Abstract
Monolag cellekultur ikke tilstrækkeligt model in vivo adfærd af væv, der involverer komplekse celle-celle- og celle-matrix-interaktioner. Tre-dimensionelle (3D) cellekultur teknikker er en ny opfindelse udviklet til at tage manglerne ved klæbende cellekultur. Mens flere teknikker til generering væv analoger in vitro er blevet udviklet, er disse metoder ofte komplekse, dyre at etablere, kræver specialiseret udstyr, og er generelt begrænset af kompatibiliteten med kun visse celletyper. Her beskriver vi en hurtig og fleksibel protokol til aggregering celler i multicellulære 3D sfæroider af ensartet størrelse, der er kompatibel med væksten af en række af tumorvæv og normalt cellelinier. Vi udnytter varierende koncentrationer af serum og methylcellulose (MC) at fremme forankringsuafhængig sfæroide generation og forhindre dannelsen af cellemonolag i en meget reproducerbar måde. Optimale forhold for individual cellelinier kan opnås ved at justere MC eller serumkoncentrationer i klumpformet dannelse medium. 3D sfæroider genererede kan opsamles til brug i en lang række applikationer, herunder cellesignalering eller genekspression studier, kandidat lægemiddelscreening, eller i studiet af cellulære processer, såsom tumorcelleinvasion og migration. Protokollen er også let tilpasses til at generere klonale sfæroider fra enkelte celler, og kan tilpasses til at vurdere forankringsuafhængig vækst og anoikis-resistens. Samlet set vores protokol giver en let modificerbar fremgangsmåde til generering og anvendelse af 3D-celle sfæroider for at rekapitulere 3D mikromiljø af væv og modellere in vivo væksten af normale og tumorceller.
Introduction
Biologisk relevant vurdering af tumorcelle adfærd er udfordrende brug af traditionelle todimensionale (2D) cellekultur metoder, dels fordi disse ikke i tilstrækkelig grad afspejler celle mikromiljø fundet in vivo. Alternative fremgangsmåder inkorporerer ekstracellulære matrixkomponenter i kulturen (f.eks Boyden kammer assays) er mere fysiologisk repræsentant for in vivo vævsmiljø. Imidlertid kan de være begrænset til vurdering af den individuelle celle adfærd, og ikke rekapitulere komplekset in vivo kombinationer af celle-matrix og celle-celle-vekselvirkninger, der bidrager til væv eller tumorvækst 1, 2, 3.
Anvendelsen af multicellulære sfæroider er en nyere fremgangsmåde, der mere præcist gengiver kompakt arkitektur in vivo cellevækst 1,Fire. Sfæroider kan anvendes til at undersøge celle-matrix interaktioner af normale celler, men kan også fungere som tumor-analoger med model karakteristika tumorprogression, såsom metastatisk vækst eller medikamentresistens 4.
Sfæroider kan dannes ved spredning af enkeltceller indlejret i en matrix 5, eller hurtigere, ved at fremme aggregeringen af flere celler til dannelse af en enkelt celle klynge (f.eks hængende dråbe, centrifugering metoder) 6, 7. Eksisterende celle aggregeringsteknikker kan kræve kostbare materialer eller specialiseret udstyr. Desuden har disse sfæroider har en bred vifte af størrelser og morfologier og kan være vanskelige at fremstille i store mængder, hvilket gør sammenligninger mellem vækstbetingelser eller behandlinger vanskelige. Endelig kan sfæroider genereres af disse metoder være vanskeligt at isolere fra det proteinholdige extracellastet, matrix, hvori de er indlejret til anvendelse i andre applikationer.
Her beskriver vi en robust og let modificerbar celleaggregering metode til hurtig dannelse af i samme størrelse celle sfæroider anvendelse af kommercielt tilgængelige U-bundede celle-afvisende plader og et inert adhæsionsfremmende matrix, methylcellulose. Når det er dannet, er disse multicellulære sfæroider let isoleres til anvendelse i en lang række applikationer. Protokollen er også nemt tilpasses til at generere sfæroider gennem celleproliferation, som kan anvendes til at vurdere andre celleprocesser. Her viser vi celleinvasion assays, kvantificeret ved immunfluorescensfarvning og en anoikis assay, som eksempel anvendelser af disse to forskellige klumpformet dannelse protokoller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Alle reagenser og hjælpematerialer er opført på listen Materials.
1. Sfæroide Produktion af Cell Aggregation
- Methylcelluloseopløsning: fremstilling af 100 ml af 100 mg / ml methylcellulose.
- Heat 50 ml ultrarent H2O til 80 ° C. Tilsæt 10 g methylcellulose pulver og omrør indtil partikler er jævnt fordelt.
- Bring til endelige volumen med koldt ultrarent H2O og omrør ved 4 ° C, indtil opløsningen bliver klar, halm farvet, og indeholder ingen synlige faste stoffer.
- Passere gennem et 0,45 um filter til fjernelse af uopløste faste stoffer. Tilberedte opløsning kan alikvoteret og opbevaret ved 4 ° C i op til 12 måneder.
BEMÆRK: Methylcellulose fungerer som en ikke-cytotoksisk, indifferent, suspenderingsmiddel at øge celle-celle-adhæsion og modvirke dannelsen af en adhærent celle monolag. Methylcellulose er vandopløseligt og kan vaskes væk efter SphereOID generation.
- Klumpformet dannelse medium
BEMÆRK: Forbered klumpformet dannelse medium umiddelbart før brug. Må ikke opbevares.- Fortyndet methylcelluloseopløsning til 1-5 mg / ml i den passende dyrkningsmedium.
