وضع البروتوكول المكرر لزرع الخلايا الظهارية الصبغية الشبكية البشرية ترانس-سكليرال سوبريتينال في عيون الفئران
Summary
حقن سوبريتينال قد طبقت على نطاق واسع في الدراسات الإكلينيكية للعلاج باستبدال الخلايا الجذعية لكبر السن البقعي. في هذه المقالة تصور، يصف لنا تقنية حقن سوبريتينال أقل مخاطرة واستنساخه وتعديل التحديد عن طريق نهج ترانس-سكليرال لتوصيل الخلايا إلى عيون الفئران.
Abstract
أمراض الشبكية التنكسية مثل كبر السن البقعي (AMD) هي السبب الرئيسي لفقدان البصر الذي لا رجعة فيه في جميع أنحاء العالم. أية أم دي تتميز بانحطاط الخلايا الظهارية الصبغية الشبكية (RPE) التي هي أحادي الطبقة خلايا الداعمة وظيفيا وتشريحيا الالتفاف حول الشبكية العصبية. العلاجات الدوائية الحالية لعدم نيوفاسكولار أية أم دي (AMD الجافة) فقط إبطاء تطور المرض ولكن لا يمكن استعادة الرؤية، مما يستدعي دراسات تهدف إلى تحديد الاستراتيجيات العلاجية الرواية. استبدال الخلايا RPE التنكسية بالوعد يحمل الخلايا السليمة لعلاج أية أم دي الجاف في المستقبل. وتشمل الدراسات السريرية واسعة النطاق من الخلايا الجذعية العلاج البديلة لأية أم دي زرع الخلايا RPE المستمدة من الخلايا الجذعية في الفضاء سوبريتينال من النماذج الحيوانية، التي تطبق تقنية حقن سوبريتينال. والنهج الأكثر استخداماً في هذه الدراسات السريرية على الحيوانات طريق ترانس-سكليرال، الذي صعوبة بسبب انعدام التصور مباشرة من نهاية الإبرة، وكثيراً ما يمكن أن يؤدي إلى تلف الشبكية. نهج بديل من خلال الجسم الزجاجي يسمح للمراقبة المباشرة لوضع نهاية الإبرة، ولكن فإنه ينطوي على مخاطر عالية للصدمات الجراحية كما نشعر بالقلق أكثر من أنسجة العين. قمنا بتطوير أسلوب حقن ترانس سكليرال معدلة أقل مخاطرة واستنساخه يستخدم زوايا محددة بإبرة وأعماق بنجاح واستمرار تسليم RPE الخلايا في الفضاء سوبريتينال الفئران وتجنب الأضرار الشبكية المفرط. الخلايا التي تم تسليمها بهذه الطريقة أثبتت سابقا أن تكون فعالة في الفئران “الكلية الملكية للجراحين” (نظام المنسقين المقيمين) لمدة شهرين على الأقل. يمكن استخدام هذا الأسلوب ليس فقط لزرع الخلايا ولكن أيضا لتسليم الجزيئات الصغيرة أو العلاج الجيني.
