Ontwikkeling van een verfijnde Protocol voor Trans-scleral Subretinal transplantatie van menselijke retinale Pigment epitheliale cellen in de ogen van de Rat
Summary
Subretinal injectie is veel toegepast in preklinische studies van stamcel substitutietherapie voor leeftijdsgebonden maculaire degeneratie. In dit gevisualiseerde artikel beschrijven we een minder riskant, reproduceerbaar zijn en juist gewijzigd subretinal injectietechniek via de trans-scleral-benadering te leveren van cellen in de ogen van de rat.
Abstract
Degeneratieve retinale ziekten zoals leeftijdsgebonden Macula Degeneratie (AMD) zijn de belangrijkste oorzaak van onomkeerbaar gezichtsverlies wereldwijd. AMD wordt gekenmerkt door de degeneratie van retinale pigment epitheliale (RPE) cellen, die een monolayer van cellen functioneel ondersteunen en anatomisch verpakken rond het neurale netvlies. Huidige farmacologische behandelingen voor de niet-neovascular AMD (droge AMD) alleen vertragen de progressie van de ziekte maar niet herstellen visie, vergend studies gericht op het identificeren van nieuwe therapeutische strategieën. De degeneratieve RPE cellen vervangen door gezonde cellen houdt belofte voor de behandeling van droge AMD in de toekomst. Uitgebreide Preklinische studies van stamcel vervangende therapieën voor AMD betrekken de transplantatie van stamcellen cel afkomstige RPE cellen in de subretinal ruimte van diermodellen, waarin de subretinal injectietechniek wordt toegepast. De meest gebruikte in deze preklinische dierstudies aanpak is door middel van de trans-scleral route, die wordt bemoeilijkt door het ontbreken van directe visualisatie van het einde van de naald en kan vaak leiden tot retinale schade. Een alternatieve benadering via het glasvocht zorgt voor directe waarneming van de naald oorspronkelijke eindpositie ligt, maar het draagt een hoog risico van chirurgische trauma’s zoals meer oog weefsels worden verstoord. We hebben een minder riskant en reproduceerbare methode van gemodificeerde trans-scleral injectie die gebruikmaakt van gedefinieerde naald hoeken en diepten succesvol en consequent leveren RPE cellen in de rat subretinal ruimte en Vermijd sterke netvlies beschadiging ontwikkeld. Cellen die zijn geleverd op deze manier hebben eerder aangetoond doeltreffend in de Royal College of Surgeons (RCS) rat gedurende ten minste 2 maanden. Deze techniek kan worden gebruikt, niet alleen voor cel transplantatie, maar ook voor de levering van kleine moleculen of gentherapieën.
Introduction
Het menselijke netvlies gelegen aan de achterzijde van het oog-functies als een lichte zintuiglijke weefsel en speelt een cruciale rol in de perceptie van de visie. Netvlies cel dysfunctie of celdood daarom veroorzaakt visie problemen of permanente blindheid. Aandoeningen waarbij degeneratie of disfunctie van cellen in verschillende lagen van het netvlies staan bekend als retinale degeneratieve ziekten, waaronder AMD de meest voorkomende en de belangrijkste oorzaak van onomkeerbare blindheid bij ouderen in ontwikkelde landen is 1,2. Het pathologisch proces van LMD wordt geassocieerd met “drusen” accumulatie tussen de RPE-laag en de onderliggende Bruch membraan, dat op zijn beurt RPE steun van fotoreceptor fysiologie schaadt, wat leidt tot neurale atrofie van het retinale en visie verlies3, 4,5. Tot dusver is er geen remedie voor geavanceerde droge AMD (niet-neovascular). De opkomst van stamcel therapie als een nieuw paradigma in regeneratieve geneeskunde brengt de hoop de disfunctionele of dode RPE cellen te vervangen door gezonde cellen afgeleid van stamcellen. Sterker nog, uitgebreide Preklinische studies van verplanten stamcellen (b.v., menselijke embryonale stamcellen)-afgeleide cellen RPE RPE-degeneratieve diermodellen geweest uitgevoerd6,7, waarvan sommige hebben stapte over naar de klinische proeven8,9 (NCT01344993, ClinicalTrials.gov). Onlangs, een alternatieve bron van stamcellen die inwoner in de menselijke RPE laag, de menselijke RPE stamcellen (hRPESCs), door onze lab werd geïdentificeerd en wordt momenteel gebruikt in preklinische studies van hRPESC afgeleid-RPE cel (hRPESC-RPE) transplantatie therapie voor AMD 10 , 11 , 12 , 13.