- Passere gennem et 0,22 um filter til sterilisering og fjerne uopløste faste stoffer.
- Dulbeccos phosphatbufret saltvand (PBS)
- Fortynd til 1x og passere gennem et 0,45 um filter før brug. Tilberedte opløsning kan opbevares i ubegrænset tid ved stuetemperatur.
- Celle klumpformet produktion (figur 1)
BEMÆRK: Forbered alle reagenser på forhånd. Det er vigtigt at undgå forurening af opløsninger af støv, fibre eller andre uopløselige partikler. Tilstedeværelsen af disse forurenende stoffer vil påvirke klumpformet formation. Dyrkningsmedium og andre opløsninger bør ledes gennem et 0,45 um filter til fjernelse af disse partikler, når posligt. Undgå brug af bomuld-filtrerede pipetter ved overførsel løsninger, da disse kan indføre yderligere fibre.- Kultur cellemonolag til 70% konfluens i passende dyrkningsmedium suppleret med 10% serum. Aspirer dyrkningsmedium og skyl med 1x PBS til fjerne debris. Tilsæt 3 ml trypsin-EDTA (0,05% trypsin) dissociation buffer til en 10 cm celledyrkningsskål, og inkuberes celler ved 37 ° C og 5% CO2.
- Undersøg celler under mikroskop ved 10X forstørrelse for at bekræfte løsrivelse. Neutraliser dissociation buffer med 7 ml serum-suppleret dyrkningsmedium.
- Centrifuge celle suspension ved 500 xg i 10 min til forsigtigt pellet celler.
- Fjern supernatanten. Resuspender cellepelleten i 1 ml klumpformet dannelse medium ved anvendelse af en P1000 pipette med et filter tip.
BEMÆRK: Cellesuspensionen bør være fri for klumper.- At udriv cellepelleten trykke pipettespidsen mod bunden af røret i en lille vinkel, menspipettering for forskydnings- cellepellet. Undgå findeling mere end 3 - 5 gange, da dette kan skade cellerne. Pipette langsomt og ikke udvise hele indholdet af pipettespidsen at undgå at skabe bobler.
- Tæl celler under anvendelse af et hæmocytometer og fortyndet cellesuspension til 1 x 10 4 celler / ml.
BEMÆRK: Cellen nummer kan optimeres til at generere sfæroider af varierende størrelser. Trypan blåfarvning af beskadigede celler kan anvendes til at bekræfte levedygtigheden af resuspenderede celler. - Overførsel cellesuspension til en steril, støvfri multikanalpipette reservoiret og bruge filterspidser at dispensere 100 uL i hver brønd i en 96-brønds U-bundet celle-frastødende plade.
- Skyl beholderen med filtreret ultrarent H2O for at fjerne støv og fibre.
- Bland cellesuspensionen periodisk mens podning at forhindre celler i at sætte sig på bunden af reservoiret. For at undgå at skabe bobler, bruge en omvendt pipetteringsteknik mens blanding og dispensing.
- Overførselsplader til vævsdyrkningsinkubator (37 ° C og 5% CO2) og inspicere dagligt for sfæroide formation. Celler bør sedimentere til bunden af hver brønd inden for 6 timer og generelt aggregere til en sfæroid inden for 24-48 timer (figur 2).
- For bekræftelse af succesfuld kugleformet dannelse, brug en p10 spids og forsigtigt pipetteres medium over klumpformet under iagttagelse under et mikroskop ved 10X forstørrelse. Korrekt dannede sfæroider vil løsne fra pladen and roll, bekræfter deres 3D struktur.
BEMÆRK: Methyl cellulose og serumkoncentrationer bør bestemmes ved titrering for hver cellelinje at give dannelse af en enkelt klumpformet per brønd. Betingelser optimeret på denne måde for udvalgte cellelinier er vist i tabel 1, og eksempler på sfæroiderne dannet i figur 2B. Sfæroider kan dyrkes i længere tid end angivet, men efterhånden som de bliver større de vokser progressivt vanskeligereat håndtere uden fragmentering. Hvis celler danner et monolag, satellit sfæroider, eller undlader at afregne til bunden af brønden, kan være nødvendigt at yderligere justeret for optimal klumpformet dannelse (figur 3B) koncentrationen af methyl cellulose og serum. Brug ikke sfæroider indeholder forurenende stoffer såsom fibre eller støv (figur 3A). Prædannet sfæroider kan behandles med forbindelser af interesse såsom vækstfaktorer, levende celle pletter eller inhibitorer til analyse.
2. Sfæroide Invasion Assay (figur 4)
- neutraliseret kollagen
- Cool alle væsker til 4 ° C og hold på is, når der arbejdes med kollagen for at forhindre uønsket polymerisation.
- Forbered friske 0,1 M og 0,01 M opløsninger af natriumhydroxid og frisk 0,1 M HCI i ultrarent H2O Pass alle løsninger gennem 0,22 um filtre.
- Bland bovint type 1 collagen (3,1 mg / ml stamopløsning), 0,01 M NaOH og 10x PBS (8: 1: 1 volumenforhold) og juster til pH 7,4 med kold 0,1 M NaOH og HCI. Slutkoncentrationen af collagen er 2,5 mg / ml.
- Forbered nok neutraliseret collagen til at fylde den billeddannende fartøj til en dybde på 2-3 mm. Et minimum af 100 pi er påkrævet for hver brønd i 8-brønds vævskulturplade kammer slide anført i Materialer List.
