A<em> In Vitro</em> Modelo da barreira sangue-cérebro que usa espectroscopia de impedância: Um foco na interação celular T Cell-endotelial

Summary

Here, we describe an in vitro murine model of the blood-brain barrier that makes use of impedance cell spectroscopy, with a focus on the consequences on endothelial cell integrity and permeability upon interaction with activated T cells.

Abstract

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). This process is characterized by the transmigration of activated T cells across brain endothelial cells (ECs), the main constituents of the BBB. However, the consequences on brain EC function upon interaction with such T cells are largely unknown. Here we describe an assay that allows for the evaluation of primary mouse brain microvascular EC (MBMEC) function and barrier integrity during the interaction with T cells over time. The assay makes use of impedance cell spectroscopy, a powerful tool for studying EC monolayer integrity and permeability, by measuring changes in transendothelial electrical resistance (TEER) and cell layer capacitance (Ccl). In direct contact with ECs, stimulated but not naïve T cells are capable of inducing EC monolayer dysfunction, as visualized by a decrease in TEER and an increase in Ccl. The assay records changes in EC monolayer integrity in a continuous and automated fashion. It is sensitive enough to distinguish between different strengths of stimuli and levels of T cell activation and it enables the investigation of the consequences of a targeted modulation of T cell-EC interaction using a wide range of substances such as antibodies, pharmacological reagents and cytokines. The technique can also be used as a quality control for EC integrity in in vitro T-cell transmigration assays. These applications make it a versatile tool for studying BBB properties under physiological and pathophysiological conditions.

Introduction

A barreira sangue-cérebro separa a circulação sistémica a partir do sistema nervoso central (SNC) ^1-3. Ele fornece uma barreira física que inibe a livre circulação das células e à difusão de moléculas solúveis em água e protege o cérebro de agentes patogênicos e substâncias potencialmente nocivas. Para além da sua função de barreira, o BBB permite o fornecimento de oxigénio e nutrientes para o parênquima cerebral, o que assegura o bom funcionamento do tecido neuronal. As propriedades funcionais da certificação são altamente regulados pelos seus componentes celulares e acelulares, com ECs altamente especializada sendo o seu principal elemento estrutural. CEs da certificação são caracterizados pela presença de junção estanque (TJ) complexos, falta de fenestrações, extremamente baixa actividade pinocytic, e mecanismos de transporte permanentemente activas. Outros componentes da certificação da membrana basal CE, pericitos incorporação do endotélio, pés terminais astrocíticos e = par associadomembrana basal enchymal também contribuir para o desenvolvimento, manutenção e função da BHE ^{2,4 – 6} e, em conjunto com os neurónios e microglia, formam a unidade neurovascular (NVU), que permite o bom funcionamento do SNC ^7-9.

Numa variedade de doenças neurológicas, tais como neurodegenerativas, doenças inflamatórias ou infecciosas, a função da BHE está comprometida ^2,5,10. A desregulação de TJ e complexos mecanismos de transporte moleculares leva ao aumento da permeabilidade a certificação, o extravasamento de leucócitos, a inflamação e dano neuronal. A fim de estudar as propriedades de BBB sob tais condições fisiopatológicas, vários modelos in vitro da BBB foram estabelecidas ^9,11,12. Juntos, eles têm fornecido informações valiosas sobre as mudanças da integridade da barreira, a permeabilidade, bem como mecanismos de transporte. Estes modelos utilizam células endoteliais de origem humana, de ratinho, rato, porcino ou bovina ^13-18; células endoteliais primárias ou linhas celulares são cultivadas quer como uma monocultura ou em conjunto com os pericitos e / ou astrócitos para imitar mais de perto a certificação in vivo ^19-25. Nos últimos anos, a medição da resistência eléctrica transendotelial (TEER) tornou-se uma ferramenta amplamente aceito para avaliar as propriedades de barreira endotelial ^26,27.

TEER reflecte a impedância ao fluxo de iões através da monocamada de células e a sua redução proporciona uma medida sensível da integridade da barreira endotelial comprometida e, por conseguinte, aumento da permeabilidade. Vários sistemas de medição TEER têm sido desenvolvidos, incluindo epitelial Voltohmmeter (Evom), Cell-substrato Eléctrica Impedância de detecção (ECIS), e análise de células em tempo real ^{15,28 – 30.} TEER reflecte a resistência ao fluxo de iões entre CEs adjacentes (via paracelular) e é directamente proporcional àa integridade da barreira. Em espectroscopia de impedância ^27,31, impedância total complexo de (Z) é medida, que fornece informações adicionais sobre a integridade da barreira medindo Ccl. Ccl relaciona-se com a corrente capacitiva através da membrana celular (via transcelular): a camada de células actua como um condensador no circuito eléctrico equivalente, que separa as cargas em ambos os lados da membrana e é inversamente proporcional à integridade da barreira. Quando cultivadas em inserções permeáveis, ECs aderir, proliferar e espalhar sobre a membrana microporosa. Isto resiste a corrente capacitiva fundo da inserção (que por sua vez actua como um condensador) e leva a uma diminuição na capacitância até que atinge o seu nível mínimo. Isso é seguido pelo estabelecimento de TJ complexos que vedar o espaço entre as células endoteliais adjacentes. Isso restringe o fluxo de iões através da via paracelular, e TEER aumenta até atingir o planalto. Sob condições inflamatórias, no entanto, o endotheliai barreira está comprometida: TEER diminui à medida que TJ complexos são interrompidos e Ccl aumenta à medida que o componente capacitivo da inserção sobe novamente.

