Entwicklung eines raffinierten Protokolls für Trans-skleralen subretinalen Transplantation von menschlichen retinalen Pigment Epithelzellen in Ratte Augen
Summary
Subretinale Injektion hat weit in präklinischen Studien der Stammzell-Ersatz-Therapie bei altersbedingter Makuladegeneration angewendet worden. In diesem visualisierte Artikel beschreiben wir eine weniger riskante, reproduzierbar und präzise modifizierte subretinalen Injektionstechnik über den Trans-skleralen Ansatz um Zellen in Ratte Augen zu liefern.
Abstract
Degenerative Netzhauterkrankungen wie altersbedingte Makula-Degeneration (AMD) sind die häufigste Ursache für irreversible Sehverlust weltweit. AMD zeichnet sich durch die Degeneration der Retina Pigment (RPE) Epithelzellen, die eine Monolage von Zellen funktionell unterstützen und anatomisch Umwickeln um die neuronale Netzhaut sind. Aktuellen pharmakologische Behandlungen für die nicht-neovaskulären AMD (trockene AMD) nur verlangsamen das Fortschreiten der Erkrankung aber nicht wiederherstellen Vision, dass Studien, die darauf abzielen, neue therapeutische Strategien zu identifizieren. Ersetzen die degenerativen RPE-Zellen mit gesunden Zellen hält Versprechen, trockenen AMD in der Zukunft zu behandeln. Umfangreiche präklinische Studien der Stammzell-Ersatz-Therapien für AMD beinhalten die Transplantation von Stammzellen gewonnenen RPE-Zellen in den subretinalen Raum von Tiermodellen, in denen die subretinale Injektionstechnik angewendet wird. In dieser präklinischen tierexperimentellen Studien am häufigsten verwendete Ansatz ist durch die Trans-skleralen Route, die wird durch die fehlende direkte Visualisierung des Nadelendes erschwert und oft retinalen Schäden führen kann. Ein alternativer Ansatz durch den Glaskörper ermöglicht die direkte Beobachtung der Nadel Endlage, aber es trägt ein hohes Risiko der chirurgischen Verletzungen wie mehr Augengewebe gestört werden. Wir haben einen weniger riskant und reproduzierbare modifizierte Trans-skleralen Injektionsverfahren entwickelt, definierte Nadel Winkeln und tiefen erfolgreich und konsequent RPE-Zellen in der Ratte subretinalen Raum liefern und übermäßige retinalen Schäden zu vermeiden. Zellen, die auf diese Weise geliefert wurden zuvor nachgewiesen, für mindestens 2 Monate in das Royal College of Surgeons (RCS) Ratte wirksam sein. Diese Technik kann nicht nur für Stammzelltransplantation, sondern auch für die Lieferung von kleinen Molekülen oder Gentherapien verwendet werden.
Introduction
Die menschliche Netzhaut befindet sich auf der Rückseite des Auges-Funktionen als eine leichte sensorische Gewebe und spielt eine entscheidende Rolle in der Vision Wahrnehmung. Funktionsstörungen der retinalen Zellen oder Zelltod verursacht daher Sehstörungen oder dauerhafte Erblindung. Erkrankungen mit Degeneration oder Dysfunktion der Zellen in verschiedenen Schichten der Netzhaut sind als degenerative Netzhauterkrankungen, bekannt unter denen AMD die häufigste Form und die häufigste Ursache für irreversible Blindheit bei älteren Menschen in den entwickelten Ländern ist 1,2. Des pathologischen Prozesses von AMD ist verbunden mit “Drusen” Anhäufung zwischen der RPE-Schicht und die zugrunde liegenden Bruch-Membran, die wiederum RPE Unterstützung der Photorezeptor Physiologie, was zu neuronalen Retinaatrophie und Vision Verlust3beeinträchtigt, 4,5. Bisher gibt es keine Heilung für fortgeschrittene trocknen (nicht-neovaskulären) AMD. Die Entstehung der Stammzell-Therapie als ein neues Paradigma in der regenerativen Medizin bringt die Hoffnung die dysfunktionalen oder tot RPE-Zellen durch Stammzellen gewonnenen gesunde Zellen zu ersetzen. In der Tat umfangreiche präklinische Studien der Transplantation von Stammzellen (z.B. menschlicher embryonaler Stammzellen)-abgeleitete RPE-Zellen in RPE-degenerativen Tiermodelle wurden durchgeführt6,7, einige davon weit fortgeschritten sind, klinische Studien8,9 (NCT01344993, ClinicalTrials.gov). Vor kurzem, eine alternative Quelle für Stammzellen resident in der menschlichen RPE-Schicht, die menschlichen RPE Zellen (hRPESCs), wurde von unserem Labor identifiziert und ist derzeit in präklinischen Studien von hRPESC abgeleitet-RPE (hRPESC-RPE) Transplantation Zelltherapie für AMD verwendet wird 10 , 11 , 12 , 13.