- Embedding sfæroider i collagen (figur 4)
- Coat bunden af hver brønd af en 8-brønds vævskulturplade kammer objektglas med et minimum af 50 pi neutraliserede collagen.
- Brug omvendt pipettering teknik til at undgå at skabe bobler i collagen. Brug pipettespidsen at sprede collagen jævnt over brøndens overflade.
BEMÆRK: Denne kollagen bundlag vil holde sfæroider i suspension og er typisk 1-2 mm tyk. Basislaget minimerer dannelsen af en menisk på den øvre collagenlag. Hvis basislaget er for tyndt, kan sfæroider komme i kontakt med bunden af kammeret slide ogdanner et cellemonolag.
- Brug omvendt pipettering teknik til at undgå at skabe bobler i collagen. Brug pipettespidsen at sprede collagen jævnt over brøndens overflade.
- Placer kammeret slide, og en 35 mm vævskulturskål fyldt med ultrarent H2O, i en 10 cm vævskulturskål. Der inkuberes ved 37 ° C, indtil kollagen polymeriseres, typisk 1 time. Store resterende neutraliseret collagen på is.
BEMÆRK: vandfyldte 35 mm skål vil give fugt og forhindre udtørring. Kammeret slide bør forblive i dette fugtigt kammer i hele assayet. Kollagenet basislaget kan overlades til polymerisere natten over. Længere inkubationer resulterer typisk i en mere stiv gel. - Ved hjælp af en p1,000 filter tip, indsamle præformede sfæroider (trin 1.4.7) fra 96-brønds U-bundet celle-afvisende plade i 1,5 ml snap toprør. Pipette langsomt og undgå gentagen eller kraftig pipettering at minimere fluid-forskydning af sfæroider. Flere sfæroider kan samles i et enkelt rør til overførsel til en brønd i 8-brønds vævskulturplade kammer slide.
- Centrifuger de indsamlede sphæroider i en tabletop mikrocentrifuge ved 2.000 xg i 2-5 s og fjern supernatanten under anvendelse af en p200 pipette. Undgå centrifugering i længere tid end nødvendigt, da dette kan medføre sfæroiderne til at bryde fra hinanden eller klumper sig sammen.
BEMÆRK: Efter pipettering det meste af supernatanten, røret kan vendes forsigtigt over en ren papirserviet for at væge overskydende væske væk. Lad ikke sphæroider at tørre. - Ved hjælp af en bred boring p200 tip, forsigtigt resuspender sfæroider i 50 pi neutraliserede collagen. Gør dette for hvert rør af indsamlede sfæroider før eventuelle sfæroider overføres ind i kammeret dias. Hold sfæroider, der er blevet resuspenderes i neutraliseret collagen på is indtil den er klar til overførsel til kammeret dias.
- Fjern kammer dias fra inkubatoren og omhyggeligt pipette sfæroiden-collagen blanding på toppen af kollagen bundlag. Der inkuberes ved 37 ° C og 5% CO2, indtil collagen polymeriseres.
- Må ikke dispensere hele indholdet af pipette at undgå at skabe bobler. Dropwise pipettering mindsker chancerne for at forstyrre kollagen bundlag.
- Tilsæt langsomt mindst 100 pi opvarmet dyrkningsmedium indeholdende ønskede kemoattraktanter, inhibitorer eller andre behandlinger til hver brønd af kammeret slide. Kollagenlaget indeholdende sfæroider kan rive hvis væske pipetteres på det for voldsomt. Dyrkningsmedium kan langsomt afgives ned langs siden af en godt for at undgå at forstyrre kollagen.
- Inkuber kammer objektglas ved 37 ° C og 5% CO2 for at tillade celleinvasion. Celleinvasion i det omgivende kollagen kan observeres ved lysfelt eller fluorescensimagografi og kvantificeres ved en række forskellige metoder under anvendelse af epifluorescens, konfokal eller lys ark mikroskopi.
- Coat bunden af hver brønd af en 8-brønds vævskulturplade kammer objektglas med et minimum af 50 pi neutraliserede collagen.
3. Kvantificering af invasion: Lysfelt Microscopy
- Ved indstillede tidsintervaller, billede collagen-embedded sphæroider ved 10X forstørrelse med anvendelse et lysfelt mikroskop (trin 2.2.8).
BEMÆRK:langfristede levende celle eksperimenter, en opvarmet mikroskop stadium og CO 2 reguleres kammer kan anvendes til at opretholde sfæroider ved 37 ° C og 5% CO2, mens billeddannelse. - Kvantificere invasionsevne hjælp af software som ImageJ at måle antallet af celler invaderende i det omgivende kollagen og den gennemsnitlige afstand invaderede ved hvert tidspunkt.
4. Kvantificering af invasion: Fluorescens mikroskopi med Live-Cell Stain
- Efter trin 2.2.8, supplere mediet i kammeret objektglas med en fluorescerende farve, såsom DAPI, Calcein AM, eller anden celle-tracking forbindelse hensigtsmæssigt at cellelinjen i henhold til fabrikantens anvisninger.
BEMÆRK: kvantificering af invasiv, homogen farvning hele klumpformet er ikke afgørende. For applikationer, der kræver dybere indtrængen af pletter, længere inkuberinger (> 3 h), kan være nødvendig. - Fjern pletten og erstatte med 500 uL varm 1x PBS. Icubate ved 37 ° C i 10 min for at fjerne overskydende farve. Gentag mindst to gange.
- Under anvendelse af et fluorescensmikroskop, erhverve optiske snit gennem de invaderende sfæroider.
