Синтез и характеристика аспирином-фумарата пролекарственного соединения, которое угнетает NFκB активность и рак молочной железы стволовых клеток
Summary
This procedure will demonstrate how we synthesized and characterized the anti-NFκB and anti-cancer stem cell activity of an aspirin-fumarate prodrug.
Abstract
Воспаление является отличительным признаком рака, который лежит в основе заболеваемости раком и продвижение по службе, и в конце концов прогрессии к метастазированию. Таким образом, добавление противовоспалительное лекарственное средство в стандартных полках рака может улучшить исход пациента. Одним из таких лекарств, аспирин (ацетилсалициловая кислота, АСК), была изучена для химиопрофилактики рака и противоопухолевой активностью. Кроме ингибирования циклооксигеназы 2-простагландина ось, деятельность противораковые ASA, также были отнесены к ĸB ингибирования ядерного фактора (NFĸB). Поскольку длительное применение АСК может вызвать желудочно-кишечной токсичности, стратегия пролекарством была успешно реализована. В этом пролекарством дизайн карбоновую кислоту ASA маскируется и дополнительные фармакофоров включены.
Этот протокол описывает, как мы синтезировал аспирин-фумарат пролекарство, GTCpFE, и характеризуется его ингибирование пути NFĸB в клетках рака молочной железы и ослабление рака стебля, как собственносвязи, важным NFĸB-зависимый фенотип. GTCpFE эффективно ингибирует путь NFĸB в линии клеток рака молочной железы, тогда как АСА отсутствует какой-либо ингибирующей активностью, что указывает, что добавление фумарат в структуре ASA в значительной степени способствует его активности. Кроме того, GTCpFE показывает значительную активность стволовых клеток противораковое, блокируя образование mammosphere и ослабляя раковых стволовых клеток , связанный CD44 + CD24 – иммунофенотип. Эти результаты создать жизнеспособную стратегию разработки усовершенствованных противовоспалительных препаратов для химиопрофилактики и терапии рака.
Introduction
Воспаление является отличительной чертой , которая лежит в основе множества аспектов онкогенеза, таких как падения и продвижения по службе, и в конечном счете к прогрессии метастаза 1. При раке молочной железы, это подтверждается также эпидемиологических наблюдений, показывающих, что регулярное использование классического нестероидные противовоспалительные аспирин наркотиков (ацетилсалициловая кислота, АСК) связано со снижением как молочной заболеваемости раком, и риск развития метастазов и рецидивов 2,3. АСК действует главным образом путем ингибирования циклооксигеназы-2 активности, которая часто активируемых при раке молочной железы 4,5. Тем не менее, противораковые эффекты АСК также может быть опосредована путем подавления аберрантную ядерного фактора (NFκB кВ) сигнализации 6-8. Это важно , поскольку нерегулируемом NFκB путь способствует выживанию опухолевых клеток, пролиферацию, миграцию, инвазию, ангиогенез и устойчивость к терапии 9-11. NFκB активация пути также имеет важное значение для монтажаиммунный ответ. Поэтому для противораковой терапии, где требуется длительное ингибирование NFκB, необходимо учитывать вредные побочные эффекты, связанные с продолжительную подавление иммунитета. Следовательно, ASA может служить хорошей отправной точкой для терапевтической оптимизации.
Одним из ограничений для применения АСК в терапии рака является повышенные дозы , необходимые для циклооксигеназы 2 и ингибирование NFκB, которые связаны с желудочно – кишечной токсичности, такие как язвы и кровотечение желудка 12,13. Тем не менее, превращение АСК в качестве эфира пролекарством, может привести к снижению желудочно-кишечной токсичности Асы. Для дальнейшего повышения потенции и / или добавлять функциональные возможности, дополнительные конструктивные элементы или вспомогательные фармакофоров также могут быть включены в конструкции эфир пролекарства. Одним из таких Фармакофор добавлены для повышения потенции ASA против пути NFκB является фумарат, который мы ранее показали, что важно для NFκB затрагивающего пути торможения 14,15.