De subretinal injectietechniek wordt toegepast in de preklinische studies die hierboven vermeld door meerdere groepen, met inbegrip van onze fractie. Er zijn twee algemene benaderingen voor subretinal injectie in dieren: trans-vitreal en trans-scleral. De trans-vitreal-aanpak heeft het voordeel van de chirurg zijnde kundig voor het einde van de naald direct observeren doordringt het anterior oog staat, kruist de hele vitreal holte grenzend aan de lens, en dringt het netvlies aan de achterkant met het oog op het bereiken van de subretinal ruimte14,15,16. Nochtans, vereist het verstoren van het netvlies op twee locaties (anterior en posterior), draagt het risico van beschadiging van de lens, en kan resulteren in terugvoer van cellen in het glasvocht wanneer de naald wordt teruggetrokken. In tegenstelling, de trans-sclera-benadering, in principe, vermijdt betrokkenheid van de retina en glasvocht en terugvoer verlaat het oog. In gepigmenteerde knaagdieren, de chirurg kan aanvankelijk penetratie van de sclera observeren, maar na de passage in de gepigmenteerde vaatvlies, het einde van de naald is niet meer zichtbaar. Zonder directe observatie, overtredingen van het netvlies is gebruikelijk en kan leiden tot retinale dissectie en levering van cellen en/of bloed in het glasvocht. Bovendien, omdat het oog oppervlak is gebogen, het is zeer moeilijk om te weten welke naald hoeken en diepten zijn het meest effectief voor trans-scleral injecties.
In dit gevisualiseerde artikel introduceren we een methode van de trans-scleral subretinal injectie op de hoogte gebracht door het gebruik van post chirurgische evaluaties met optische coherentie tomografie (OCT), waarmee een gedetailleerd onderzoek van de injectieplaats. Onze trans-scleral injectietechniek maakt gebruik van gedefinieerde locaties, hoeken en diepten voor injectie naalden tot zeer lage chirurgisch trauma en hoge betrouwbaarheid. Hier tonen we specifiek de injectie van hRPESC-RPE cellen in de subretinal ruimte van de RCS rat, een pre-klinische model van menselijke AMD. Met deze methode injectie verlost we succesvol en consequent hRPESC-RPE cellen in de subretinal ruimte van RCS rat ogen met een zeer hoog slagingspercentage. Injectie van cellen bleek eerder leiden tot behoud van de RCS-researchdieren ten minste 2 maanden na injectie13. Deze procedure wordt uitgevoerd onder de Microscoop ontleden en is eenvoudig te leren. Het vereist twee mensen (een chirurg en een assistent) voor het uitvoeren van de injectie en de gemiddelde tijd van injectie voor elk dier is minder dan 5 minuten. De gedefinieerde hoeken en diepten voor injectie naalden maken het mogelijk voor laboratoria, waar OCT niet beschikbaar is, om succesvolle subretinal injectie. Het zorgt voor zeer reproduceerbaar subretinal toegang en kan worden gebruikt, niet alleen voor cel transplantatie, maar ook voor drug delivery en gen-therapieën.
Protocol
Representative Results
Discussion
De subretinal injectietechniek afgebeeld in dit artikel is via de trans-scleral weg, waar de injector naald de buitenlagen van de muur van het oog (sclera-vaatvlies-RPE complex doordringt) zonder nadelige gevolgen voor de neurale retina of het glasvocht holte verstoren. Een alternatieve trans-vitreal-aanpak heeft een potentieel risico van lens schade leidt tot cataract, aangezien knaagdieren lens het grootste deel van het glasvocht holte beslaat. Vergeleken met deze methode, onze techniek is minder riskant en minimale tr…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij willen Patty Lederman bedanken voor haar hulp bij de chirurgie en Susan Borden RPE cel voorbereiding. We erkennen ook NYSTEM C028504 voor de financiering voor dit project. Justine D. Miller wordt ondersteund door de NIH grant F32EY025931.
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25200-072 | |
| DNAse I | Sigma | DN-25 | |
| 1xDulbecco’s Phosphate Buffered Saline without Calcium & Magnesium (1xDPBS-CMF) | Corning Cellgro | 431219 | |
| Sterile Balanced Salt Solution (BSS) | Alcon | 00065079550 | |
| Sterile eye wash | Moore Medical | 75519 | |
| Sterile 0.9% saline | Hospira | 488810 | |
| Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution (0.5%) | Akorn | 17478026312 | |
| Tropicamide Ophthalmic Solution, USP (1%) | Bausch & Lomb | 24208058559 | |
| Phenylepherine Ophtalmic Solution, USP (10%) stock | Bausch & Lomb | 42702010305 | This is used to make 2.5% Phenylepherine |
| Buprenex | Patterson | 433502 | |
| Dexamethasone | APP Pharmaceuticals | 63323051610 | |
| 100% Ethanol | Thermo Scientific | 615090040 | |
| 70% Ethanol | Ricca Chemical Company | 2546.70-5 | |
| Sterile GenTeal Lubricant Eye Gel | Novartis | 78042947 | |
| Sterile Systane Ultra Lubricant Eye Drops | Alcon | 00065143105 | |
| hRPESC-RPE cells | Not available commercially | Please refer to "Reference #12" for cell isolation and mainteinance. | |
| 24-well plates | Corning | 3526 | |
| Conical tubes (15 ml) | Sarstedt | 62554002 | |
| Microcentrifuge cap with o-ring | LPS inc | L233126 | |
| Capless Microcentrifuge tubes (1.7 ml) | LPS inc | L233041 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| Sterile alcohol wipe | McKesson | 58-204 | |
| Sterile cotton tip applicators | McKesson | 24-106-2S | |
| Sterile Weck-Cel spears | Beaver-Visitec International | 0008680 | |
| Sterile surgical drapes | McKesson | 25-515 | |
| Gauze | McKesson | 16-4242 | |
| Nanofil syringe (10 ul) | World Precision Instruments | Nanofil | |
| Nanofil beveled 33-gauge needle | World Precision Instruments | NF33BV-2 | |
| Insulin syringe needles 31-gauge | Becton Dickinson | 328418 | |
| Rat toothed forceps | World Precision Instruments | 555041FT | |
| Vannas Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz | RS-5602 | |
| Circulating water T pump | Stryker | TP700 | |
| Heating pad | Kent Scientific | TPZ-814 | |
| Animal anesthesia system | World Precision Instruments | EZ-7000 | |
| Balance | Ohaus | PA1502 | |
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Microscope light source | Schott | ACE series | |
| Bioptigen Envisu Spectral Domain Ophthalmic Imaging System | Bioptigen | R2210 | |
| Sterile black marker pen | Viscot Industries | 1416S-100 | |
| Miniature measuring scale | Ted Pella Inc | 13623 | |
| Infrared Basking Spot Lamp | EXO-TERRA | PT2144 | This is used as a heating lamp for animals during the post-surgical recovery phase |
Referências
- De Jong, P. T. Age-related macular degeneration. N Engl J Med. 355, 1474-1485 (2006).
- Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. Lancet Global Health. 2 (2), e106-e116 (2014).
- Ambati, J., Fowler, B. J. Mechanisms of agerelated macular degeneration. Neuron. 75, 26-39 (2012).
- Abdelsalam, A., Del Priore, L. V., Zarbin, M. A. Drusen in age-related macular degeneration: Pathogenesis, natural course, and laser photocoagulation-induced regression. Surv Ophthalmol. 44 (1), 1-29 (1999).
- Jager, R. D., Mieler, W. F., Miller, J. W. Age-related macular degeneration. N Engl J Med. 358 (24), 2606-2617 (2008).
- Lund, R. D., et al. Human embryonic stem cell-derived cells rescue visual function in dystrophic RCS rats. Cloning Stem Cells. 8 (3), 189-199 (2006).
- Vugler, A., et al. Embryonic stem cells and retinal repair. Mech Dev. 124 (11-12), 807-829 (2007).
- Schwartz, S. D., et al. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).
- Schwartz, S. D., et al. Human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium in patients with age-related macular degeneration and Stargardt’s macular dystrophy: follow-up of two open-label phase 1/2 studies. Lancet. 385 (9967), 509-516 (2015).
- Stanzel, B. V., et al. Human RPE Stem Cells Grown into Polarized RPE Monolayers on a Polyester Matrix Are Maintained after Grafting into Rabbit Subretinal Space. Stem Cell Reports. 2 (1), 64-77 (2014).
- Blenkinsop, T. A., et al. Human adult retinal pigment epithelial stem cell-derived RPE monolayers exhibit key physiological characteristics of native tissue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (12), 7085-7099 (2015).
- Salero, E., et al. Adult human RPE can be activated into a multipotent stem cell that produces mesenchymal derivatives. Cell Stem Cell. 10 (1), 88-95 (2012).
- Davis, J. R., et al. Human RPE Stem Cell-Derived RPE Preserves Photoreceptors in the Royal College of Surgeons Rat: Method for Quantifying the Area of Photoreceptor Sparing. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 32 (5), 304-309 (2016).
- Westenskow, P. D., et al. Performing Subretinal Injections in Rodents to Deliver Retinal Pigment Epithelium Cells in Suspension. J Vis Exp. (95), e52247 (2015).
- Lopez, R., et al. Transplanted Retinal Pigment Epithelium Modifies the Retinal Degeneration in the RCS Rat. Invest Ophthalmol Vis Sci. 30 (3), 586-588 (1989).
- Eberle, D., Santos-Ferreira, T., Grahl, S., Ader, M. Subretinal Transplantation of MACS Purified Photoreceptor Precursor Cells into the Adult Mouse Retina. J Vis Exp. (84), e50932 (2014).
- Nair, G., et al. Effects of Common Anesthetics on Eye Movement and Electroretinogram. Doc Ophthalmol. 122 (3), 163-176 (2011).
- McGill, T. J., et al. Transplantation of human central nervous system stem cells – neuroprotection in retinal degeneration. Eur J Neurosci. 35, 468-477 (2012).
- Al-Hussaini, H., Kam, J. H., Vugler, A., Semo, M., Jeffery, G. Mature retinal pigment epithelium cells are retained in the cell cycle and proliferate in vivo. Mol Vis. 14, 1784-1791 (2008).
- Wang, S., Lu, B., Wood, P., Lund, R. D. Grafting of ARPE-19 and Schwann Cells to the Subretinal Space in RCS Rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (7), 2552-2560 (2005).
- Fabian, R. J., Bond, J. M., Drobeck, H. P. Induced corneal opacities in the rat. Br J Ophthalmol. 51 (2), 124-129 (1967).