BEMÆRK: Langvarig udsættelse for laserlys bør minimeres under gentagne billedbehandling til at begrænse fototoksicitet og fotoblegning. - Bruge software såsom ImageJ at generere en Z-projektion, som kan anvendes til at kvantificere det samlede areal af den sfæroide antal invaderende celler, og afstande invaderet i kollagenmatrixen.
- Som et eksempel, for at kvantificere invasion, justere tærsklen billedet at udelukke baggrund, fremhæver kun sfæroiden og invaderende celler, og måle deres område. Arealet af den oprindelige klumpformet kan trækkes fra dette beløb at kvantificere invasiv.
5. Kvantificering af Invasion: Immunofluorescens
BEMÆRK: Alle opløsninger og puffere bør ledes gennem et 0,45 um filter før brug for at remove snavs, hvilket kan have en negativ indflydelse farvning.
- Forbered PBS + vaskebuffer. Forbered 1x PBS og tilføje CaCl2 og MgCl2 til en slutkoncentration på 0,1 mM. Må ikke autoklaveres buffer efter CaCl2 og MgCl2 tilsættes. Løsning kan være filter-steriliseret og opbevaret ved stuetemperatur.
- Forbered neutral pufret formalin (NBF) fiksering buffer. Tilsættes 5 dråber 1 M NaOH til 0,6 g paraformaldehyd. Bring til 20 ml med PBS + og inkuberes ved 60 ° C, indtil paraformaldehyd opløses (ca. 1 time). Afkøle til stuetemperatur og justering af pH til 7,4 med 1 M HCI.
BEMÆRK: NBF fiksering buffer skal tilberedes umiddelbart før brug. - Forbered bovint serumalbumin (BSA) blokeringsbuffer. Opløs BSA i PBS + 3% vægt / volumen. Opløsning kan filtersteriliseret og opbevaret ved 4 ° C i flere dage, men er bedst fremstilles frisk. Må ikke opvarmes.
- Forbered Permeabilisering puffer. Fortynd Triton X-100til 0,2% vol / vol i PBS +.
BEMÆRK: Permeabilisering buffer skal tilberedes umiddelbart før brug. - Eventuelt forberede MOWIOL mounting medium. Kombiner 2,4 g MOWIOL, 6 g glycerol og 6 ml ultrarent H2O Mix i 3 timer i en rotator ved stuetemperatur. Tilføj 12 ml 0,2 M Tris-CI (pH 8,5). Inkuber under blanding ved 50 ° C i 10 minutter.
- Centrifuger ved 5000 xg i 15 minutter for at pelletere uopløseligt materiale. Tilføj anti-blegemiddel, såsom 2,5% DABCO. Opbevares i 500 pi alikvoter ved -20 ° C.
- Immunofluorescens-farvning af sfæroider (figur 5)
BEMÆRK: Brug en pipette til langsomt at tilføje eller fjerne væsker fra kammer dias. Undgå brug af en aspirator, da dette kan forstyrre kollagenlaget.- Forbered sfæroider og integrere i kollagen-fyldt kammer dias, som beskrevet i afsnit 1 til 2.
BEMÆRK: Kollagen autofluorescens kan minimeres ved anvendelse af tynde lag eller små volumener collagen. - Fjern så meget dyrkningsmedium som muligt fra hvert kammer slide.
- Kort fortalt skylles kollagen lag med 500 pi PBS + vaskebuffer for at fjerne resterende medium.
- Der tilsættes 500 pi frisk PBS + vaskebuffer til hver brønd og inkuberes ved 37 ° C i 5 minutter for at vaske sfæroider. Gentag to gange.
- Erstat PBS + vaskebuffer med 500 pi NBF fiksering buffer. Der inkuberes ved stuetemperatur i 20 - 25 min.
- Fjern NBF fiksering buffer og skyl med 500 pi PBS + vaskebuffer. Vask i 5 minutter med frisk PBS + vaskebuffer mindst 3 gange.
BEMÆRK: Fast sfæroider kan opbevares ved 4 ° C i frisk PBS + vaskebuffer i flere dage. 0,01% natriumazid kan sættes til vaskepufferen til at inhibere mikrobiel vækst under opbevaring. - Erstat PBS + vaskebuffer med 500 pi permeabilisering puffer. Inkuber ved stuetemperatur i 10-15 min.
- Eventuelt fjerne BSA blokeringsbuffer. Brug af skalpel eller saks, punktafgiftspligtige sfæroider og den omgivende 3 mm x 3 mm område fra kollagenlaget. Ved hjælp af en bred boring P1000 tip, fjerne det udskårne blok af kollagen ved at skylle forsigtigt med frisk BSA blokerende buffer. Overfør kollagen blok til 1,5 ml rør.
- Centrifuger ved 2.000 xg i 2 min og fjern supernatanten. Røret kan forsigtigt spejlvendt over ren papirserviet for at væge overskydende væske væk.
- Forbered sfæroider og integrere i kollagen-fyldt kammer dias, som beskrevet i afsnit 1 til 2.
- Tilføj primært antistof til sfæroider og inkuberes ved stuetemperatur i 1 time. Tilføj tilstrækkeligt volumen af primært antistof, således at hele kollagen lag jævnt er neddykket. De valgfrie trin over (5.6.8.1-5.6.8.2) typisk tillade brugen af mindre mængder af antistof.
- Sænk kammer dias i en beholder med mindst 10 ml PBS + vask buffer i 10 min for at vaske. Gentag mindst to gange.
- Valgfri, hvis sfæroider blev udskåret fra collagen lag tidligere (trin 5.6.8.1), tillægges som minimum 1 ml PBS + vaskebuffer til 1,5 ml rør og forsigtigt agitere. Den henstår i mindst 10 min.
