النانومترية الحمض النووي كأداة مرنة لدراسة البوليمرات سيميفليكسيبلي
Summary
سيميفليكسيبلي البوليمرات عرض الخصائص الميكانيكية الفريدة التي يتم تطبيقها على نطاق واسع بنظم المعيشة. ومع ذلك، تقتصر دراسات منهجية في البوليمرات البيولوجية نظراً لخصائص مثل صلابة البوليمر غير قابل للوصول. هذه المخطوطة يصف كيف يتم التحايل على هذا القيد بالأنابيب النانوية الحمض النووي للبرمجة، تمكين دراسات تجريبية عن أثر صلابة خيوط.
Abstract
ويمكن فهم الخواص الميكانيكية لهذه المسألة لينة معقدة، والمستندة إلى البوليمر، مثل الخلايا أو الشبكات بيوبوليمير، لا الإطار الكلاسيكي للبوليمرات المرنة ولا قضبان جامدة. خيوط الأساسية تظل ممدودة بسبب ما تيبس العمود الفقري غير التلاشي، الذي هو كمياً عن طريق طول استمرار (lp) وإنما أيضا عرضه للتقلبات الحرارية القوية. صلابة الانحناء محدود يؤدي إلى ميكانيكا الجماعية فريدة وغير عادية للشبكات الأكبر، مما يتيح تشكيل السقالات مستقرة في انخفاض حجم الكسور مع توفير أحجام كبيرة مش. هذا المبدأ الأساسي السائد في الطبيعة (مثلاً في الخلايا أو الأنسجة)، تقليل محتوى الجزيئي عالية ومما ييسر انتشارية أو النقل النشط. نظراً للآثار البيولوجية والتطبيقات التكنولوجية المحتملة في الهلاميات المائية متوافق حيويا، خضعت البوليمرات سيميفليكسيبلي دراسة كبيرة. بيد أن التحقيقات مفهومة ظلت صعبة نظراً لأنها تعتمد على البوليمرات الطبيعية، مثل خيوط الأكتين، التي غير الانضباطي بحرية. وعلى الرغم من هذه القيود، ونظرا لعدم وجود البوليمرات الاصطناعية وميكانيكيا الانضباطي، وسيميفليكسيبلي، وخيوط أكتين أنشئت كالنظام النموذجي الموحد. حد رئيسية أن الكمية الوسطى لف لا يمكن ضبطها بحرية لدراسة تأثيرها على هياكل السائبة العيانية. وتم حل هذا القيد باستخدام الأنابيب النانوية هيكلياً للبرمجة في الحمض النووي، تمكين التحكم تغيير صلابة خيوط. أنها تتشكل من خلال النماذج المستندة إلى البلاط، حيث هجن مجموعة منفصلة من خيوط مكملة جزئيا في بنية حلقة مع محيط منفصلة. نهايات لزجة، تمكين البلمرة فعالة إلى خيوط عدة ميكرون في الطول، وتتميز هذه الحلقات وعرض مماثل البلمرة حركية البوليمرات البيولوجية الطبيعية. سبب الميكانيكا القابلة للبرمجة، وهذه الأنابيب أدوات تنوعاً، رواية دراسة أثر لف في جزيء الواحد فضلا عن حجم الجزء الأكبر. وعلى النقيض من خيوط الأكتين، تظل مستقرة على مدى أسابيع، دون انحطاط ملحوظ، وتعاملها مع بسيط نسبيا.
Introduction
بسبب السلوكيات المعقدة خصائصها الميكانيكية الفريدة التي يوفرها، البوليمرات سيميفليكسيبلي هي اللبنات الأساسية لمعيشة هذه المسألة. خلافا للبوليمرات المرنة، البوليمرات سيميفليكسيبلي تعتمد على تكوين ممدودة بسبب تصلب العمود الفقري غير التلاشي على حين لا تزال تبقى خاضعة للتقلبات الحرارية قوية1. وهكذا، لا يمكن تطبيق النماذج العشوائية البحتة على سلوكهم، كما هو الحال مع النقيض إلى النقيض تماما مرنة أو جامدة البوليمرات. ووضعت ما يسمى دودة مثل سلسلة طراز2،3،4 لقياس صلابة هذا عن طريق لف، الذي هو ثابت الانحلال في العلاقة الظل الظل على طول الشعيرة4. في حالة مماثلة لطول كفاف (lc) خيوط لف ، يعتبر البوليمر سيميفليكسيبلي1. مماثلة لأقطاب خيمة، تستقر ترتيباتها في الشبكات أو حزم النظام الجماعي بأكمله في انخفاض حجم الكسور، مما يؤدي إلى لزج مطاطي غير عادية خصائص5،،من67، 8،9. وهذه الهياكل توفير مرونة عالية بوجه عام مش أحجام10، الحفاظ على سلامة الميكانيكية بينما لا يزال تيسير انتشارية وعمليات النقل النشط. هذه الخاصية مناسبة خاصة للنظم البيولوجية مثل سيتوسكيليتون أو المصفوفة خارج الخلية، ولكن يتم استخدامه على نطاق واسع في الغذاء الهندسة1،،من1112.