Die subretinale Injektionstechnik wird in den präklinischen Studien erwähnt durch mehrere Gruppen, darunter unsere Gruppe angewendet. Es gibt zwei grundsätzliche Ansätze für die subretinale Injektion bei Tieren: Trans-Glaskörperblutung und Trans-skleralen. Die Trans-Glaskörperblutung Ansatz hat den Vorteil des Chirurgen in der Lage, direkt am Ende der Nadel beobachten, wie das vordere Auge dringt, den gesamten Glaskörperblutung Hohlraum angrenzend an das Objektiv durchquert und dringt in die Netzhaut auf der Rückseite für das Auge, der subretinalen zu erreichen Platz14,15,16. Es erfordert jedoch stören die Netzhaut an zwei Standorten (Front- und Seitenzahnbereich), birgt das Risiko einer Beschädigung des Objektivs und Rückfluss von Zellen in den Glaskörper führen kann, wenn die Nadel zurückgezogen wird. Im Gegensatz dazu der Trans-Sklera Ansatz grundsätzlich vermeidet Beteiligung der Netzhaut und Glaskörper und Rückfluss beendet das Auge. Bei pigmentierten Nagetieren der Chirurg kann zunächst beobachten, Eindringen von der Sklera, aber nach dem Übergang in die pigmentierte Aderhaut, das Ende der Nadel ist nicht mehr sichtbar. Ohne direkte Beobachtung Verletzung der Netzhaut ist üblich und Netzhaut Dissektion und Lieferung von Zellen und/oder Blut in den Glaskörper führen kann. Darüber hinaus, da die Augenoberfläche gekrümmt ist, ist es sehr schwierig zu wissen, welche Nadel Winkel und Tiefe für Trans-skleralen Injektionen am effektivsten sind.
In diesem visualisierte Artikel stellen wir eine Trans-skleralen subretinalen Injektionsverfahren informiert durch den Einsatz von postoperativen Auswertungen mit optischen Kohärenztomografie (OCT), die eine detaillierte Untersuchung der Injektionsstelle ermöglichen. Unsere Trans-skleralen Injektionstechnik nutzt definierten Orten, Winkel und Tiefe für Injektionsnadeln, sehr niedrigen chirurgische Trauma und hohe Zuverlässigkeit zu produzieren. Hier zeigen wir speziell die Injektion von hRPESC-RPE-Zellen in den subretinalen Raum der RCS Ratte, ein prä-klinischen Modell der menschlichen AMD. Mit dieser Methode Injektion lieferten wir erfolgreich und konsequent hRPESC-RPE-Zellen in den subretinalen Raum des RCS Ratte Augen mit einer sehr hohen Erfolgsquote. Injektion von Zellen fand zuvor mindestens 2 Monate nach der Injektion13Erhaltung des RCS Photorezeptoren zur Folge. Dieses Verfahren wird unter dem sezierenden Mikroskop durchgeführt und ist leicht zu erlernen. Es erfordert zwei Personen (ein Chirurg und ein Assistent) die Injektion durchführen und die durchschnittliche Zeit der Injektion für jedes Tier ist weniger als 5 Minuten. Die definierten Winkeln und tiefen für Injektionsnadeln ermöglichen Labors, wo OAT nicht verfügbar sind, um erfolgreiche subretinale Injektion zu erreichen ist. Es ermöglicht hoch reproduzierbare subretinalen Zugriff und kann verwendet werden, nicht nur für Stammzelltransplantation, sondern auch für Medikamententherapien Lieferung und gen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die subretinale Injektionstechnik dargestellt in diesem Artikel wird über den Trans-skleralen Weg, wo die Injektor Nadel die Randschichten (Lederhaut-Aderhaut-RPE Komplex) die Augenwand dringt, ohne die neuronale Netzhaut schädigen oder stören den Glaskörper Hohlraum. Ein alternative Trans-Glaskörperblutung Ansatz hat ein potenzielles Risiko Objektiv Schaden führt zu Katarakt, da Nagetiere Objektiv befindet sich den Großteil der Glaskörper Hohlraum. Im Vergleich zu dieser Methode, unsere Technik ist weniger riska…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir wünschen Patty Lederman Danke für ihre Hilfe auf der Chirurgie und Susan Borden für RPE Zellen Vorbereitung. Wir anerkennen auch NYSTEM C028504 für die Finanzierung für dieses Projekt. Justine, die D. Miller von NIH unterstützt wird gewähren F32EY025931.