<p class="jove_content"> Мы синтезировали аспирин-фумарат пролекарство 15, GTCpFE, и предположили , что такая гибридная молекула будет безопасным но мощным против пути NFκB. Мы протестировали его анти-NFκB активность в клетках рака молочной железы и его способность блокировать стволовые клетки рака молочной железы (ОКК) 15, которые полагаются на сигнализацию NFκB для выживания и роста 16-21. Мы находим , что потенция GTCpFE против пути NFκB значительно улучшилось по сравнению ASA 15. Кроме того, блоки GTCpFE mammosphere формирование и ослабляется CSC поверхностный маркер CD44 + CD24 – иммунофенотип, указывая , что GTCpFE способна искоренить CSCs 15. Эти результаты устанавливают аспирин-фумарат пролекарство в качестве эффективного противовоспалительного агента, который также может предназначаться груди CSCs. С точки зрения терапии рака молочной железы, GTCpFE может иметь потенциал для лечения агрессивного и смертельной болезнью.Protocol
Representative Results
Discussion
In this protocol, we demonstrated the synthesis of an ASA prodrug, GTCpFE, where the fumarate pharmacophore was incorporated to improve the anti-NFĸB activity in breast cancer cells. GTCpFE is an effective NFĸB inhibitor, whereas ASA itself is not, even at much higher concentrations. The fumarate moiety has anti-inflammatory properties as shown by its ability to inhibit NFĸB signaling in a variety of cell lines and tissues14,25-29. The prodrug strategy described herein, is amendable to other mal…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants provided by the National Institutes of Health (NIH), R01 CA200669 to JF and R01 CA121107 to GRJT, and by a postdoctoral fellowship grant from Susan G. Komen for the Cure to IK (PDF12229484).
Materials
| RPMI 1640 Red Medium | Life Technologies | 11875-093 | Warm up to 37°C before use |
| IMEM | Corning | 10-024-CV | Warm up to 37°C before use |
| DMEM / F12 Medium | ThermoFisher | 21041-025 | Warm up to 37°C before use |
| MEM NEAA 10mM 100X | Life Technologies | 11140 | |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| L-Glutamine 100X | Life Technologies | 25030-081 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I-1882 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Trypsin 2.5% 10X | Invitrogen | 15090046 | |
| Methyl Cellulose | Sigma | M0262 | |
| B27 Supplement 50X | Gibco | 17504-044 | |
| EGF | Gibco | PHG0311L | |
| NFκB-RE Luciferase Construct | Clontech | pGL4.32 | |
| Renilla Luciferase Construct | Promega | pGL4.70 | |
| Lipofectamine 2000 | ThermoFisher | 11668-019 | |
| Dual-Luciferase Reporter Assay | Promega | 120000032 | |
| NanoDrop Spectrophotometer | ThermoFisher | ||
| Eppendorf Mastercycler | Eppendorf | ||
| StepOne Real Time PCR System | Thermo Scientific | ||
| Eclipse Microscope | Nikon | ||
| CyAn ADP Analyzer | Beckman Coulter | ||
| QCapture Software | QImaging | ||
| Summit Software | Beckman Coulter | ||
| GraphPad Software | Prism | ||
| TRIzol | ThermoFisher | 15596-018 | |
| M-MLV Reverse Transcriptase | Invitrogen | 28025-013 | |
| 100 mM dNTP Set | Invitrogen | 10297-018 | |
| Random Hexamers | Invitrogen | 48190-011 | |
| Fast SYBR Green Master Mix | ThermoFisher | 4385612 | |
| Costar 96W, ultra low attachment | Corning | 3474 | |
| HBSS, 1X | ThermoFisher | 14025134 | |
| CD44-APC conjugated antibody | BD Pharmingen | 560990 | Store at 4°C, protect from light |
| CD24-PE antibody | BD Pharmingen | 560991 | Store at 4°C, protect from light |
| Recombinant Human TNFα | Fisher | 210TA100 | |
| CCL2 Primer Forward Sequence | AGAATCACCAGCAGCAAGTGTCC | ||
| CCL2 Primer Reverse Sequence | TCCTGAACCCACTTCTGCTTGG | ||
| ICAM1 Primer Reverse Sequence | TGACGAAGCCAGAGGTCTCAG | ||
