Sintesi e caratterizzazione di un profarmaco Aspirina-fumarato che inibisce NFκB attività e della mammella cellule tumorali staminali
Summary
This procedure will demonstrate how we synthesized and characterized the anti-NFκB and anti-cancer stem cell activity of an aspirin-fumarate prodrug.
Abstract
L'infiammazione è un segno distintivo di cancro che sta alla base l'incidenza del cancro e la promozione, e la progressione alla fine di metastasi. Pertanto, l'aggiunta di un farmaco anti-infiammatorio per reggimenti standard per il cancro può migliorare l'esito dei pazienti. Uno di questi farmaci, l'aspirina (acido acetilsalicilico, ASA), è stato esplorato per la chemioprevenzione del cancro e l'attività anti-tumorale. Oltre inibendo la ciclossigenasi asse 2-prostaglandine, le attività anti-cancro di ASA sono anche stati attribuiti a fattore nucleare ĸB (NFĸB) inibizione. Poiché l'uso ASA prolungato può causare tossicità gastrointestinale, una strategia profarmaco è stata implementata con successo. In questo profarmaco progettare l'acido carbossilico di ASA viene mascherato e pharmacophores aggiuntivi sono incorporati.
Questo protocollo descrive come abbiamo sintetizzato un profarmaco aspirina-fumarato, GTCpFE, e caratterizzato la sua inibizione del percorso NFĸB nelle cellule di cancro al seno e attenuazione del cancro stelo-come correttacravatte, un importante fenotipo NFĸB-dipendente. GTCpFE inibisce in modo efficace il percorso NFĸB nelle linee di cellule di cancro al seno, mentre ASA è priva di qualsiasi attività inibitoria, che indica che l'aggiunta di fumarato alla struttura ASA contribuisce in modo significativo alla sua attività. Inoltre, GTCpFE mostra significativa l'attività delle cellule staminali anti-cancro, bloccando la formazione di mammosphere e attenuando la associati CD44 delle cellule staminali del cancro + CD24 – immunofenotipo. Questi risultati stabiliscono una strategia praticabile per sviluppare farmaci anti-infiammatori migliorate per la chemioprevenzione e terapia del cancro.
Introduction
L'infiammazione è una caratteristica che sta alla base molteplici aspetti della tumorigenesi, come ad esempio l'incidenza e la promozione, e la progressione alla fine di metastasi 1. Nel carcinoma mammario, questo è ulteriormente supportata da osservazioni epidemiologiche mostrano che l'uso regolare della classica aspirina farmaci non steroidei anti-infiammatori (acido acetilsalicilico, ASA) è associato ad una riduzione sia del seno incidenza del cancro, e il rischio di metastasi e recidive 2,3. ASA agisce principalmente inibendo l'attività della cicloossigenasi-2, che è spesso upregulated nel cancro della mammella 4,5. Tuttavia, gli effetti anti-cancro di ASA possono essere mediati da sopprimere aberrante fattore nucleare kB (NFκB) di segnalazione 6-8. Questo è importante perché un percorso NFκB deregolamentato promuove la sopravvivenza delle cellule tumorali, la proliferazione, la migrazione, l'invasione, angiogenesi, e la resistenza alla terapia 9-11. attivazione della via NFκB è essenziale anche per il montaggiouna risposta immunitaria. Pertanto, per la terapia anti-cancro in cui è richiesta l'inibizione NFκB prolungato, si deve considerare gli effetti collaterali negativi coinvolgono duratura soppressione immunitaria. Quindi, ASA può servire come un buon punto di partenza per l'ottimizzazione terapeutica.
Una limitazione per l'applicazione ASA nella terapia del cancro è dosi elevate richieste per cicloossigenasi 2 e l'inibizione NFκB, che sono associati con la tossicità gastrointestinale, come ulcere e sanguinamento dello stomaco 12,13. Tuttavia, la conversione in ASA profarmaco come estere, può ridurre la tossicità gastrointestinale di ASA. Per migliorare ulteriormente la potenza e / o aggiungere funzionalità, elementi strutturali aggiuntive o pharmacophores accessori possono altresì essere incorporati nella progettazione estere profarmaco. Uno di questi farmacoforico aggiunto per migliorare la potenza ASA contro il percorso NFκB è fumarato, che abbiamo già dimostrato di essere importante per NFκB via inibizione 14,15.