تتجاوز أهميتها للمسألة المعيشية، من الأهمية بمكان دراسة شاملة الخصائص الفيزيائية لهذه الهياكل من أجل لديك الأدوات اللازمة لوضع مواد المحاكاة البيولوجية أو رواية الهلاميات المائية. وهذا يعني من حيث سيميفليكسيبلي البوليمرات، منهجية تحديد الخصائص الجماعية للشبكات الناتجة عن خصائص خيط واحد مثل لف ووضع الإطار النظري الوصفي. في دراسات رائدة، تأسست كنظام نموذجي للبوليمرات سيميفليكسيبلي أكتين بيوبوليمير الخلوية ويعتبر على نطاق واسع لا تزال المعيار الذهبي5،13،،من1415 , 16 , 17-دراسات شاملة غير محدودة مع هذا النظام نظراً لأنها ترتبط بالخصائص الملازمة لهذا البروتين. مختلف النهج النظري قد تهدف إلى بناء وصفاً للسلوكيات الميكانيكية غير عادية على مستوى واحد-خيوط وأدت إلى خاصة مختلفة توقعات التحجيم للاعتماد على معامل القص الهضبة مطاطا الخطي، ز 0 (أي “مرونة” من الشبكة)، وفيما يتعلق بتركيز (ج) و لف6،7،،من1314، 15،،من1819،20،21،،من2223. بينما زيادة تركيز متاحة في تجارب مع القائم على الأكتين أو غيرها من النظم النموذجية وفي حين كانت التنبؤات النظرية دقة التحقق من، 13،،من1624 القياس بالنسبة لف ظل 25، تجريبيا غير قابل للوصول. هذا، ومع ذلك، يشكل قيداً رئيسيا نظراً لف هو أيضا متغير مستقل هو تحديد كمية بوليمرات سيميفليكسيبلي.
مؤخرا تم حل هذا القيد المركزي، والطبيعية التي تفرضها ثابت lp من أكتين أو البوليمرات الأخرى المستمدة من بيولوجيا مثل الكولاجين عن طريق استخدام أنابيب الحمض النووي القائم على بلاط، التي الانضباطي في خواصها الميكانيكية 9 , 26 , 27 , 28-اختلافات طفيفة في أبنية الأنابيب (مثلاً، إعداد مختلفة من الحمض النووي المكونة لها فروع داخل الحلبة وحدة) تعطي قيم مميزة لامف، التي يمكن تقييمها عن طريق الفحص المجهري الأسفار، تحليل أنبوب تقلب واحد أو بتقييم التكوينات المنحنية من عدة أنابيب التقيد بها، كما وصف سابقا9،28. وكشفت هذه التحاليل أن تختلف قيمp lالسكان أنبوب مختلفة على أمر واحد أو أكثر من حجم، وأن أساليب التقييم المختلفة تسفر عن نتائج متسقة9،28.
المثير للدهشة، سجلت الشاملة مقياس خطي الهضبة مطاطا القص معامل ز0 فيما يتعلق بتركيز و لف لا يتمشى مع جميع المناهج النظرية السابقة 9، مما يدل على وجه الخصوص كثير أقوى من المتوقع الاعتماد لف. هذه النتائج تؤكد قيمة نظام نموذج جديد لدراسة خصائص البوليمرات سيميفليكسيبلي الوسطى. توظيف n-الحلزون الدنا أنابيب كبيرة ويوسع نطاق هذه التحقيقات. لا يمكن أن تختلف لف بحرية دون تغيير المواد الأساسية فحسب، بل الطبيعة القابلة للبرمجة للحمض النووي يمكن تمكين الفحص المنهجي لعناصر إضافية، مثل كروسلينكس أو عمليات التحويل الحركية. بالإضافة إلى ذلك، هذه الأنابيب القابلة للذوبان في الماء، وعلى عكس معظم البروتينات، مستقرة في درجة الحموضة كافية وظروف الأيونية لعدة أسابيع، دون تدهور يمكن كشفها9.
