Desarrollo de un protocolo de refinado para Trans-escleral transplante Subretinal de células epiteliales del pigmento retiniano humano a ojos de rata
Summary
Inyección subretinal se ha aplicado extensamente en estudios preclínicos de terapia de reemplazo de la célula de vástago para la degeneración macular relacionada con la edad. En este artículo visualizado, describimos una técnica de inyección subretinal menos riesgoso, reproducible y exacto modificado vía trans-escleral para entregar las células en los ojos de rata.
Abstract
Enfermedades degenerativas retinianas como la degeneración macular senil (DMS) son la principal causa de pérdida de visión irreversible en todo el mundo. AMD se caracteriza por la degeneración del pigmento retiniano epitelial (RPE) las células, que son una monocapa de células apoyar funcionalmente y anatómicamente envolver alrededor de la retina neural. Tratamientos farmacológicos actuales para la no-neovascular AMD (AMD seco) sólo retrasar la progresión de la enfermedad pero no pueden restaurar la visión, que requiere estudios dirigidos a identificar nuevas estrategias terapéuticas. Reemplazar las células RPE degenerativas con las células sanas tiene promesa para el tratamiento de AMD seco en el futuro. Extensos estudios preclínicos de terapias de reemplazo de la célula de vástago para AMD implican el trasplante de las células RPE derivadas de células madre en el espacio subretinal de modelos animales, en la que se aplica la técnica de inyección subretinal. El enfoque más utilizado en estos estudios preclínicos con animales es a través de la ruta trans-escleral, que es hecha difícil por la falta de visualización directa de la extremo de la aguja y a menudo puede resultar en daño retiniano. Un enfoque alternativo a través del vítreo permite la observación directa de la posición del extremo de la aguja, pero lleva un alto riesgo de traumas quirúrgicos como son disturbados más tejidos del ojo. Hemos desarrollado un método de inyección trans-escleral modificada menos arriesgado y reproducibles que utiliza aguja definidos ángulos y profundidades con éxito y siempre entregar las células RPE en el espacio subretinal de rata y evitar excesivo daño retiniano. Las células entregadas de esta manera se han demostrado previamente ser eficaz en la rata del Royal College of Surgeons (RCS) por al menos 2 meses. Esta técnica puede utilizarse no sólo para la célula, sino también para la entrega de pequeñas moléculas o terapias genéticas.
Introduction
La retina humana situada en la parte posterior de las funciones del ojo como un tejido sensorial ligero y juega un papel fundamental en la percepción de la visión. Disfunción de las células retinianas o muerte de la célula por lo tanto causa problemas de visión o ceguera permanente. Enfermedades que implican degeneración o disfunción de las células en distintas capas de la retina se conocen como enfermedades retinianas degenerativas, entre las que AMD es el tipo más común y la principal causa de ceguera irreversible en los ancianos en los países desarrollados 1,2. El proceso patológico de AMD está asociado con la acumulación de “drusen” entre la capa del EPR y membrana de Bruch subyacente, lo que deteriora a su vez apoyo RPE de la fisiología del fotorreceptor, llevando a la atrofia de retina neural y de pérdida de visión3, 4,5. Hasta el momento, no existe cura para secar (no-neovascular) AMD. La aparición de la terapia de la célula de vástago como un nuevo paradigma en medicina regenerativa trae la esperanza de reemplazar las células RPE disfuncionales o muertas con células madre derivadas de células sanas. De hecho, estudios preclínicos de trasplante células (p. ej., células madre embrionarias) madre-derivado las células RPE en modelos animales RPE-degenerativas han sido realizados6,7, algunas de las cuales han progresado a ensayos clínicos8,9 (NCT01344993, ClinicalTrials.gov). Recientemente, una fuente alternativa de células madre residentes en la capa de EPR humana, las células RPE humanas (hRPESCs), fue identificada por nuestro laboratorio y en la actualidad se está utilizando en estudios preclínicos de terapia de trasplante de células (hRPESC-RPE) de RPE derivadas de hRPESC para AMD 10 , 11 , 12 , 13.
La técnica de inyección subretinal es aplicada en los estudios preclínicos mencionados por varios grupos, incluyendo nuestro grupo. Hay dos enfoques generales para la inyección subretinal en animales: trans-vitreal y trans-escleral. El enfoque trans-vitreal tiene la ventaja del cirujano pudiendo observar directamente el extremo de la aguja penetra el ojo anterior, cruza la cavidad vitreal todo junto a la lente y penetra en la retina en la parte posterior del ojo para llegar a la subretinal espacio14,15,16. Sin embargo, requiere interrumpir la retina en dos ubicaciones (anteriores y posteriores), conlleva el riesgo de dañar la lente y puede resultar en reflujo de células en el vítreo cuando la aguja se retrae. En contraste, el enfoque trans-esclerótica, en principio, evita la participación de la retina y vítreo y reflujo sale del ojo. En roedores pigmentados, el cirujano puede observar inicialmente penetración de la esclerótica, pero después paso a la coroides pigmentada, el extremo de la aguja ya no es visible. Sin observación directa, rompiendo la retina es común y puede producir disección retiniana y entrega de las células o sangre en el vítreo. Por otra parte, porque se curva la superficie del ojo, es muy difícil saber que aguja ángulos y profundidades son más eficaces para las inyecciones de trans-escleral.
