |
| Mouse CD11c MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-052-001 | for dendritic cell isolation |
| Collagen type IV from human placenta | Sigma | C5533 | for MBMEC coating solution |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma | F1141-5MG | for MBMEC coating solution |
| Collagenase 2 (CSL2) | Worthington | LS004176 | for MBMEC isolation |
| Collagenase/Dispase (C/D) | Roche | 11097113001 | for MBMEC isolation |
| DNase I | Sigma | DN25 | for MBMEC isolation |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F7524 | for MBMEC isolation |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Amresco | 0332-100G | for MBMEC isolation |
| Percoll | Sigma | P1644-1L | for MBMEC isolation |
| DMEM (+ GlutaMAX) | Gibco | 31966-021 | for MBMEC isolation and MBMEC culture medium |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P4333 | for MBMEC isolation and MBMEC culture medium |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Sigma | D8537 | for MBMEC and immune cell isolation |
| Heparin | Sigma | H3393 | for MBMEC culture medium |
| Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | PeproTech | 100-18B | for MBMEC culture medium |
| Puromycin | Sigma | P8833 | for MBMEC culture medium; only for the first three days |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | for harvesting MBMECs |
| Collagenase Type IA | Sigma | C9891 | for dendritic cell isolation |
| Trypan Blue solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | for cell counting |
| EDTA | Sigma | E5134 | for immune cell isolation |
| IMDM + 1% L-Glutamin | Gibco | 21980-032 | for T cell culture medium |
| X-VIVO 15 | Lonza | BE04-418Q | protect from light; for B cell culture medium |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | for B cell culture medium |
| L-Glutamine (100x Glutamax) | Gibco | 35050-061 | for B cell culture medium |
| mouse MOG35—55 peptide | Biotrend | BP0328 | for antigen-specific T cell activation |
| purified anti-mouse CD3 Ab | BioLegend | 100302 | clone 145-2C11; for polyclonal T cell activation |
| purified NA/LE anti-mouse CD28 Ab | BD Pharmingen | 553294 | clone 37.51; for polyclonal T cell activation |
| Recombinant Murine IFN-γ | PeproTech | 315-05 | for T-cell transmigration assays |
| Recombinant Murine TNF-α | PeproTech | 315-01A | for T-cell transmigration assays |
| NA/LE purified anti-mouse IFN-γ antibody | BD Biosciences | 554408 | clone XMG1.2; recommended final concentration: 20 µg/ml |
| Granzyme B Inhibitor II | Calbiochem | 368055 | recommended final concentration: 10 µM |
| PE anti-mouse CD4 antibody | Biolegend | 116005 | clone RM4-4; for analysis of T cell transmigration |
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