Introduction
شبكية العين البشرية تقع في الجزء الخلفي من وظائف العين كأنسجة حسية خفيفة ويلعب دوراً حاسما في تصور الرؤية. الخلل في الخلية الشبكية أو موت الخلايا وبالتالي يسبب مشاكل في الرؤية أو العمى الدائم. الاضطرابات التي تشمل ضمور أو اختلال وظيفي للخلايا في طبقات مختلفة من الشبكية معروفة كأمراض الشبكية التنكسية، بينها AMD هو النوع الأكثر شيوعاً، والسبب الرئيسي للعمى الذي لا رجعة فيه في كبار السن في البلدان المتقدمة النمو 1،2. عملية المرضية من AMD يرتبط بتراكم “دروسين” بين طبقة RPE وغشاء بروخ الكامنة في، الذي بدوره يضعف الدعم RPE الفسيولوجيا مستقبله، مما يؤدي إلى ضمور الشبكية العصبية و فقدان الرؤية3، 4،5. وحتى الآن لا يوجد علاج متقدمة الجاف AMD (غير نيوفاسكولار). ظهور العلاج بالخلايا الجذعية كنموذج جديد في الطب التجديدي يجلب الأمل لاستبدال الخلايا RPE المختلة وظيفيا أو الميت بالخلايا السليمة المستمدة من الخلايا الجذعية. في الواقع، وقف الدراسات السريرية واسعة النطاق لزرع خلايا (مثلاً، الخلايا الجذعية الجنينية البشرية)-المشتقة من الخلايا RPE في نماذج حيوانية RPE التنكسية قد أجرى6،7، التي انتقلت إلى التجارب السريرية8،9 (NCT01344993، ClinicalTrials.gov). في الآونة الأخيرة، وحددت لدينا مختبر مصدر بديل للخلايا الجذعية المقيم في طبقة RPE البشرية، أن الخلايا الجذعية RPE البشرية (هربيسكس)، ويستخدم حاليا في الدراسات السريرية لعلاج زرع الخلايا (هربيسك-RPE) RPE المستمدة هربيسك لأية أم دي 10 , 11 , 12 , 13.
يتم تطبيق تقنية حقن سوبريتينال في الدراسات السريرية المذكورة أعلاه بواسطة مجموعات متعددة، بما في ذلك مجموعتنا. وهناك نهجين عامين لحقن سوبريتينال في الحيوانات: ترانس-فيتريل وعبر سكليرال. النهج ترانس-فيتريل الذي يتميز بالجراح التمكن من مراقبة مباشرة نهاية إبرة تخترق العين الأمامي، يعبر تجويف فيتريل كامل المتاخمة للعدسة، وتخترق الشبكية في الجزء الخلفي للعين لتصل سوبريتينال مساحة14،،من1516. ومع ذلك، فإنه يتطلب تعطيل الشبكية في موقعين (الأمامي والخلفي)، ينطوي على خطر الأضرار بالعدسة، ويمكن أن يؤدي في الدفق خلايا في الجسم الزجاجي عندما يتم سحب الإبرة. وفي المقابل، النهج ترانس-الصلبة العينية، من حيث المبدأ، يتجنب إشراك الشبكية والجسم الزجاجي، والدفق مخارج العين. في القوارض المصطبغة، الجراح في البداية أن نلاحظ تغلغل الصلبة العينية، ولكن بعد مرور في المشيمية المصطبغة، نهاية إبرة لم تعد مرئية. دون المراقبة المباشرة، خرق الشبكية شائع، ويمكن أن يسفر عن تشريح الشبكية والتسليم للخلايا و/أو الدم الجسم الزجاجي. علاوة على ذلك، لأنه منحنى على سطح العين، فإنه من الصعب جداً معرفة زوايا إبرة والأعماق التي هي الأكثر فعالية لحقن ترانس-سكليرال.
في هذه المقالة تصور، نقدم طريقة حقن سوبريتينال ترانس سكليرال أبلغ عن طريق استخدام التقييمات بعد الجراحة مع “البصرية التماسك التصوير المقطعي” (OCT)، التي تتيح إجراء فحص مفصل للحقن. تستخدم تقنية حقن ترانس سكليرال لدينا مواقع المعرفة، والزوايا، وأعماق لابر الحقن لإنتاج منخفضة جداً من الصدمة الجراحية والموثوقية العالية. هنا، علينا أن نظهر على وجه التحديد حقن الخلايا هربيسك-RPE في الفضاء سوبريتينال من الفئران نظام المنسقين المقيمين، نموذج ما قبل سريرية للبشرية أية أم دي. مع هذا الأسلوب حقن، نحن بنجاح واستمرار تسليم الخلايا هربيسك-RPE في الفضاء سوبريتينال من عيون الفئران نظام المنسقين المقيمين مع نسبة نجاح عالية جداً. حقن الخلايا وجد سابقا أن يؤدي إلى الحفاظ على نظام المنسقين المقيمين photoreceptors 2 أشهر على الأقل بعد حقن13. هذه الإجراءات تتم تحت مجهر تشريح وسهلة التعلم. أنه يتطلب شخصين (طبيب جراح ومساعد) للقيام الحقن ومتوسط الوقت لحقن لكل الحيوانات أقل من 5 دقائق. بزوايا محددة والأعماق للحقن بالإبر تجعل من الممكن للمختبرات والتي يتوفر فيها OCT، تحقيق نجاح حقن سوبريتينال. أنها تسمح للوصول سوبريتينال استنساخه بدرجة عالية، ويمكن استخدامها لزرع الخلايا، بل أيضا للمخدرات العلاجات التسليم والجينات.