Nossa medição TEER usa o sistema automatizado de monitorização das células ^32: segue-se o princípio da espectroscopia de impedância e estende suas aplicações anteriores. Aqui, nós descrevemos um modelo in vitro a certificação que permite o estudo das propriedades de barreira, incluindo a interacção de endotélio cerebral com células do sistema imune; em particular células T activadas. Tais condições fisiopatológicas são observadas em doenças auto-imunes do sistema nervoso central, tais como a esclerose múltipla e o seu modelo animal experimental de encefalomielite auto-imune ^33-37. Aqui, um passo crucial é a transmigração de células T encefalitogénicas, específicos de mielina em todo o BBB. Isto é seguido pela sua reactivação no espaço perivascular e entrada dentro do parênquima do cérebro, onde se recrutar outras células do sistema imunológico e meinflamação diate e subsequente desmielinização ^1,35,38. No entanto, os mecanismos moleculares da interacção entre estas células T e as células endoteliais, os principais constituintes da BBB, não são bem compreendidos. Nosso protocolo visa preencher esta lacuna e dar novos insights sobre as consequências sobre as células endoteliais (ou seja, a integridade da barreira e permeabilidade) mediante o seu contacto directo e complexa interação com as células T ativadas.

O protocolo aqui descrito faz uso de células endoteliais microvasculares cerebrais de rato primária, cultivadas como uma monocamada em inserções permeáveis ​​com membranas microporosas. As células endoteliais são co-cultivadas com células T CD4 ^+, que podem ser pré-activados quer policlonal ou de um modo específico do antigénio. Co-cultura de células T com MBMECs pré-activado, mas não ingénuos induz uma diminuição da TEER e um aumento em CCL, a qual fornece uma medida quantitativa da disfunção e barreira perturbação MBMEC. a técnicaé não-invasivo: ele usa built-in em vez de eletrodos pauzinho, que impedem a grande perturbação da monocamada CE; ele pode ser utilizado para monitorizar a função de barreira, sem a utilização de marcadores de células. Faz medições contínuas em uma forma automatizada e permite uma avaliação independente dos dois parâmetros de barreira (TEER e CCL), simultaneamente, ao longo do tempo. O método também é suficientemente sensível para distinguir entre diferentes níveis de activação de células T e os efeitos de tais células T na ECS.

Ele pode ser usado numa grande variedade de ensaios funcionais diferentes: as citocinas e / ou quimiocinas implicados em processos inflamatórios podem ser adicionadas à co-cultura de células T e MBMECs; anticorpos bloqueadores contra moléculas de adesão celular em ambos o lado CE ou de células T pode ser utilizado; e inibidores de marcadores de activação das células T ou de suas propriedades citolíticas pode ser adicionado durante a iniciação de células T ou a sua co-cultura com células endoteliais. O ensaio é também útil para a transmigração de células Tensaios, uma vez que pode servir como um controlo da integridade monocamada MBMEC antes da adição de células T qualidade. Tudo isto torna este método uma ferramenta versátil e fiável para estudar a certificação in vitro, com um foco no efeito de células T activadas na integridade monocamada CE. Isto é de particular importância para a compreensão dos mecanismos de certificação da interrupção na patogénese de doenças auto-imunes, como a esclerose múltipla e o seu modelo animal de EAE, em que, as células T auto-reactivas encefalitogénicas atravessar a BHE e causar inflamação e dano neuronal.

Protocol

Para todas as experiências, os ratinhos foram criados e mantidos sob condições específicas isentas de agentes patogénicos em instalações para animais Central da Universidade de Munster, de acordo com as directrizes alemães para cuidados animais. Todos os experimentos foram realizados de acordo com as orientações do comitê de animais ética experimental e aprovado pelas autoridades locais de North Rhine-Westphalia, Alemanha (LANUV, AZ 84-02.05.20.12.217). 1. MBMEC Isolamento e Cultura NOTA: Isola…

Representative Results

A Figura 1 fornece uma visão geral do modelo de certificação in vitro utilizado para estudar a interação entre células T e células endoteliais. O experimento consiste em três etapas principais. O primeiro passo é o isolamento de MBMECs primárias a partir de córtices cerebrais, e a sua cultura durante cinco dias. Quando atingem confluência na placa de cultura celular, MBMECs são tripsinizadas e re-semeadas em inserções permeáveis, os quais são, e…

