NFκB活性および乳癌幹細胞を阻害するアスピリン、フマル酸プロドラッグの合成とキャラクタリゼーション
Summary
This procedure will demonstrate how we synthesized and characterized the anti-NFκB and anti-cancer stem cell activity of an aspirin-fumarate prodrug.
Abstract
炎症は、癌の発生やプロモーション、および転移に最終的に進行の基礎となるがん特徴です。したがって、標準的な癌連隊に抗炎症薬を追加して患者の転帰を改善することができます。そのような薬物、アスピリン（アセチルサリチル酸、ASA）は、癌の化学予防及び抗腫瘍活性のために検討されています。シクロオキシゲナーゼ2 – プロスタグランジン軸を阻害することに加えて、ASAの抗癌活性はまた、核因子ĸB（NFĸB）阻害に起因しています。長時間ASAの使用は、胃腸毒性を引き起こす可能性があるため、プロドラッグ戦略が成功裏に実施されています。このプロドラッグでは、ASAのカルボン酸はマスクされ、追加のファーマコフォアが組み込まれているデザイン。
このプロトコルは、我々はアスピリン – フマル酸プロドラッグ、GTCpFEを合成し、乳癌細胞とがん幹様適切なの減衰にNFĸB経路の阻害を特徴とする方法を説明しますネクタイ、重要なNFĸB依存表現型。 ASAは、ASA構造にフマル酸を添加すると有意にその活性に寄与することを示す、任意の阻害活性を欠いているのに対し、GTCpFEを効果乳癌細胞株においてNFĸB経路を阻害します。免疫表現–また、GTCpFEはマンモスフェアの形成を阻止し、がん幹細胞関連CD44 + CD24を減衰させることにより、有意な抗がん幹細胞の活性を示します。これらの結果は、化学的予防及び癌治療のための改良された抗炎症薬を開発するための実行可能な戦略を確立します。
Introduction
炎症は、転移1への入射とプロモーション、そして最終的に進行などの腫瘍形成の複数の側面を、基礎となる特徴です。乳癌では、これは、さらに古典的な非ステロイド系抗炎症薬、アスピリン（アセチルサリチル酸、ASA）の定期的な使用は、両方の乳癌発生率の低下、および転移および再発のリスクと関連していることを示す疫学的観察によって支持されます2,3。 ASAは、主に、多くの場合、乳癌4,5においてアップレギュレートされるシクロオキシゲナーゼ-2活性を阻害することによって作用します。しかし、ASAの抗癌効果はまた、異常な核因子κB（NFκB）6-8シグナリングを抑制することによって媒介され得ます。無秩序なNFκB経路は、腫瘍細胞の生存、増殖、遊走、浸潤、血管形成、および治療9-11に対する抵抗性を促進するので、これは重要です。 NFκB経路の活性化はまた、取り付けのために重要です免疫応答。したがって、長期のNFκB阻害が必要とされる抗癌治療のために、一方が長く持続する免疫抑制が関与する有害な副作用を考慮しなければなりません。そのため、ASAは、治療最適化のための良い出発点として働くことができます。
癌治療におけるASAのアプリケーションのための1つの制限は、このような潰瘍、胃が12,13の出血として、胃腸毒性と関連しているシクロオキシゲナーゼ2およびNFκB阻害に必要な上昇用量です。しかし、エステルプロドラッグにASAを変換する、ASAの胃腸毒性を低減することができます。さらに効力を増強する、および/または機能を追加するために、追加の構成要素または補助的なファルマコフォアはまた、エステルプロドラッグの設計に組み込むことができます。そのようなファーマコフォアは、NFκB経路に対するASAの効力を増強するために加え、我々は以前にNFκB経路阻害14,15のために重要であることが示されたフマル酸です。
<p class="「jove_contentは"">我々は、アスピリン-フマル酸プロドラッグ15、GTCpFEを合成し、このようなハイブリッド分子はまだNFκB経路に対する強力な安全であろうという仮説を立てました。我々は、乳癌細胞におけるその抗NFκB活性およびNFκBの生存および増殖16-21ためのシグナリングに依存乳癌幹細胞（CSCを）15をブロックする能力を試験しました。私たちは、NFκB経路に対するGTCpFEの効力が大幅ASA 15に改善されていることがわかります。また、GTCpFEブロックマンモスフェア形成およびCSC表面マーカーCD44 + CD24減衰– GTCpFEはのCSC 15を根絶することが可能であることを示す、免疫表現を。また、これらの結果は、乳房のCSCを標的とすることができる有効な抗炎症薬としてアスピリン – フマル酸プロドラッグを確立します。乳癌治療の観点から、GTCpFEはアグレッシブと致命的な疾患を治療する可能性を有していてもよいです。Protocol
アスピリンフマル酸塩プロドラッグGTCpFEの1の合成プラスチックプランジャーシリンジを用いて、丸底フラスコ（10ml）中のメタノール0.81ミリリットル（20ミリモル）を測定し、水に混ぜます。氷水浴中でフラスコを配置することによって0℃まで得られた混合物を冷却します。 4-ヒドロキシベンジルアルコール（2.48ミリグラム、20ミリモル）を加え、溶液が透明になるまで、反応混合物…
Representative Results
図1において、化学アスピリンフマル酸プロドラッグの構造、GTCpFE、および乳癌細胞においてNFĸB経路誘導されるサイトカインに対する阻害活性が示されています。 GTCpFEは、両方NFĸBエンドポイントを阻害NFĸB-REルシフェラーゼ活性（ 図1B）、そのような細胞間接着分子1（ICAM1）、ケモカインCCモチーフリガンド2（CCL2）、および腫瘍壊死因子?…
Discussion
In this protocol, we demonstrated the synthesis of an ASA prodrug, GTCpFE, where the fumarate pharmacophore was incorporated to improve the anti-NFĸB activity in breast cancer cells. GTCpFE is an effective NFĸB inhibitor, whereas ASA itself is not, even at much higher concentrations. The fumarate moiety has anti-inflammatory properties as shown by its ability to inhibit NFĸB signaling in a variety of cell lines and tissues14,25-29. The prodrug strategy described herein, is amendable to other mal…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants provided by the National Institutes of Health (NIH), R01 CA200669 to JF and R01 CA121107 to GRJT, and by a postdoctoral fellowship grant from Susan G. Komen for the Cure to IK (PDF12229484).
