Desenvolvimento de um protocolo refinado para Trans-escleral apresentam transplante de células epiteliais de pigmento Retinal humano nos olhos de rato
Summary
Subretinal injeção tem sido amplamente aplicada em estudos pré-clínicos de terapia de reposição de células-tronco para degeneration macular age-related. Neste artigo visualizado, descrevemos uma técnica de injeção subretinal menos arriscado, reproduzíveis e precisamente modificados através da abordagem trans-escleral para entregar as células nos olhos de rato.
Abstract
Doenças degenerativas da retina, como a degeneração macular relacionada à idade (DMRI) são a principal causa de perda de visão irreversível em todo o mundo. AMD é caracterizada por degeneração de células epiteliais pigmento retinal (RPE), que são uma monocamada de células apoiando funcionalmente e anatomicamente, envolvendo em torno da retina neural. Tratamentos farmacológicos atuais para o não-neovascular AMD (AMD seco) apenas retardar a progressão da doença, mas não podem restaurar a visão, necessitando de estudos que visam identificar novas estratégias terapêuticas. Substituindo as células RPE degenerativas com promessa de porões de células saudáveis para tratar DMRI seca no futuro. Extensos estudos pré-clínicos de terapias de substituição de células-tronco para AMD envolvem o transplante de células-tronco derivadas de células de RPE no espaço subretinal de modelos animais, em que é aplicada a técnica de injeção subretinal. A abordagem mais utilizada nestes estudos pré-clínicos de animais é através da rota trans-escleral, que é dificultada pela falta de visualização directa da extremidade da agulha e muitas vezes pode resultar em danos na retina. Uma abordagem alternativa através do vítreo permite a observação direta da posição final da agulha, mas carrega um alto risco de traumas cirúrgicos como mais tecidos oculares são perturbados. Nós desenvolvemos um método modificado injeção trans-escleral menos arriscado e reprodutíveis que usa agulha definidos ângulos e profundidades com êxito e consistentemente fornecer células RPE no espaço subretinal rato e evitar danos excessivos da retina. Células entregadas desta forma tem previamente demonstradas para ser eficaz em ratos Royal College of Surgeons (RCS) pelo menos 2 meses. Esta técnica pode ser usada não só para o transplante de células, mas também para a entrega de pequenas moléculas ou terapias de gene.
Introduction
A retina humana situado na parte traseira as funções do olho como um tecido sensorial leve e desempenha um papel crítico na percepção de visão. Disfunção de células da retina ou morte celular, portanto, causa problemas de visão ou cegueira permanente. Distúrbios envolvendo a degeneração ou disfunção das células nas diferentes camadas da retina são conhecidos como doenças degenerativas da retina, entre os quais a AMD é o tipo mais comum e a principal causa de cegueira irreversível em idosos nos países desenvolvidos 1,2. O processo patológico da AMD é associado com o acúmulo de “drusen” entre a camada RPE e membrana de Bruch a subjacente, que por sua vez prejudica o apoio da RPE da fisiologia fotoreceptor, levando à atrofia da retina neural e perda de visão3, 4,5. Até agora, não existe cura para avançados (não-neovascular) AMD seco. O surgimento da terapia de células-tronco como um novo paradigma na medicina regenerativa traz a esperança de substituir as células RPE disfuncionais ou mortas com células-tronco derivadas de células saudáveis. De fato, estudos pré-clínicos extensivos de transplantar células (por exemplo, células-tronco embrionárias humanas)-tronco-células derivadas de RPE em modelos animais RPE-degenerativas têm sido realizados6,7, alguns dos quais têm progredido para ensaios clínicos8,9 (NCT01344993, ClinicalTrials.gov). Recentemente, uma fonte alternativa de células-tronco residentes na camada RPE humana, as células-tronco humanas RPE (hRPESCs), foi identificada pelo nosso laboratório e está sendo usada atualmente em estudos pré-clínicos de terapia de transplante de celular (hRPESC-RPE) de derivados-RPE hRPESC para AMD 10 , 11 , 12 , 13.
A técnica de injeção subretinal é aplicada nos estudos pré-clínicos mencionados acima por vários grupos, incluindo o nosso grupo. Existem duas abordagens gerais para injeção subretinal em animais: trans-vitreal e trans-escleral. A abordagem trans-vitreal tem a vantagem de ser capaz de observar diretamente o fim da agulha que penetra no olho anterior, cruza a vitreal toda cavidade adjacente à lente e penetra a retina para trás para o olho para alcançar o apresentam o cirurgião espaço de15,de14,16. No entanto, exige perturbar a retina em dois locais (anteriores e posteriores), carrega o risco de danificar a lente e pode resultar em refluxo de células para o vítreo, quando a agulha é recolhida. Em contraste, a abordagem trans-esclera, em princípio, evita envolvimento da retina e vítreo e refluxo sai do olho. Em roedores pigmentadas, o cirurgião pode inicialmente observar a penetração da esclera, mas após a passagem para a coroide pigmentada, o fim da agulha não está visível. Sem observação directa, romper a retina é comum e pode resultar em dissecção da retina e entrega de células e/ou sangue para o vítreo. Além disso, porque a superfície do olho é curvo, é muito difícil saber qual agulha ângulos e profundidades são mais eficazes para a trans-escleral injeções.