لتجميع هذه الأنابيب، يتم استخدام مجموعة منفصلة من النوكليوتيد الحمض النووي، كل منها يحتوي على هذين المجالين تتشارك تسلسلات قاعدة مكملة إلى شقين المجاورة (نظراً لتسلسل معين، لا يمكن أن تشكل حبلا واحد هياكل مثل دبابيس الشعر). تسلسلات مكملة هجن على نحو دوري، تشكيل الحلقات المغلقة، وتداخل نصف شرائح مزدوجة حلزونية ن مترابطة (الشكل 1A و ب). هذه شكل حلقات في قطر منفصلة (الشكل 1)، وعلى تكوين تداخل نصف يكشف نهايات لزجة المحوري مكملة لنهايات لزجة خاتم آخر. هذا بالإضافة إلى انتقائية لمطابقة النوكليوتيد المشغلات التراص الخواتم، مما يؤدي إلى البلمرة فعالة من أنابيب الحلزون الدنا الخيطية من حجم n (nHT). قياس أطوال كفاف بهم عادة عدة ميكرون في الطول، وتوزيعها على طول يماثل أكتين خيوط9،26،،من2728. ولقد ثبت للأنابيب النانوية الحمض النووي مماثلة أنهم في الواقع يحمل حركية البلمرة شبيهة بخيوط أكتين وميكروتوبوليسالفئة p = “xref” > 29. يمكن أن تختلف تبعاً لعدد n من خيوط الحمض النووي الفردية التي تشكل هيكل الحلقة الأساسية، كنترولبلي العمارة نHT، فضلا عن محيط به والقطر،. استخدام المزيد من خيوط الحمض النووي يزيد من محيط الخواتم/الأنابيب، وتحولات التغيير المعماري المقابلة الخواص الميكانيكية لأعلى قيمp l(الشكل 1)، تقابل صلابة أعلى. بمقياس mesoscopic، تترجم هذه القيمp lأكبر والتشكلات بنت أقل بسبب تصلب أعلى (الشكل 1 وه).
Protocol
Representative Results
Discussion
للحصول على الشبكات بشكل صحيح المشكلة، تجميع الأنابيب النانوية الحمض النووي خطوة حاسمة. الأخطاء التي تحدث أثناء عملية التوليف تأثيراً سلبيا على نوعية الأنبوبة؛ لذلك، من المستحسن أن يستخدم [هبلك] أو عملية أكثر صرامة لتنقية النوكليوتيد. منذ تشكيل منفصلة بدلاً من تجميع الأنابيب النانوية الح…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نعترف بالتمويل عن طريق DFG (1116/17-1) ومدرسة لايبزيغ للعلوم الطبيعية “بويلدمونا” (GSC 185). تم دعم هذا العمل من خلال مشروع اجتذاب فراونهوفر 601 683. ت. ﻫ. تعترف بتمويل من “الصندوق الاجتماعي الأوروبي” (كلية العلوم التربوية-100077106).
Materials
| AFM cantilever ACTA | AppNano | ||
| AFM – NanoWizard 3 | JPK Instruments | ||
| CCD camera | Andor | iXon DV887 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DNA oligonucleotides | Biomers.net | For sequences see Table 1 | |
| DNA Cy3-labeled oligonucleotides | Biomers.net | For sequence see Table 1 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E-9884 | |
| Epi-fluorescence micro-scope | Leica | DM-IRB | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M-8266 | |
| Mica "V1", 12 mm round | Plano GmbH | 50-12 | |
| MicroAmp® Fast Optical 96-Well Reaction Plate | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4346907 | |
| MicroAmp® Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4306311 | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| 100x objective | Leica5 | 506168 | |
| Purified water | Merk Millipore – Milli-Q & Elix | ||
| Sapphire PCR tubes | Greiner Bio-One | 683271 | |
| TProfessional Standard PCR Thermocycler | Core Life Sciences Inc. | 070- Standard | |
| 7900HT Fast Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4351405 | |
| Rheometer | TA Instruments | ARES | |
| SYBR® Green I nucleic acid gel stain | Thermo Fisher Scientific Inc. | S7567 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T4661 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich Co. | X-100 | Suppresses evaporation of sample at air-water interface |
Referências
- Huber, F., et al. Emergent complexity of the cytoskeleton: from single filaments to tissue. Adv Phys. 62 (1), 1-112 (2013).
- Kratky, O., Porod, G. Röntgenuntersuchung gelöster Fadenmoleküle. Recl Trav Chim Pays-Bas. 68 (12), 1106-1122 (1949).