<p class="jove_content"> Abbiamo sintetizzato un profarmaco aspirina-fumarato 15, GTCpFE, e ipotizzato che tale molecola ibrida sarebbe stato al sicuro ancora potente contro il percorso NFκB. Abbiamo testato la sua attività anti-NFκB nelle cellule di cancro al seno e la sua capacità di bloccare le cellule staminali del cancro al seno (CSC) 15, che si basano su NFκB segnalazione per la sopravvivenza e la crescita 16-21. Troviamo che la potenza del GTCpFE contro il percorso NFκB è notevolmente migliorata nel corso ASA 15. Inoltre, blocca la formazione GTCpFE mammosphere e attenua il CSC marcatore di superficie CD44 + CD24 – immunofenotipo, indicando che GTCpFE è in grado di sradicare CSC 15. Questi risultati stabiliscono il profarmaco aspirina-fumarato come agente anti-infiammatorio efficace che può anche riguardare CSC seno. In termini di terapia del cancro al seno, GTCpFE potrebbe avere il potenziale per il trattamento di malattia aggressiva e letale.Protocol
Representative Results
Discussion
In this protocol, we demonstrated the synthesis of an ASA prodrug, GTCpFE, where the fumarate pharmacophore was incorporated to improve the anti-NFĸB activity in breast cancer cells. GTCpFE is an effective NFĸB inhibitor, whereas ASA itself is not, even at much higher concentrations. The fumarate moiety has anti-inflammatory properties as shown by its ability to inhibit NFĸB signaling in a variety of cell lines and tissues14,25-29. The prodrug strategy described herein, is amendable to other mal…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants provided by the National Institutes of Health (NIH), R01 CA200669 to JF and R01 CA121107 to GRJT, and by a postdoctoral fellowship grant from Susan G. Komen for the Cure to IK (PDF12229484).
Materials
| RPMI 1640 Red Medium | Life Technologies | 11875-093 | Warm up to 37°C before use |
| IMEM | Corning | 10-024-CV | Warm up to 37°C before use |
| DMEM / F12 Medium | ThermoFisher | 21041-025 | Warm up to 37°C before use |
| MEM NEAA 10mM 100X | Life Technologies | 11140 | |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| L-Glutamine 100X | Life Technologies | 25030-081 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I-1882 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Trypsin 2.5% 10X | Invitrogen | 15090046 | |
| Methyl Cellulose | Sigma | M0262 | |
| B27 Supplement 50X | Gibco | 17504-044 | |
| EGF | Gibco | PHG0311L | |
| NFκB-RE Luciferase Construct | Clontech | pGL4.32 | |
| Renilla Luciferase Construct | Promega | pGL4.70 | |
| Lipofectamine 2000 | ThermoFisher | 11668-019 | |
| Dual-Luciferase Reporter Assay | Promega | 120000032 | |
| NanoDrop Spectrophotometer | ThermoFisher | ||
| Eppendorf Mastercycler | Eppendorf | ||
| StepOne Real Time PCR System | Thermo Scientific | ||
| Eclipse Microscope | Nikon | ||
| CyAn ADP Analyzer | Beckman Coulter | ||
| QCapture Software | QImaging | ||
| Summit Software | Beckman Coulter | ||
| GraphPad Software | Prism | ||
| TRIzol | ThermoFisher | 15596-018 | |
| M-MLV Reverse Transcriptase | Invitrogen | 28025-013 | |
| 100 mM dNTP Set | Invitrogen | 10297-018 | |
| Random Hexamers | Invitrogen | 48190-011 | |
| Fast SYBR Green Master Mix | ThermoFisher | 4385612 | |
| Costar 96W, ultra low attachment | Corning | 3474 | |
| HBSS, 1X | ThermoFisher | 14025134 | |
| CD44-APC conjugated antibody | BD Pharmingen | 560990 | Store at 4°C, protect from light |
| CD24-PE antibody | BD Pharmingen | 560991 | Store at 4°C, protect from light |
| Recombinant Human TNFα | Fisher | 210TA100 | |
| CCL2 Primer Forward Sequence | AGAATCACCAGCAGCAAGTGTCC | ||
| CCL2 Primer Reverse Sequence | TCCTGAACCCACTTCTGCTTGG | ||
| ICAM1 Primer Reverse Sequence | TGACGAAGCCAGAGGTCTCAG | ||
| ICAM1 Primer Forward Sequence | AGCGTCACCTTGGCTCTAGG | ||
| TNF Primer Forward Sequence | AAGGGTGACCGACTCAGCG | ||
| TNF Primer Reverse Sequence | ATCCCAAAGTAGACCTGCCCA | ||
| 36B4 Primer Forward Sequence | GTGTTCGACAATGGCAGCAT | ||
| 36B4 Primer Reverse Sequence | GACACCCTCCAGGAAGCGA | ||
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881-500G | |
| 4-Hydroxybenzyl Alcohol | Sigma-Aldrich | 20806-10G | |
| O-Acetylsalicyloyl Chloride | Sigma-Aldrich | 165190-5G | |
| Phosphorous Pentoxide | Sigma-Aldrich | 79610-100G | |
| Ethyl Fumaroyl Chloride | Sigma-Aldrich | 669695-1G | |
| Sodium Sulfate | Sigma-Aldrich | 246980-500G | |
| 4-Dimethylaminopyridine | Sigma-Aldrich | 714844-100ML | 0.5 M in tetrahydrofuran |
| Triethylamine | Sigma-Aldrich | T0886-100ML | |
| Toluene | Sigma-Aldrich | 244511-100ML | |
| Ethyl Acetate | Sigma-Aldrich | 270989-100ML | |
| Tetrahydrofuran | Sigma-Aldrich | 401757-2L | |
| 400 MHz FT NMR spectrometer | See Bruker’s Avance User’s Manual, version 000822 for details |
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