Sviluppo di un protocollo di raffinata per Trans-sclerale Subretinal trapianto delle cellule epiteliali del pigmento retinico umano negli occhi di topo
Summary
Iniezione subretinal è stato ampiamente applicato negli studi preclinici di terapia sostitutiva delle cellule staminali per degenerazione maculare senile. In questo articolo visualizzato in quel momento, descriviamo una tecnica di iniezione subretinal meno rischioso, riproducibile e precisamente modificati tramite l’approccio trans-sclerale per fornire cellule negli occhi del ratto.
Abstract
Malattie degenerative retiniche come la degenerazione maculare senile (AMD) sono la principale causa di perdita irreversibile di visione in tutto il mondo. AMD è caratterizzata dalla degenerazione delle cellule epiteliali del pigmento retinico (RPE), che sono un monostrato di cellule funzionalmente sostenendo e anatomicamente avvolgendo intorno alla retina neurale. Gli attuali trattamenti farmacologici per non neovascular AMD (AMD secca) solo rallentano la progressione della malattia ma non possono ripristinare la visione, che necessitano di studi finalizzati ad individuare nuove strategie terapeutiche. Sostituendo le cellule RPE degenerative con cellule sane detiene promessa per il trattamento di AMD secca in futuro. Vasti studi preclinici di terapie di sostituzione della cellula staminale per AMD prevedono il trapianto di cellule staminali derivate cellule RPE nello spazio subretinal di modelli animali, in cui viene applicata la tecnica di iniezione subretinal. L’approccio più frequentemente utilizzato in questi studi sugli animali preclinici è attraverso la via trans-sclerale, che è reso difficile dalla mancanza di visualizzazione diretta dell’estremità dell’ago e spesso può provocare danni alla retina. Un approccio alternativo attraverso il vitroso consente per l’osservazione diretta della posizione di estremità dell’ago, ma trasporta un alto rischio di traumi chirurgici come altri tessuti dell’occhio sono disturbati. Abbiamo sviluppato un metodo di iniezione trans-sclerale modificate meno rischioso e riproducibile che utilizza aghi definito diverse angolazioni e profondità correttamente e costantemente fornire cellule RPE nello spazio subretinal ratto ed evitare eccessivi danni alla retina. Trasportati in questo modo le cellule sono state dimostrate in precedenza per essere efficace nel ratto Royal College of Surgeons (RCS) per almeno 2 mesi. Questa tecnica può essere utilizzata non solo per trapianto di cellule, ma anche per la consegna di piccole molecole o terapie geniche.
Introduction
La retina umana situato sul retro le funzioni dell’occhio come un leggero tessuto sensoriale e svolge un ruolo critico nella percezione visiva. Disfunzione delle cellule retiniche o morte delle cellule di conseguenza causa problemi alla vista o cecità permanente. Disordini che coinvolgono la degenerazione o disfunzione delle cellule in diversi strati della retina sono conosciuti come malattie degenerative retiniche, tra cui AMD è il tipo più comune e la causa principale di cecità irreversibile negli anziani nei paesi sviluppati 1,2. Il processo patologico di AMD è associato con accumulazione “drusen” tra lo strato RPE e della membrana di Bruch sottostante, che a sua volta altera supporto RPE di fisiologia del fotoricettore, che conduce all’atrofia della retina neurale e visione perdita3, 4,5. Finora, non esiste una cura per avanzati (non neovascolare) DMLE secca. L’emergere della terapia con cellule staminali come un nuovo paradigma nella medicina rigenerativa porta la speranza di sostituire le cellule RPE disfunzionali o morte con cellule staminali derivate le cellule sane. Infatti, vasti studi preclinici di trapianto staminali (ad es., cellule staminali embrionali umane)-derivate cellule RPE in RPE-degenerativa modelli animali sono stati eseguiti6,7, alcuni dei quali hanno progredetto per studi clinici8,9 (NCT01344993, ClinicalTrials.gov). Recentemente, una fonte alternativa di cellule staminali residenti nel livello RPE umano, le cellule staminali umane di RPE (hRPESCs), è stata identificata dal nostro laboratorio e attualmente è utilizzata negli studi preclinici di terapia di trapianto cellulare (hRPESC-RPE) di hRPESC derivato-RPE per AMD 10 , 11 , 12 , 13.
La tecnica di iniezione subretinal è applicata negli studi preclinici citati sopra da più gruppi, tra cui il nostro gruppo. Ci sono due approcci generali per iniezione subretinal negli animali: trans-vitreal e trans-sclerale. L’approccio trans-vitreal ha il vantaggio del chirurgo essendo in grado di osservare direttamente l’estremità dell’ago come penetra l’occhio anteriore, attraversa la cavità intera vitreal adiacente alla lente e penetra la retina sul retro per l’occhio per raggiungere il subretinal spazio14,15,16. Tuttavia, occorre interrompere la retina in due posizioni (anteriore e posteriore), comporta il rischio di danneggiare la lente e può causare riflusso delle cellule nel corpo vitreo quando l’ago è ritirato. Al contrario, l’approccio trans-sclera, in linea di principio, evita il coinvolgimento della retina e vitreo e riflusso esce l’occhio. In roditori pigmentate, il chirurgo può osservare inizialmente penetrazione della sclera, ma dopo il passaggio in coroidico pigmentato, l’estremità dell’ago non è più visibile. Senza osservazione diretta, violando la retina è comune e può provocare dissezione retinica e consegna di cellule e/o sangue nel vitreo. Inoltre, poiché la superficie dell’occhio è curvo, è molto difficile sapere quali gli angoli dell’ago e la profondità sono più efficaci per iniezioni trans-sclerale.