Materials
| RPMI 1640 Red Medium | Life Technologies | 11875-093 | Warm up to 37°C before use |
| IMEM | Corning | 10-024-CV | Warm up to 37°C before use |
| DMEM / F12 Medium | ThermoFisher | 21041-025 | Warm up to 37°C before use |
| MEM NEAA 10mM 100X | Life Technologies | 11140 | |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| L-Glutamine 100X | Life Technologies | 25030-081 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I-1882 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Trypsin 2.5% 10X | Invitrogen | 15090046 | |
| Methyl Cellulose | Sigma | M0262 | |
| B27 Supplement 50X | Gibco | 17504-044 | |
| EGF | Gibco | PHG0311L | |
| NFκB-RE Luciferase Construct | Clontech | pGL4.32 | |
| Renilla Luciferase Construct | Promega | pGL4.70 | |
| Lipofectamine 2000 | ThermoFisher | 11668-019 | |
| Dual-Luciferase Reporter Assay | Promega | 120000032 | |
| NanoDrop Spectrophotometer | ThermoFisher | ||
| Eppendorf Mastercycler | Eppendorf | ||
| StepOne Real Time PCR System | Thermo Scientific | ||
| Eclipse Microscope | Nikon | ||
| CyAn ADP Analyzer | Beckman Coulter | ||
| QCapture Software | QImaging | ||
| Summit Software | Beckman Coulter | ||
| GraphPad Software | Prism | ||
| TRIzol | ThermoFisher | 15596-018 | |
| M-MLV Reverse Transcriptase | Invitrogen | 28025-013 | |
| 100 mM dNTP Set | Invitrogen | 10297-018 | |
| Random Hexamers | Invitrogen | 48190-011 | |
| Fast SYBR Green Master Mix | ThermoFisher | 4385612 | |
| Costar 96W, ultra low attachment | Corning | 3474 | |
| HBSS, 1X | ThermoFisher | 14025134 | |
| CD44-APC conjugated antibody | BD Pharmingen | 560990 | Store at 4°C, protect from light |
| CD24-PE antibody | BD Pharmingen | 560991 | Store at 4°C, protect from light |
| Recombinant Human TNFα | Fisher | 210TA100 | |
| CCL2 Primer Forward Sequence | AGAATCACCAGCAGCAAGTGTCC | ||
| CCL2 Primer Reverse Sequence | TCCTGAACCCACTTCTGCTTGG | ||
| ICAM1 Primer Reverse Sequence | TGACGAAGCCAGAGGTCTCAG | ||
| ICAM1 Primer Forward Sequence | AGCGTCACCTTGGCTCTAGG | ||
| TNF Primer Forward Sequence | AAGGGTGACCGACTCAGCG | ||
| TNF Primer Reverse Sequence | ATCCCAAAGTAGACCTGCCCA | ||
| 36B4 Primer Forward Sequence | GTGTTCGACAATGGCAGCAT | ||
| 36B4 Primer Reverse Sequence | GACACCCTCCAGGAAGCGA | ||
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881-500G | |
| 4-Hydroxybenzyl Alcohol | Sigma-Aldrich | 20806-10G | |
| O-Acetylsalicyloyl Chloride | Sigma-Aldrich | 165190-5G | |
| Phosphorous Pentoxide | Sigma-Aldrich | 79610-100G | |
| Ethyl Fumaroyl Chloride | Sigma-Aldrich | 669695-1G | |
| Sodium Sulfate | Sigma-Aldrich | 246980-500G | |
| 4-Dimethylaminopyridine | Sigma-Aldrich | 714844-100ML | 0.5 M in tetrahydrofuran |
| Triethylamine | Sigma-Aldrich | T0886-100ML | |
| Toluene | Sigma-Aldrich | 244511-100ML | |
| Ethyl Acetate | Sigma-Aldrich | 270989-100ML | |
| Tetrahydrofuran | Sigma-Aldrich | 401757-2L | |
| 400 MHz FT NMR spectrometer | See Bruker’s Avance User’s Manual, version 000822 for details |
Referências
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Citar este artigo
Kastrati, I., Delgado-Rivera, L., Georgieva, G., Thatcher, G. R. J., Frasor, J. Synthesis and Characterization of an Aspirin-fumarate Prodrug that Inhibits NFκB Activity and Breast Cancer Stem Cells. J. Vis. Exp. (119), e54798, doi:10.3791/54798 (2017).