| ICAM1 Primer Forward Sequence | AGCGTCACCTTGGCTCTAGG | ||
| TNF Primer Forward Sequence | AAGGGTGACCGACTCAGCG | ||
| TNF Primer Reverse Sequence | ATCCCAAAGTAGACCTGCCCA | ||
| 36B4 Primer Forward Sequence | GTGTTCGACAATGGCAGCAT | ||
| 36B4 Primer Reverse Sequence | GACACCCTCCAGGAAGCGA | ||
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881-500G | |
| 4-Hydroxybenzyl Alcohol | Sigma-Aldrich | 20806-10G | |
| O-Acetylsalicyloyl Chloride | Sigma-Aldrich | 165190-5G | |
| Phosphorous Pentoxide | Sigma-Aldrich | 79610-100G | |
| Ethyl Fumaroyl Chloride | Sigma-Aldrich | 669695-1G | |
| Sodium Sulfate | Sigma-Aldrich | 246980-500G | |
| 4-Dimethylaminopyridine | Sigma-Aldrich | 714844-100ML | 0.5 M in tetrahydrofuran |
| Triethylamine | Sigma-Aldrich | T0886-100ML | |
| Toluene | Sigma-Aldrich | 244511-100ML | |
| Ethyl Acetate | Sigma-Aldrich | 270989-100ML | |
| Tetrahydrofuran | Sigma-Aldrich | 401757-2L | |
| 400 MHz FT NMR spectrometer | See Bruker’s Avance User’s Manual, version 000822 for details |
Referências
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
- Cuzick, J., et al. Aspirin and non-steroidal anti-inflammatory drugs for cancer prevention: an international consensus statement. Lancet Oncol. 10, 501-507 (2009).
- Terry, M. B., et al. Association of frequency and duration of aspirin use and hormone receptor status with breast cancer risk. JAMA. 291, 2433-2440 (2004).
- Wang, D., Dubois, R. N. Cyclooxygenase-2: a potential target in breast cancer. Semin Oncol. 31, 64-73 (2004).
- Howe, L. R. Inflammation and breast cancer. Cyclooxygenase/prostaglandin signaling and breast cancer. Breast Cancer Res. 9. 9, 210 (2007).
- Kopp, E., Ghosh, S. Inhibition of NF-kappa B by sodium salicylate and aspirin. Science. 265, 956-959 (1994).
- Yin, M. J., Yamamoto, Y., Gaynor, R. B. The anti-inflammatory agents aspirin and salicylate inhibit the activity of I(kappa)B kinase-beta. Nature. 396, 77-80 (1998).
- Pierce, J. W., Read, M. A., Ding, H., Luscinskas, F. W., Collins, T. Salicylates inhibit I kappa B-alpha phosphorylation, endothelial-leukocyte adhesion molecule expression, and neutrophil transmigration. J Immunol. 156, 3961-3969 (1996).
- Frasor, J., El-Shennawy, L., Stender, J. D., Kastrati, I. NFkappaB affects estrogen receptor expression and activity in breast cancer through multiple mechanisms. Mol Cell Endocrinol. 418, 235-239 (2014).
- Perkins, N. D. The diverse and complex roles of NF-kappaB subunits in cancer. Nat Rev Cancer. 12, 121-132 (2012).
- DiDonato, J. A., Mercurio, F., Karin, M. NF-kappaB and the link between inflammation and cancer. Immunol Rev. 246, 379-400 (2012).
- Scarpignato, C., Hunt, R. H. Nonsteroidal antiinflammatory drug-related injury to the gastrointestinal tract: clinical picture, pathogenesis, and prevention. Gastroenterol Clin North Am. 39, 433-464 (2010).
- Sostres, C., Gargallo, C. J. Gastrointestinal lesions and complications of low-dose aspirin in the gastrointestinal tract. Best Pract Res Clin Gastroenterol. 26, 141-151 (2012).
- Kastrati, I., et al. Dimethyl Fumarate Inhibits the Nuclear Factor kappaB Pathway in Breast Cancer Cells by Covalent Modification of p65 Protein. J Biol Chem. 291, 3639-3647 (2016).
- Kastrati, I., et al. A novel aspirin prodrug inhibits NFkappaB activity and breast cancer stem cell properties. BMC Cancer. 15, 845 (2015).
- Cao, Y., Luo, J. L., Karin, M. IkappaB kinase alpha kinase activity is required for self-renewal of ErbB2/Her2-transformed mammary tumor-initiating cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 15852-15857 (2007).
- Liu, M., et al. The canonical NF-kappaB pathway governs mammary tumorigenesis in transgenic mice and tumor stem cell expansion. Cancer Res. 70, 10464-10473 (2010).