En este artículo visualizado, presentamos un método de inyección subretinal trans-escleral por el uso de las evaluaciones post-quirúrgicos con tomografía de coherencia óptica (OCT), que permite un examen detallado del sitio de inyección. Nuestra técnica de inyección trans-escleral utiliza ubicaciones definidas, ángulos y profundidades de agujas de inyección producir trauma quirúrgico muy bajo y alta confiabilidad. Aquí, demostramos específicamente la inyección de las células de RPE hRPESC en el espacio subretinal de la rata RCS, un modelo preclínico de AMD humana. Con este método de inyección, con éxito y siempre entregamos las células RPE hRPESC en el espacio subretinal de ojos de ratas RCS con una tasa de éxito muy alta. Inyección de células fue encontrada para resultar en la preservación de los fotorreceptores RCS por lo menos 2 meses después de la inyección13. Este procedimiento se realiza con el microscopio de disección y es fácil de aprender. Se requieren dos personas (un cirujano y un ayudante) para realizar la inyección y el tiempo promedio de inyección para cada animal es menos de 5 minutos. Los ángulos definidos y profundidad para agujas de inyección hace posible para los laboratorios, donde el OCT está disponible, para lograr éxito inyección subretinal. Permite acceso subretinal altamente reproducible y puede ser utilizado no sólo para la célula, sino también de drogas entrega y gene terapias.
Protocol
Representative Results
Discussion
La técnica de inyección subretinal en este artículo es a través de la vía trans-escleral, donde la aguja del inyector penetra en las capas externas (complejo de esclera-coroides-RPE) de la pared del ojo sin dañar la retina neural o molestar a la cavidad vítrea. Un enfoque alternativo trans-vitreal tiene un riesgo potencial de daño de la lente hacia la catarata, ya que el lente de los roedores ocupa la mayor parte de la cavidad vítrea. En comparación con este método, nuestra técnica es menos riesgoso y causa t…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Queremos agradecer su ayuda en la cirugía y Susan Borden para la preparación de células RPE Patty Lederman. También reconocemos NYSTEM C028504 para la financiación de este proyecto. Justine D. Miller es apoyado por los NIH grant F32EY025931.
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25200-072 | |
| DNAse I | Sigma | DN-25 | |
| 1xDulbecco’s Phosphate Buffered Saline without Calcium & Magnesium (1xDPBS-CMF) | Corning Cellgro | 431219 | |
| Sterile Balanced Salt Solution (BSS) | Alcon | 00065079550 | |
| Sterile eye wash | Moore Medical | 75519 | |
| Sterile 0.9% saline | Hospira | 488810 | |
| Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution (0.5%) | Akorn | 17478026312 | |
| Tropicamide Ophthalmic Solution, USP (1%) | Bausch & Lomb | 24208058559 | |
| Phenylepherine Ophtalmic Solution, USP (10%) stock | Bausch & Lomb | 42702010305 | This is used to make 2.5% Phenylepherine |
| Buprenex | Patterson | 433502 | |
| Dexamethasone | APP Pharmaceuticals | 63323051610 | |
| 100% Ethanol | Thermo Scientific | 615090040 | |
| 70% Ethanol | Ricca Chemical Company | 2546.70-5 | |
| Sterile GenTeal Lubricant Eye Gel | Novartis | 78042947 | |
| Sterile Systane Ultra Lubricant Eye Drops | Alcon | 00065143105 | |
| hRPESC-RPE cells | Not available commercially | Please refer to "Reference #12" for cell isolation and mainteinance. | |
| 24-well plates | Corning | 3526 | |
| Conical tubes (15 ml) | Sarstedt | 62554002 | |
| Microcentrifuge cap with o-ring | LPS inc | L233126 | |
| Capless Microcentrifuge tubes (1.7 ml) | LPS inc | L233041 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| Sterile alcohol wipe | McKesson | 58-204 | |
| Sterile cotton tip applicators | McKesson | 24-106-2S | |
| Sterile Weck-Cel spears | Beaver-Visitec International | 0008680 | |
| Sterile surgical drapes | McKesson | 25-515 | |
| Gauze | McKesson | 16-4242 | |
| Nanofil syringe (10 ul) | World Precision Instruments | Nanofil | |
| Nanofil beveled 33-gauge needle | World Precision Instruments | NF33BV-2 | |
| Insulin syringe needles 31-gauge | Becton Dickinson | 328418 | |
| Rat toothed forceps | World Precision Instruments | 555041FT | |
| Vannas Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz | RS-5602 | |
| Circulating water T pump | Stryker | TP700 | |
| Heating pad | Kent Scientific | TPZ-814 | |
| Animal anesthesia system | World Precision Instruments | EZ-7000 | |
| Balance | Ohaus | PA1502 | |
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Microscope light source | Schott | ACE series | |
| Bioptigen Envisu Spectral Domain Ophthalmic Imaging System | Bioptigen | R2210 | |
| Sterile black marker pen | Viscot Industries | 1416S-100 | |
| Miniature measuring scale | Ted Pella Inc | 13623 | |
| Infrared Basking Spot Lamp | EXO-TERRA | PT2144 | This is used as a heating lamp for animals during the post-surgical recovery phase |
Referências
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