In questo articolo visualizzato in quel momento, vi presentiamo un metodo di iniezione subretinal trans-sclerale informato mediante l’uso di valutazioni post-chirurgiche con tomografia a coerenza ottica (OCT), che consente un esame dettagliato del sito di iniezione. La nostra tecnica di iniezione trans-sclerale utilizza posizioni definite, angoli e profondità per aghi per iniezione per produrre trauma chirurgico molto basso e l’alta affidabilità. Qui, dimostriamo in particolare l’iniezione di cellule hRPESC-RPE nello spazio subretinal del ratto RCS, un modello preclinico di AMD umano. Con questo metodo di iniezione, correttamente e coerentemente consegnammo le cellule hRPESC-RPE nello spazio subretinal di occhi di topo RCS con un tasso di successo molto alta. Iniezione delle cellule precedentemente è stato trovato per causare nella conservazione dei fotorecettori RCS almeno 2 mesi dopo iniezione13. Questa procedura viene eseguita sotto il microscopio per dissezione ed è facile da imparare. Richiede due persone (un chirurgo e un assistente) per eseguire l’iniezione e il tempo medio di iniezione per ogni animale è meno di 5 minuti. Gli angoli definiti e le profondità per aghi per iniezione rendono possibile per i laboratori, dove non è disponibile, per ottenere successo iniezione subretinal OCT. Esso permette un accesso subretinal altamente riproducibile e può essere utilizzato non solo per trapianto di cellule, ma anche per terapie farmacologiche consegna e gene.
Protocol
Representative Results
Discussion
La tecnica di iniezione subretinal illustrata in questo articolo è via la via trans-sclerale, dove l’ago dell’iniettore penetra gli strati più esterni della parete dell’occhio (sclera-coroide-RPE complesso) senza danneggiare la retina neurale o disturbare la cavità vitrosa. Un approccio alternativo trans-vitreal ha un potenziale rischio di danno di lente che porta alla cataratta, dal momento che l’obiettivo dei roditori occupa la maggior parte della cavità vitrosa. Rispetto a questo metodo, la nostra tecnica è meno …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Desideriamo ringraziare Patty Lederman per la sua assistenza sulla chirurgia e Susan Borden per preparazione delle cellule RPE. Riconosciamo anche NYSTEM C028504 per il finanziamento per questo progetto. Justine d. Miller è supportato da NIH concedere F32EY025931.
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25200-072 | |
| DNAse I | Sigma | DN-25 | |
| 1xDulbecco’s Phosphate Buffered Saline without Calcium & Magnesium (1xDPBS-CMF) | Corning Cellgro | 431219 | |
| Sterile Balanced Salt Solution (BSS) | Alcon | 00065079550 | |
| Sterile eye wash | Moore Medical | 75519 | |
| Sterile 0.9% saline | Hospira | 488810 | |
| Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution (0.5%) | Akorn | 17478026312 | |
| Tropicamide Ophthalmic Solution, USP (1%) | Bausch & Lomb | 24208058559 | |
| Phenylepherine Ophtalmic Solution, USP (10%) stock | Bausch & Lomb | 42702010305 | This is used to make 2.5% Phenylepherine |
| Buprenex | Patterson | 433502 | |
| Dexamethasone | APP Pharmaceuticals | 63323051610 | |
| 100% Ethanol | Thermo Scientific | 615090040 | |
| 70% Ethanol | Ricca Chemical Company | 2546.70-5 | |
| Sterile GenTeal Lubricant Eye Gel | Novartis | 78042947 | |
| Sterile Systane Ultra Lubricant Eye Drops | Alcon | 00065143105 | |
| hRPESC-RPE cells | Not available commercially | Please refer to "Reference #12" for cell isolation and mainteinance. | |
| 24-well plates | Corning | 3526 | |
| Conical tubes (15 ml) | Sarstedt | 62554002 | |
| Microcentrifuge cap with o-ring | LPS inc | L233126 | |
| Capless Microcentrifuge tubes (1.7 ml) | LPS inc | L233041 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| Sterile alcohol wipe | McKesson | 58-204 | |
| Sterile cotton tip applicators | McKesson | 24-106-2S | |
| Sterile Weck-Cel spears | Beaver-Visitec International | 0008680 | |
| Sterile surgical drapes | McKesson | 25-515 | |
| Gauze | McKesson | 16-4242 | |
| Nanofil syringe (10 ul) | World Precision Instruments | Nanofil | |
| Nanofil beveled 33-gauge needle | World Precision Instruments | NF33BV-2 | |
| Insulin syringe needles 31-gauge | Becton Dickinson | 328418 | |
| Rat toothed forceps | World Precision Instruments | 555041FT | |
| Vannas Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz | RS-5602 | |
| Circulating water T pump | Stryker | TP700 | |
| Heating pad | Kent Scientific | TPZ-814 | |
| Animal anesthesia system | World Precision Instruments | EZ-7000 | |
| Balance | Ohaus | PA1502 | |
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Microscope light source | Schott | ACE series | |
| Bioptigen Envisu Spectral Domain Ophthalmic Imaging System | Bioptigen | R2210 | |
| Sterile black marker pen | Viscot Industries | 1416S-100 | |
| Miniature measuring scale | Ted Pella Inc | 13623 | |
| Infrared Basking Spot Lamp | EXO-TERRA | PT2144 | This is used as a heating lamp for animals during the post-surgical recovery phase |
Referências
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