Protocol
Representative Results
Discussion
تقنية حقن سوبريتينال المبينة في هذه المادة عبر المسار عبر سكليرال، حيث تخترق الإبرة حاقن الطبقات الخارجية (الصلبة-المشيمية-RPE مجمع) الجدار العين دون إيذاء الشبكية العصبية أو الإخلال بتجويف الزجاجي. وقد نهج بديلة ترانس-فيتريال مخاطرة محتملة الضرر العدسة مما يؤدي إلى إعتام عدسة العين، منذ ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر ليدرمان باتي لمساعدتها على الجراحة وسوزان بوردن لإعداد الخلية RPE. ونعترف أيضا C028504 نيستيم للتمويل اللازم لهذا المشروع. جوستين ميلر دال-معتمد من قبل المعهد الوطني للصحة منح F32EY025931.
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25200-072 | |
| DNAse I | Sigma | DN-25 | |
| 1xDulbecco’s Phosphate Buffered Saline without Calcium & Magnesium (1xDPBS-CMF) | Corning Cellgro | 431219 | |
| Sterile Balanced Salt Solution (BSS) | Alcon | 00065079550 | |
| Sterile eye wash | Moore Medical | 75519 | |
| Sterile 0.9% saline | Hospira | 488810 | |
| Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution (0.5%) | Akorn | 17478026312 | |
| Tropicamide Ophthalmic Solution, USP (1%) | Bausch & Lomb | 24208058559 | |
| Phenylepherine Ophtalmic Solution, USP (10%) stock | Bausch & Lomb | 42702010305 | This is used to make 2.5% Phenylepherine |
| Buprenex | Patterson | 433502 | |
| Dexamethasone | APP Pharmaceuticals | 63323051610 | |
| 100% Ethanol | Thermo Scientific | 615090040 | |
| 70% Ethanol | Ricca Chemical Company | 2546.70-5 | |
| Sterile GenTeal Lubricant Eye Gel | Novartis | 78042947 | |
| Sterile Systane Ultra Lubricant Eye Drops | Alcon | 00065143105 | |
| hRPESC-RPE cells | Not available commercially | Please refer to "Reference #12" for cell isolation and mainteinance. | |
| 24-well plates | Corning | 3526 | |
| Conical tubes (15 ml) | Sarstedt | 62554002 | |
| Microcentrifuge cap with o-ring | LPS inc | L233126 | |
| Capless Microcentrifuge tubes (1.7 ml) | LPS inc | L233041 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| Sterile alcohol wipe | McKesson | 58-204 | |
| Sterile cotton tip applicators | McKesson | 24-106-2S | |
| Sterile Weck-Cel spears | Beaver-Visitec International | 0008680 | |
| Sterile surgical drapes | McKesson | 25-515 | |
| Gauze | McKesson | 16-4242 | |
| Nanofil syringe (10 ul) | World Precision Instruments | Nanofil | |
| Nanofil beveled 33-gauge needle | World Precision Instruments | NF33BV-2 | |
| Insulin syringe needles 31-gauge | Becton Dickinson | 328418 | |
| Rat toothed forceps | World Precision Instruments | 555041FT | |
| Vannas Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz | RS-5602 | |
| Circulating water T pump | Stryker | TP700 | |
| Heating pad | Kent Scientific | TPZ-814 | |
| Animal anesthesia system | World Precision Instruments | EZ-7000 | |
| Balance | Ohaus | PA1502 | |
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Microscope light source | Schott | ACE series | |
| Bioptigen Envisu Spectral Domain Ophthalmic Imaging System | Bioptigen | R2210 | |
| Sterile black marker pen | Viscot Industries | 1416S-100 | |
| Miniature measuring scale | Ted Pella Inc | 13623 | |
| Infrared Basking Spot Lamp | EXO-TERRA | PT2144 | This is used as a heating lamp for animals during the post-surgical recovery phase |
Referências
- De Jong, P. T. Age-related macular degeneration. N Engl J Med. 355, 1474-1485 (2006).
- Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. Lancet Global Health. 2 (2), e106-e116 (2014).
- Ambati, J., Fowler, B. J. Mechanisms of agerelated macular degeneration. Neuron. 75, 26-39 (2012).
- Abdelsalam, A., Del Priore, L. V., Zarbin, M. A. Drusen in age-related macular degeneration: Pathogenesis, natural course, and laser photocoagulation-induced regression. Surv Ophthalmol. 44 (1), 1-29 (1999).
- Jager, R. D., Mieler, W. F., Miller, J. W. Age-related macular degeneration. N Engl J Med. 358 (24), 2606-2617 (2008).
- Lund, R. D., et al. Human embryonic stem cell-derived cells rescue visual function in dystrophic RCS rats. Cloning Stem Cells. 8 (3), 189-199 (2006).
- Vugler, A., et al. Embryonic stem cells and retinal repair. Mech Dev. 124 (11-12), 807-829 (2007).
- Schwartz, S. D., et al. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).
- Schwartz, S. D., et al. Human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium in patients with age-related macular degeneration and Stargardt’s macular dystrophy: follow-up of two open-label phase 1/2 studies. Lancet. 385 (9967), 509-516 (2015).
- Stanzel, B. V., et al. Human RPE Stem Cells Grown into Polarized RPE Monolayers on a Polyester Matrix Are Maintained after Grafting into Rabbit Subretinal Space. Stem Cell Reports. 2 (1), 64-77 (2014).
- Blenkinsop, T. A., et al. Human adult retinal pigment epithelial stem cell-derived RPE monolayers exhibit key physiological characteristics of native tissue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (12), 7085-7099 (2015).
- Salero, E., et al. Adult human RPE can be activated into a multipotent stem cell that produces mesenchymal derivatives. Cell Stem Cell. 10 (1), 88-95 (2012).
- Davis, J. R., et al. Human RPE Stem Cell-Derived RPE Preserves Photoreceptors in the Royal College of Surgeons Rat: Method for Quantifying the Area of Photoreceptor Sparing. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 32 (5), 304-309 (2016).
- Westenskow, P. D., et al. Performing Subretinal Injections in Rodents to Deliver Retinal Pigment Epithelium Cells in Suspension. J Vis Exp. (95), e52247 (2015).
- Lopez, R., et al. Transplanted Retinal Pigment Epithelium Modifies the Retinal Degeneration in the RCS Rat. Invest Ophthalmol Vis Sci. 30 (3), 586-588 (1989).
- Eberle, D., Santos-Ferreira, T., Grahl, S., Ader, M. Subretinal Transplantation of MACS Purified Photoreceptor Precursor Cells into the Adult Mouse Retina. J Vis Exp. (84), e50932 (2014).
- Nair, G., et al. Effects of Common Anesthetics on Eye Movement and Electroretinogram. Doc Ophthalmol. 122 (3), 163-176 (2011).
- McGill, T. J., et al. Transplantation of human central nervous system stem cells – neuroprotection in retinal degeneration. Eur J Neurosci. 35, 468-477 (2012).
- Al-Hussaini, H., Kam, J. H., Vugler, A., Semo, M., Jeffery, G. Mature retinal pigment epithelium cells are retained in the cell cycle and proliferate in vivo. Mol Vis. 14, 1784-1791 (2008).
- Wang, S., Lu, B., Wood, P., Lund, R. D. Grafting of ARPE-19 and Schwann Cells to the Subretinal Space in RCS Rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (7), 2552-2560 (2005).
- Fabian, R. J., Bond, J. M., Drobeck, H. P. Induced corneal opacities in the rat. Br J Ophthalmol. 51 (2), 124-129 (1967).