Discussion

Vários passos do protocolo descrito são essenciais para uma experiência de sucesso. Durante o isolamento e cultura MBMEC inicial, é crucial que o trabalho é executado sob condições estéreis, tanto quanto possível, para evitar a contaminação da cultura de células com esporos de fungos ou bactérias. A fim de se obter uma cultura pura de células endoteliais, é recomendado o uso de um meio contendo puromicina para os três primeiros dias, o que permite que a sobrevivência das células endoteliais, mas não o…

Materials

cellZscope	nanoAnalytics GmbH	www.nanoanalytics.com	including: 24-well Cell Module, Controller, PC with cellZscope software v2.2.2
Ultracentrifuge	Thermo Scientific	www.thermoscientific.com	SORVALL RC 6+; rotor F21S-8x50y; for MBMEC isolation
flow cytometer	Beckman Coulter	www.beckmancoulter.com	for analysis of T cell transmigration
FlowJo7.6.5 software	Tree Star	www.flowjo.com	for analysis of T cell transmigration
Oak Ridge centrifuge tubes, PC	Thermo Fisher Scientific	3118-0050	50 ml; for MBMEC isolation
Transwell membrane inserts – pore size 0.4 µm	Corning	3470	for TEER measurement as the main readout
Transwell membrane inserts – pore size 3 µm	Corning	3472	for TEER measurement as the quality control prior to T-cell transmigration assay
24-well cell culture plate	Greiner	650 180	flat-bottom; for MBMEC culture
96-well cell culture plate	Costar	3526	round-bottom; for immune cell culture
QuadroMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-090-976	for T cell and B cell isolation; supports MACS LS columns
OctoMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-042-109	for dendritic cell isolation; supports MACS MS columns
Neubauer counting chamber	Marienfeld	MF-0640010	for cell counting
Cell strainer, 70 µm	Corning	352350	for immune cell isolation
Cell strainer, 40 µm	Corning	352340	for immune cell isolation
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303	for immune cell isolation
MACS LS separation columns	Miltenyi Biotec	130-042-401	for T cell and B cell isolation
MACS MS separation columns	Miltenyi Biotec	130-042-201	for dendritic cell isolation
Mouse CD4 MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-049-201	for CD4+ T cell isolation
Mouse CD19 MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-052-201	for B cell isolation
Mouse CD11c MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-052-001	for dendritic cell isolation
Collagen type IV from human placenta	Sigma	C5533	for MBMEC coating solution
Fibronectin from bovine plasma	Sigma	F1141-5MG	for MBMEC coating solution
Collagenase 2 (CSL2)	Worthington	LS004176	for MBMEC isolation
Collagenase/Dispase (C/D)	Roche	11097113001	for MBMEC isolation
DNase I	Sigma	DN25	for MBMEC isolation
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma	F7524	for MBMEC isolation
Bovine Serum Albumin (BSA)	Amresco	0332-100G	for MBMEC isolation
Percoll	Sigma	P1644-1L	for MBMEC isolation
DMEM (+ GlutaMAX)	Gibco	31966-021	for MBMEC isolation and MBMEC culture medium
Penicillin/Streptomycin	Sigma	P4333	for MBMEC isolation and MBMEC culture medium
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Sigma	D8537	for MBMEC and immune cell isolation
Heparin	Sigma	H3393	for MBMEC culture medium
Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)	PeproTech	100-18B	for MBMEC culture medium
Puromycin	Sigma	P8833	for MBMEC culture medium; only for the first three days
0.05% Trypsin-EDTA	Gibco	25300-054	for harvesting MBMECs
Collagenase Type IA	Sigma	C9891	for dendritic cell isolation
Trypan Blue solution, 0.4%	Thermo Fisher Scientific	15250061	for cell counting
EDTA	Sigma	E5134	for immune cell isolation
IMDM + 1% L-Glutamin	Gibco	21980-032	for T cell culture medium
X-VIVO 15	Lonza	BE04-418Q	protect from light; for B cell culture medium
β-mercaptoethanol	Gibco	31350-010	for B cell culture medium
L-Glutamine (100x Glutamax)	Gibco	35050-061	for B cell culture medium
mouse MOG35—55 peptide	Biotrend	BP0328	for antigen-specific T cell activation
purified anti-mouse CD3 Ab	BioLegend	100302	clone 145-2C11; for polyclonal T cell activation
purified NA/LE anti-mouse CD28 Ab	BD Pharmingen	553294	clone 37.51; for polyclonal T cell activation
Recombinant Murine IFN-γ	PeproTech	315-05	for T-cell transmigration assays
Recombinant Murine TNF-α	PeproTech	315-01A	for T-cell transmigration assays
NA/LE purified anti-mouse IFN-γ antibody	BD Biosciences	554408	clone XMG1.2; recommended final concentration: 20 µg/ml
Granzyme B Inhibitor II	Calbiochem	368055	recommended final concentration: 10 µM
PE anti-mouse CD4 antibody	Biolegend	116005	clone RM4-4; for analysis of T cell transmigration