- Fjern så meget PBS + vaskebuffer som muligt og gentage vask med PBS + vaskebuffer minimum to gange. Centrifuger ved 2.000 xg i flere minutter for at pelletere kollagen blok.
BEMÆRK: Rens udvendige overflader i kammeret slide ved at tørre med 70% ethanol, før nedsænkning i vaskebuffer.
- Gentag trin 5.6.9-5.6.10 bruger passende sekundært antistof.
BEMÆRK: Hvis sfæroider blev farvet direkte i billedbehandling fartøj, gå videre til trin 5.6.13. - Valgfri, hvis sfæroider blev udskåret fra collagen lag tidligere (trin 5.6.8.1), rene objektglas og konfokal mikroskopi-kompatible dækglas med 70% ethanol.
- Fjern så meget vaskebuffer som muligt fra kollagen blok og resuspender i ultrarent H2O Udfør dette trin umiddelbart før montering. Lad ikke farvede blokke iblødsætning i vand.
- Brug fint tippes pincet, fat kanten af kollagen blok og overførsel til objektglasset.
- Brug af pincet til at holde kollagen på plads, skal du bruge en ren vatpind at væge overskydende væske fra kollagen blok, og sørg for ikke at røre ved kollagen direkte.
BEMÆRK: Hvis kollagen bliver fast til vatpind det kan forsigtigt fjernes enten ved hjælp af pincet, eller ved at nedsænke i vand.
- Brug omvendt pipetteringsteknik, dispensere 100 uL MOWIOL montering medium på collagen blok og sted dækglasset over prøven.
- Brug en vatpind eller et stykke køkkenrulle til at væge overskydende MOWIOL montering medium og vand ud under dækglasset.
- Tillad MOWIOL montering medium til at hærde natten over ved 4 °C. Seal kanter dækglas med neglelak.
- Dette billede er farvede sfæroider bruger konfokal eller fluorescensmikroskopi at observere lokalisering af proteiner af interesse, dannelse af invasive strukturer, etc. (figur 5B, 5C).
BEMÆRK: Farvede spheroids skal beskyttes mod lys for at forhindre fotoblegning.
6. anoikis Assay
BEMÆRK: sfæroide formation protokol kan let tilpasses til kvantificering forankringsuafhængig vækst og anoikis resistens i en række celletyper.
- Podning celler for anoikis assay (figur 6)
- Følg instruktionerne for klumpformet produktion i afsnit 1.4, men bruger et minimum af 30 mg / ml methylcellulose at forberede klumpformet dannelse medium.
BEMÆRK: Når opvarmet, bør 30 mg / ml methylcellulose producere en tyk gel, som holder cellerne i suspension. - Cellerne inkuberes i flere dage til uger og ispect regelmæssigt på 10X forstørrelse ved hjælp af et mikroskop. Celler, som modstår anoikis bør proliferere og danne kolonier.
- Kvantificere anoikis ved måling af antallet og størrelsen af dannede kolonier i hver brønd.
BEMÆRK: Når kolonier dannet, kan de vaskes for at fjerne methylcellulose og anvendes til sfæroid assays, som beskrevet.
- Følg instruktionerne for klumpformet produktion i afsnit 1.4, men bruger et minimum af 30 mg / ml methylcellulose at forberede klumpformet dannelse medium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi beskriver en fleksibel og effektiv metode til at generere diskrete sfæroider ved hjælp celle-afvisende plader og sfæroide dannelse medium suppleret med MC. Under de passende betingelser for MC og serum, individuelle celler sætte sig og klæber sammen ved midten af brønden for at danne sfæroider med minimal vedhæftning til brøndens bund. Ved anvendelse af denne protokol blev sfæroider genereret fra en række forskellige cellelinjer (figur 2B). Titrering af MC og serumkoncentrationer er påkrævet for hver cellelinie for at identificere optimale betingelser, hvor kun en enkelt sfæroid dannes der er robust nok til at tillade manipulation uden fragmentering. Optimalt sfæroiderne var mellem 200 til 500 um i diameter, og bestod af tæt vedhæftende celler med minimal cellerester. Spheroids overlevede skånsom håndtering uden skader, så de kan blive indsamlet og brugt i en lang række forskellige analyser.
(figur 3A), hvilket resulterede i aggregater af døde celler. Ved tilstedeværelse af støv eller anden fiber forurening, flere eller uregelmæssigt formet celleklynger, der var kun svagt aggregeret dannet, og de resulterende spheroids nemt brød fra hinanden, når de håndteres. Klumpformet dannelse blev også påvirket af suboptimale koncentrationer af MC eller serum i klumpformet dannelse medium (figur 3B). I vores test, mange cellelinier var i stand til at klæbe til celle-afvisende plader i fravær eller ved lave koncentrationer, for MC, og resulterede i dannelsen af en sfæroid omgivet af en celle monolag (figur 3B-ii). BxPC-3 cellevækst i suboptimale MC betingelser er vist som et eksempel. I almindelighed højere koncentrationer af MC forhindrede celler i at klæbe til brønden, men en for høj koncentration af MC reduceret celle-celle-adhæsion, og forhindrede celler fraafregning til bunden af brønden, hvilket resulterer i dannelsen af løse aggregater og talrige satellit sfæroider (figur 3B-i). Koncentrationen af serum også påvirket celleoverlevelse, og celle-celle og celle-plast adhæsion og skulle optimeres til forskellige cellelinier. For cellelinjer, såsom HCT-116 og PANC-1, for høj en serumkoncentration resulterede i overdreven celleproliferation og produktion af overdimensionerede sfæroider, der blev let beskadiget ved håndtering, eller fremmes celleadhæsion til plasten godt og dannelsen af et monolag ( Figur 3B-iii). Interessant, virkningerne af utilstrækkelig serum afveg mellem cellelinier. HCT-116 overlevelsescelle blev reduceret, og de dannede sfæroider var små, indeholdende en stor andel af døde celler i lavt serum. I modsætning hertil PANC-1-celler var levedygtige i fravær af serum, men blev mere vedhæftende, og dannede flere aggregater samt et cellemonolag (figur 3B-iv, v).