- Korkaya, H., Liu, S., Wicha, M. S. Regulation of cancer stem cells by cytokine networks: attacking cancer’s inflammatory roots. Clin Cancer Res. 17, 6125-6129 (2011).
- Hinohara, K., et al. ErbB receptor tyrosine kinase/NF-kappaB signaling controls mammosphere formation in human breast cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 6584-6589 (2012).
- Kendellen, M. F., Bradford, J. W., Lawrence, C. L., Clark, K. S., Baldwin, A. S. Canonical and non-canonical NF-kappaB signaling promotes breast cancer tumor-initiating cells. Oncogene. 33, 1297-1305 (2014).
- Yamamoto, M., et al. NF-kappaB non-cell-autonomously regulates cancer stem cell populations in the basal-like breast cancer subtype. Nat Commun. 4, 2299 (2013).
- Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Purification of RNA using TRIzol (TRI reagent). Cold Spring Harb Protoc. , (2010).
- Frasor, J., et al. Positive cross-talk between estrogen receptor and NF-kappaB in breast cancer. Cancer Res. 69, 8918-8925 (2009).
- Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 3983-3988 (2003).
- Vandermeeren, M., et al. Dimethylfumarate is an inhibitor of cytokine-induced nuclear translocation of NF-kappa B1, but not RelA in normal human dermal fibroblast cells. J Invest Dermatol. 116, 124-130 (2001).
- Loewe, R., et al. Dimethylfumarate inhibits TNF-induced nuclear entry of NF-kappa B/p65 in human endothelial cells. J Immunol. 168, 4781-4787 (2002).
- Seidel, P., et al. Dimethylfumarate inhibits NF-{kappa}B function at multiple levels to limit airway smooth muscle cell cytokine secretion. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 297, L326-L339 (2009).
- Wilms, H., et al. Dimethylfumarate inhibits microglial and astrocytic inflammation by suppressing the synthesis of nitric oxide, IL-1beta, TNF-alpha and IL-6 in an in-vitro model of brain inflammation. J Neuroinflammation. 7, 30 (2010).
- Peng, H., et al. Dimethyl fumarate inhibits dendritic cell maturation via nuclear factor kappaB (NF-kappaB) and extracellular signal-regulated kinase 1 and 2 (ERK1/2) and mitogen stress-activated kinase 1 (MSK1) signaling. J Biol Chem. 287, 28017-28026 (2012).
- Li, H. J., Reinhardt, F., Herschman, H. R., Weinberg, R. A. Cancer-stimulated mesenchymal stem cells create a carcinoma stem cell niche via prostaglandin E2 signaling. Cancer Discov. 2, 840-855 (2012).
- Li, X., et al. Intrinsic resistance of tumorigenic breast cancer cells to chemotherapy. J Natl Cancer Inst. 100, 672-679 (2008).
- Diehn, M., et al. Association of reactive oxygen species levels and radioresistance in cancer stem cells. Nature. 458, 780-783 (2009).
- Hollier, B. G., Evans, K., Mani, S. A. The epithelial-to-mesenchymal transition and cancer stem cells: a coalition against cancer therapies. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 14, 29-43 (2009).
- Velasco-Velazquez, M. A., Popov, V. M., Lisanti, M. P., Pestell, R. G. The role of breast cancer stem cells in metastasis and therapeutic implications. Am J Pathol. 179, 2-11 (2011).
- Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes Dev. 17, 1253-1270 (2003).
- Charafe-Jauffret, E., et al. Cancer stem cells in breast: current opinion and future challenges. Pathobiology. 75, 75-84 (2008).
- Clayton, H., Titley, I., Vivanco, M. Growth and differentiation of progenitor/stem cells derived from the human mammary gland. Exp Cell Res. 297, 444-460 (2004).
- Ginestier, C., et al. ALDH1 is a marker of normal and malignant human mammary stem cells and a predictor of poor clinical outcome. Cell Stem Cell. 1, 555-567 (2007).
- Rosen, J. M., Jordan, C. T. The increasing complexity of the cancer stem cell paradigm. Science. 324, 1670-1673 (2009).
- Visvader, J. E., Lindeman, G. J. Cancer stem cells in solid tumours: accumulating evidence and unresolved questions. Nat Rev Cancer. 8, 755-768 (2008).