Neste artigo visualizado, apresentamos um método de injeção subretinal trans-escleral informado pelo uso de avaliações pós-cirúrgicos com a tomografia de coerência óptica (OCT), que permite um exame detalhado do local da injeção. Nossa técnica de injeção trans-escleral utiliza locais definidos, ângulos e profundidades para agulhas de injeção produzir trauma cirúrgico muito baixo e alta confiabilidade. Aqui, demonstramos especificamente a injeção de células hRPESC-RPE no espaço subretinal do rato RCS, um modelo pré-clínico de AMD humana. Com este método de injeção, com sucesso e consistentemente foram entregues as células hRPESC-RPE no espaço de subretinal olhos de rato RCS com uma taxa de sucesso muito alta. Injeção de células anteriormente foi encontrada para resultar na preservação dos FOTORRECEPTORES RCS pelo menos 2 meses após injeção13. Este procedimento é realizado sob o microscópio de dissecação e é fácil de aprender. Requer duas pessoas (um cirurgião e assistente) para realizar a injeção e o tempo médio de injeção para cada animal é menos de 5 minutos. Os ângulos definidos e profundidades para agulhas de injeção tornam possível para os laboratórios, onde a OCT está indisponível, para alcançar o sucesso injeção subretinal. Ele permite acesso subretinal altamente reprodutível e pode ser usado não só para o transplante de células, mas também para terapias medicamentosas de entrega e gene.
Protocol
Representative Results
Discussion
A técnica de injeção subretinal descrita neste artigo é através da via trans-escleral, onde a agulha do injetor penetra as camadas externas (complexo de esclera-coroide-RPE) da parede do olho, sem prejudicar a retina neural ou perturbar a cavidade vítrea. Uma abordagem alternativa trans-vitreal tem um risco potencial de dano de lente, levando à catarata, desde que a lente dos roedores ocupa a maioria da cavidade vítrea. Comparado a esse método, nossa técnica é menos arriscada e faz com que o mínimo de trauma …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer a Patty Lederman pela sua assistência na cirurgia e Susan Borden para preparação de células RPE. Também reconhecemos a C028504 de NYSTEM de financiamento para este projeto. Justine, d. Miller é suportado pelo NIH grant F32EY025931.
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25200-072 | |
| DNAse I | Sigma | DN-25 | |
| 1xDulbecco’s Phosphate Buffered Saline without Calcium & Magnesium (1xDPBS-CMF) | Corning Cellgro | 431219 | |
| Sterile Balanced Salt Solution (BSS) | Alcon | 00065079550 | |
| Sterile eye wash | Moore Medical | 75519 | |
| Sterile 0.9% saline | Hospira | 488810 | |
| Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution (0.5%) | Akorn | 17478026312 | |
| Tropicamide Ophthalmic Solution, USP (1%) | Bausch & Lomb | 24208058559 | |
| Phenylepherine Ophtalmic Solution, USP (10%) stock | Bausch & Lomb | 42702010305 | This is used to make 2.5% Phenylepherine |
| Buprenex | Patterson | 433502 | |
| Dexamethasone | APP Pharmaceuticals | 63323051610 | |
| 100% Ethanol | Thermo Scientific | 615090040 | |
| 70% Ethanol | Ricca Chemical Company | 2546.70-5 | |
| Sterile GenTeal Lubricant Eye Gel | Novartis | 78042947 | |
| Sterile Systane Ultra Lubricant Eye Drops | Alcon | 00065143105 | |
| hRPESC-RPE cells | Not available commercially | Please refer to "Reference #12" for cell isolation and mainteinance. | |
| 24-well plates | Corning | 3526 | |
| Conical tubes (15 ml) | Sarstedt | 62554002 | |
| Microcentrifuge cap with o-ring | LPS inc | L233126 | |
| Capless Microcentrifuge tubes (1.7 ml) | LPS inc | L233041 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| Sterile alcohol wipe | McKesson | 58-204 | |
| Sterile cotton tip applicators | McKesson | 24-106-2S | |
| Sterile Weck-Cel spears | Beaver-Visitec International | 0008680 | |
| Sterile surgical drapes | McKesson | 25-515 | |
| Gauze | McKesson | 16-4242 | |
| Nanofil syringe (10 ul) | World Precision Instruments | Nanofil | |
| Nanofil beveled 33-gauge needle | World Precision Instruments | NF33BV-2 | |
| Insulin syringe needles 31-gauge | Becton Dickinson | 328418 | |
| Rat toothed forceps | World Precision Instruments | 555041FT | |
| Vannas Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz | RS-5602 | |
| Circulating water T pump | Stryker | TP700 | |
| Heating pad | Kent Scientific | TPZ-814 | |
| Animal anesthesia system | World Precision Instruments | EZ-7000 | |
| Balance | Ohaus | PA1502 | |
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Microscope light source | Schott | ACE series | |
| Bioptigen Envisu Spectral Domain Ophthalmic Imaging System | Bioptigen | R2210 | |
| Sterile black marker pen | Viscot Industries | 1416S-100 | |
| Miniature measuring scale | Ted Pella Inc | 13623 | |
| Infrared Basking Spot Lamp | EXO-TERRA | PT2144 | This is used as a heating lamp for animals during the post-surgical recovery phase |
Referências
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