En modifikation af den beskrevne sfæroid dannelse protokol, hvori individuelle celler suspenderes i højere koncentration MC (30 mg / ml) kan anvendes til at overvåge anoikis modstand. Ved disse MC-koncentrationer, kan medium stadig overføres med pipette mens køligt, men fortykket til en fast gel ved 37 ° C. Anoikis-resistente celler resuspenderet i dette medium forblev i suspension og prolifererede over en periode på 2-4 uger, danner suspenderede sfæroider af varierende størrelser (figur 6B). Forankringsafhængige celler ikke danner sfæroider under disse betingelser. Vi var i stand til at kvantificere anoikis-modstand ved at tælle følelsesløsis af sfæroider dannet i hver brønd.
Figur 1: Oversigt over 3D Sfæroide Formation protokol. Celler dyrket i monolagskultur dissocieres, tælles, pelleteret og resuspenderet i sfæroid dannelse medium suppleret med methylcellulose (MC) og serum (i-iv). Suspensionen podes i en U-bundet celle-afvisende plade ved ønskede densitet at tillade dannelse af sfæroider med den ønskede størrelse (v), og pladen inkuberes at fremstille en enkelt, diskret celle sfæroid i hver brønd (vi). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Optimeret klumpformet Formation Betingelser.(A) Sfæroide formation under optimale betingelser for SH-SY5Y-celler. 1.000 celler podet i U-bundede celle-repellent plader i medium suppleret med 5% serum og 1 mg / ml MC aggregeret til kompakte sfæroider inden 24 timer. (B) Repræsentative billeder af sfæroider dannet af forskellige cellelinjer under optimale betingelser, der er vist i tabel 1. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Sfæroide Dannelse Under suboptimal Betingelser. (A) Sfæroider dannet i tilstedeværelsen af forurenende stoffer. Mikrobiel kontaminering resulterede i celledød og løst aggregeret sfæroider. I nærvær af uopløselige kontaminanter, såsom støv eller fibre, celler adhæreret til disse materialer og ikke AGGREGspiste. (B) Sfæroide dannelse i suboptimal klumpformet dannelse medium. BxPC-3-celler podet i nærvær af overskydende MC (10 mg / ml) dannet talrige satellit sfæroider (i), mens utilstrækkelig MC (0 mg / ml) resulterede i celleaggregater, der overholdt brøndbunden og dannede et monolag (ii ). Lignende resultater blev observeret for andre testede cellelinier (ikke vist). Overskydende serum (20%) resulterede i øget HCT-116 celleproliferation og monolagsformation (iii). Utilstrækkelig serum (0%) havde cellelinje-specifikke virkninger, der spænder fra celledød i HCT-116 (iv) til dannelse af satellitbaserede sfæroider i PANC-1 (v). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Invasion assay under anvendelse Sfæroider. (A) Oversigt af sfæroid invasion assay. Billedtromlen fartøjet er præ-overtrukket med et lag af neutraliseret collagen og inkuberes at polymerisere kollagen (I-II). Præformede sfæroider opsamles i 1,5 ml rør og resuspenderet i neutraliseret collagen (iii-vi). Den sfæroid-collagen blanding overlejres på kollagenbase-lag og inkuberes at polymerisere kollagen (vii-viii). Vækstmedium indeholdende ønskede forbindelser derpå lagt oven på det polymeriserede sfæroid-collagen lag og inkuberes for at tillade celleinvasion (ix-x). (B) i nærvær af en kemoattraktant cellerne vist invaderer ind i den omgivende kollagenmatrix fra en indlejret PANC-1 sfæroide i de angivne tidspunkter. Hvert panel viser en fase kontrast billede erhvervet ved anvendelse af et 10X objektiv. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Immunofluorescens Farvning af kollagen-indlejrede Sfæroider. (A) Oversigt over protokol til immunfluorescensfarvning af sfæroider. Indlejrede sfæroider vaskes, fast (NBF), og blokerede (BSA) direkte i den billeddannende fartøj. Sfæroider kan farves direkte, eller udskåret og farvet i et mindre volumen, såsom en 1,5 ml rør. Sfæroider skal vaskes med overskydende buffer efter hver plet for at minimere baggrundsfluorescens. Farvede sfæroider kan afbildes direkte i beholderen eller monteres under et dækglas til billedbehandling og opbevaring. (B) Immunofluorescens billeder af en TPC-1 celle sfæroide indlejret i kollagen og fik lov til at invadere i 24 timer. (C) Billeder, der viser phalloidin farvede celler typisk for områder, der er angivet i B. Hvert panel viser en 20 pm Z-projektion (0,2 um trin) erhvervet ved hjælp af en 60X målsætning: Celler i klumpformet body ca. 20 um fra overfladen (1), celler rager ind kollagen (2), og celler invaderer gennem collagen (3). Scale barer = 25 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Sfæroide Formation anoikis analysen. (A) Oversigt over protokol for anoikis assay. Celler fremstilles som beskrevet i figur 1, men resuspenderes i sfæroid dannelse medium indeholdende mindst 30 mg / ml MC, som danner et tykt lag til at holde individuelle celler i suspension og forhindre cell aggregation (I-II). Cellesuspensionen podes i U-bundede celle-repellent plader og inkuberet (iii-iv). De suspenderede celler kan overvåges for sfæroid dannelse ved proliferation, hvilket indikerer anoikis modstand. (