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25200-072 | |
| DNAse I | Sigma | DN-25 | |
| 1xDulbecco’s Phosphate Buffered Saline without Calcium & Magnesium (1xDPBS-CMF) | Corning Cellgro | 431219 | |
| Sterile Balanced Salt Solution (BSS) | Alcon | 00065079550 | |
| Sterile eye wash | Moore Medical | 75519 | |
| Sterile 0.9% saline | Hospira | 488810 | |
| Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution (0.5%) | Akorn | 17478026312 | |
| Tropicamide Ophthalmic Solution, USP (1%) | Bausch & Lomb | 24208058559 | |
| Phenylepherine Ophtalmic Solution, USP (10%) stock | Bausch & Lomb | 42702010305 | This is used to make 2.5% Phenylepherine |
| Buprenex | Patterson | 433502 | |
| Dexamethasone | APP Pharmaceuticals | 63323051610 | |
| 100% Ethanol | Thermo Scientific | 615090040 | |
| 70% Ethanol | Ricca Chemical Company | 2546.70-5 | |
| Sterile GenTeal Lubricant Eye Gel | Novartis | 78042947 | |
| Sterile Systane Ultra Lubricant Eye Drops | Alcon | 00065143105 | |
| hRPESC-RPE cells | Not available commercially | Please refer to "Reference #12" for cell isolation and mainteinance. | |
| 24-well plates | Corning | 3526 | |
| Conical tubes (15 ml) | Sarstedt | 62554002 | |
| Microcentrifuge cap with o-ring | LPS inc | L233126 | |
| Capless Microcentrifuge tubes (1.7 ml) | LPS inc | L233041 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| Sterile alcohol wipe | McKesson | 58-204 | |
| Sterile cotton tip applicators | McKesson | 24-106-2S | |
| Sterile Weck-Cel spears | Beaver-Visitec International | 0008680 | |
| Sterile surgical drapes | McKesson | 25-515 | |
| Gauze | McKesson | 16-4242 | |
| Nanofil syringe (10 ul) | World Precision Instruments | Nanofil | |
| Nanofil beveled 33-gauge needle | World Precision Instruments | NF33BV-2 | |
| Insulin syringe needles 31-gauge | Becton Dickinson | 328418 | |
| Rat toothed forceps | World Precision Instruments | 555041FT | |
| Vannas Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz | RS-5602 | |
| Circulating water T pump | Stryker | TP700 | |
| Heating pad | Kent Scientific | TPZ-814 | |
| Animal anesthesia system | World Precision Instruments | EZ-7000 | |
| Balance | Ohaus | PA1502 | |
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Microscope light source | Schott | ACE series | |
| Bioptigen Envisu Spectral Domain Ophthalmic Imaging System | Bioptigen | R2210 | |
| Sterile black marker pen | Viscot Industries | 1416S-100 | |
| Miniature measuring scale | Ted Pella Inc | 13623 | |
| Infrared Basking Spot Lamp | EXO-TERRA | PT2144 | This is used as a heating lamp for animals during the post-surgical recovery phase |
Referências
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