| cellelinie | MC (mg / ml) | Serum (%) | Anslået inkubation tid |
| SH-SY5Y | 1 | 5 | 24 timer |
| BxPC-3 | 5 | 5 | 3 til 5 dage |
| PANC-1 | 5 | 5 | 5 til 7 dage |
| HCT-116 | 3 | 10 | 2 til 4 dage |
| TT | 1 | 10 | 7 til 10 dage |
| TPC-1 | 3 | 5 | 1 til 2 dage |
Tabel 1: Optimal Sfæroide Dannelse Medium Sammensætning og inkubationstider for validerede cellelinier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi præsenterer en hurtig og fleksibel fremgangsmåde til fremstilling af 3D-celle sfæroider at modellere arkitekturen af in vivo væv anvendelse af billige og let tilgængelige reagenser. Vores protokol udnytter ikke-cytotoksiske og adhæsionsfremmende egenskaber MC 8, 9 at mediere celle aggregering og minimere cellemonolaget formation. I modsætning proteinbaserede matricer isoleret fra animalske kilder, MC er inert, ikke indeholder vækstfaktorer, og kan let fjernes ved vask, hvilket tillader isolering af sfæroider til anvendelse i en lang række applikationer uden tilstedeværelse af resterende matrix. Vores protokollen bruger hurtig sammenlægning af ensartede celletal til at generere homogent mellemstore sfæroider, så direkte sammenligninger af spheroids dyrket under forskellige eksperimentelle betingelser. Denne fremgangsmåde kan tilpasses til blandede kulturer til model in vivo tumorvækst ved at kombinere faste antal af multiple tumorassocierede celletyper (fx fibroblaster, leukocytter, stromale celler) til at repræsentere tumoromgivelsen mere præcist.
Modifikationer af vores protokol anvendes celler podet i høje koncentrationer af MC kan bringes til at overvåge forankringsuafhængig vækst af celler i stand til at proliferere i suspension, og kan anvendes som en anoikis assay (afsnit 6) at identificere eller kvantificere celletransformation. Sphæroider genereret af vores protokol er ideelle til applikationer såsom screening stof, der giver mulighed sammenligning af cellevækst, stofskifte, overlevelse, og invasionsevne mellem behandling betingelser. Isolerede sfæroider kan også være indlejret i en ekstracellulær matrix, såsom collagen, til at vurdere og kvantificere celle invasiv i en 3D-mikromiljø (afsnit 2.2, figur 4), som mere præcist modeller in vivo tumorvækst. Endvidere kan vores protokol anvendes til at isolere store mængder af sfæroider fra MC matrix for protein eller RNA-fremstilling, så uSERS at evaluere celle signal eller genekspression ændringer som reaktion på behandling eller vækstbetingelser.
Vores sfæroid dannelse protokol kræver optimering af serum og MC-koncentrationer, og antallet af celler podet for hver cellelinie. Cellelinie-specifikke karakteristika, såsom cellelevedygtighed, celle-celle og celle-plast klæbeevne, kan påvirke den lethed, hvormed der er dannet sfæroider betydeligt. Generelt cellelinier med dårlig rentabilitet i monolagskultur kræves højere serumkoncentrationer at fremme kugleformet dannelse, mens højere MC koncentrationer blev foretrukket til stærkt klæbende cellelinier. Vi anbefaler derfor, at titreringer af serum og MC udføres for at bestemme de optimale betingelser for celle overlevelse (serumkoncentration), og samtidig minimere monolag og satellit klumpformet dannelse (MC koncentration). Disse betingelser skal resultere i generering af en enkelt diskret sfæroid per brønd uden satellitter. Optimal sfæroid størrelse foranalyse er programafhængige og påvirkes af antallet af celler podes og serumkoncentrationen (trin 1.4.7). Seeding færre celler producerer mindre aggregater, der er lettere homogent farvede, men må ikke reproducere in vivo celle-celle og celle-mikromiljø interaktioner. Forøgelse af antallet af celler podet genererer større sfæroider, som kan indeholde et fysiologisk repræsentativ hypoksisk kerne 10, som kan påvirke cellernes adfærd og ændre fortolkninger vokse eller overleve assays. Men når alt for stor, kan sfæroider være skrøbelig og let brydes eller beskadiges under isolering. Større sfæroider er også meget sværere at visualisere uden specialiserede imaging platforme for optisk sektionering (f.eks lys ark fluorescerende mikroskop) eller ved at indlejre eller cryosectioning og farvning af tværsnit gennem klumpformet 11. Vi anbefaler et mål sfæroid størrelse på 200-500 um for fleksibilitet oglethed håndtere for de fleste applikationer. Samlet set er det vigtigt at optimere betingelserne for sfæroide dannelse i både en cellelinje-specifikke og applikationsspecifikke måde.
Klumpformet produktionsprotokoller kræver særlig opmærksomhed for at undgå forurening af sfæroider med støv og andre partikler. Celler klæbe til støv og andre uopløselige urenheder, hvilket resulterer i uregelmæssigt formet, løstsiddende celleaggregater uegnede til anvendelse i analyser (figur 3A). Forureningskilder kan minimeres ved at lede alle løsninger gennem et 0,45 um filter, skylning cellemonolaget med filtreret medium før dissociering (trin 1.4.1), og skylning multikanalpipette reservoirer med filtreret ultrarent vand umiddelbart før brug (Trin 1.4.6.1). Endvidere bomuld-filtrerede serologiske pipetter, som kan kaste fibre ind i løsninger, bør undgås. Selvom det ikke er kritisk, kan støv reduceres yderligere ved at føre dissociated celler gennem en 100 um cellefilter før podning (trin 1.4.6). Fordampning tab af medium er en ekstra teknisk overvejelse, især for inkubationstider over en uge, såsom dem, der kræves visse cellelinjer til klumpformet dannelse (tabel 1) eller under anoikis analyser (afsnit 6). Fordampning kan minimeres ved at pode celler i brønde i midterområdet af multi-brønds plader, påfyldning perimeter brønde med ultrarent vand, og løst forsegle kanterne af plade eller indeslutter pladen i et fugtigt kammer.
3D celle sfæroider er en værdifuld model for studiet af både normale og tumorceller adfærd og fysiologi. Vores protokol er en hurtig og økonomisk metode til generering af konsekvent størrelse 3D celle sfæroider, der kan anvendes i et sortiment af assays og anvendelser. Disse sfæroider repræsenterer værdifulde værktøjer til karakterisering af tumorvækst og microenvironment interaktioner samt modeller for PReClinical evaluering af nye behandlingsformer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Buffers | |||
| 10x Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific | AM9625 | |
| Calcium Chloride Solution | Sigma-Aldrich | 21114 | Used for PBS+ wash buffer; Do not autoclave PBS+ wash buffer upon addition of calcium chloride |
| Magnesium Chloride Solution | Sigma-Aldrich | M1028 | Used for PBS+ wash buffer; Do not autoclave PBS+ wash buffer upon addition of magnesium chloride |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| For Spheroid Formation | |||
| 96-well U-bottom Cell-Repellent Plate | Greiner Bio-One | 650970 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma-Aldrich | D5546 | For culturing SH-SY5Y, PANC-1, TPC-1 cell lines |
| F12K Medium | Thermo Fisher Scientific | 2112722 | For culturing TT cell line |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F1051 | Filter prior to use to remove particulate contaminants |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M7027 | Prepare in water to 100 mg/mL |
| Roswell Park Memorial Institute Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | For culturing HCT-116, BxPC-3 cell lines |
| TrypLE Express | Thermo Fisher Scientific | 12605028 | Dissociation buffer |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| For Invasion Assay | |||
| Bovine Type I Collagen | Corning Incorporated | 354231 | Stock 3.1 mg/mL; Maintain on ice when in use |
| DMEM Phenol Red Free Low Glucose | Thermo Fisher Scientific | 11054-20 | Less background fluorescence compared to Phenol Red supplemented medium |
| Glial Cell Line Derived Neurotrophic Factor | Peprotech | 450-10 | Chemoattractant |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| For Immunofluorescence Microscopy | |||
| #1.5 Coverglass | Electron Microscopy Sciences | 72225-01 | For mounting excised spheroids |
| Alexa-Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | Used to stain actin at 1:200 |
| Bovine Serum Albumin | Bioshop Canada Incorporated | ALB001 | Used in BSA blocking buffer |
| Dabco 33-LV | Sigma-Aldrich | 290734 | Antifade |
| Glycerol | Bioshop Canada Incorporated | GLY001 | Used in MOWIOL mounting medium |
| ImageJ Software | Freeware, NIH | - | Used for image analysis |
| Microslides | VWR International | 48312-024 | For mounting excised spheroids |
| MOWIOL 4-88 | EMD-Millipore | 475904 | Used in MOWIOL mounting medium |
| Paraformaldehyde | EMD-Millipore | PX0055-3 | Used in fixation buffer |
| Triton X-100 | Bioshop Canada Incorporated | TRX777 | Used in permeabilization buffer |
References
- Zimmermann, M., Box, C., Eccles, S. A. Two-dimensional vs. three-dimensional in vitro tumor migration and invasion assays. Methods Mol Biol. 986 (986), 227-252 (2013).
- Albini, A., Noonan, D. M. The 'chemoinvasion' assay, 25 years and still going strong: the use of reconstituted basement membranes to study cell invasion and angiogenesis. Curr Opin Cell Biol. 22 (5), 677-689 (2010).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).
- Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends Biotechnol. 31 (2), 108-115 (2013).
- Carletti, E., Motta, A., Migliaresi, C. Scaffolds for tissue engineering and 3D cell culture. Methods Mol Biol. 695, 17-39 (2011).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. J Vis Exp. (51), (2011).
- Handschel, J. G., et al. Prospects of micromass culture technology in tissue engineering. Head Face Med. 3, 4 (2007).
- Stuckhoff, A. P., DelValle, L. Neuronal Cell Culture Methods and Protocols Vol. 1078 Methods in Molecular Biology. Amini, S., White, M. K. 1078, Humana Press. 119-132 (2013).
- Stewart, G. J., Wang, Y., Niewiarowski, S. Methylcellulose protects the ability of anchorage-dependent cells to adhere following isolation and holding in suspension. Biotechniques. 19 (4), 598-604 (1995).
- Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC Biol. 10, 29 (2012).
- Nagelkerke, A., Bussink, J., Sweep, F. C. G. J., Span, P. N. Generation of multicellular tumor spheroids of breast cancer cells: How to go three-dimensional. Anal. Biochem. 437 (1), 17-19 (2013).