- Saitô, N., Takahashi, K., Yunoki, Y. The Statistical Mechanical Theory of Stiff Chains. J Phys Soc Jpn. 22 (1), 219-226 (1967).
- Doi, M., Edwards, S. F. . The Theory of Polymer Dynamics. , (1986).
- Mueller, O., Gaub, H. E., Baermann, M., Sackmann, E. Viscoelastic moduli of sterically and chemically cross-linked actin networks in the dilute to semidilute regime: measurements by oscillating disk rheometer. Macromolecules. 24 (11), 3111-3120 (1991).
- MacKintosh, F. C., Käs, J., Janmey, P. A. Elasticity of semiflexible biopolymer networks. Phys Rev Lett. 75 (24), 4425-4428 (1995).
- Gardel, M. L. Elastic Behavior of Cross-Linked and Bundled Actin Networks. Science. 304 (5675), 1301-1305 (2004).
- Sonn-Segev, A., Bernheim-Groswasser, A., Diamant, H., Roichman, Y. Viscoelastic Response of a Complex Fluid at Intermediate Distances. Phys Rev Lett. 112 (8), (2014).
- Schuldt, C., et al. Tuning Synthetic Semiflexible Networks by Bending Stiffness. Phys Rev Lett. 117 (19), (2016).
- Käs, J., et al. F-actin, a model polymer for semiflexible chains in dilute, semidilute, and liquid crystalline solutions. Biophys J. 70 (2), 609-625 (1996).
- Ross-Murphy, S. B. Structure-property relationships in food biopolymer gels and solutions. J Rheol. 39 (6), 1451-1463 (1995).
- Fletcher, D. A., Mullins, R. D. Cell mechanics and the cytoskeleton. Nature. 463 (7280), 485-492 (2010).
- Hinner, B., Tempel, M., Sackmann, E., Kroy, K., Frey, E. Entanglement, Elasticity, and Viscous Relaxation of Actin Solutions. Phys Rev Lett. 81 (12), 2614-2617 (1998).
- Palmer, A., Mason, T. G., Xu, J., Kuo, S. C., Wirtz, D. Diffusing Wave Spectroscopy Microrheology of Actin Filament Networks. Biophys J. 76 (2), 1063-1071 (1999).
- Gardel, M. L., Valentine, M. T., Crocker, J. C., Bausch, A. R., Weitz, D. A. Microrheology of Entangled F-Actin Solutions. Phys Rev Lett. 91 (15), (2003).
- Liu, J., et al. Microrheology Probes Length Scale Dependent Rheology. Phys Rev Lett. 96 (11), (2006).
- Golde, T., Schuldt, C., Schnauß, J., Strehle, D., Glaser, M., Käs, J. Fluorescent beads disintegrate actin networks. Phys Rev E. 88 (4), (2013).
- Isambert, H., Maggs, A. C. Dynamics and Rheology of Actin Solutions. Macromolecules. 29 (3), 1036-1040 (1996).
- Käs, J., Strey, H., Sackmann, E. Direct imaging of reptation for semiflexible actin filaments. Nature. 368 (6468), 226-229 (1994).
- Schmidt, C. F., Baermann, M., Isenberg, G., Sackmann, E. Chain dynamics, mesh size, and diffusive transport in networks of polymerized actin: a quasielastic light scattering and microfluorescence study. Macromolecules. 22 (9), 3638-3649 (1989).
- Kroy, K., Frey, E. Force-Extension Relation and Plateau Modulus for Wormlike Chains. Phys Rev Lett. 77 (2), 306-309 (1996).
- Morse, D. C. Tube diameter in tightly entangled solutions of semiflexible polymers. Phys Rev E. 63 (3), (2001).
- Broedersz, C. P., MacKintosh, F. C. Modeling semiflexible polymer networks. Rev Mod Phys. 86 (3), 995-1036 (2014).
- Tassieri, M., Evans, R. M. L., Barbu-Tudoran, L., Khaname, G. N., Trinick, J., Waigh, T. A. Dynamics of Semiflexible Polymer Solutions in the Highly Entangled Regime. Phys Rev Lett. 101 (19), (2008).
- Non-Affine Shear Modulus in Entangled Networks of Semiflexible Polymers. arXiv:0907.1875[cond-mat] Available from: https://arxiv.org/abs/0907.1875 (2009)
- Yin, P., et al. Programming DNA Tube Circumferences. Science. 321 (5890), 824-826 (2008).
- Glaser, M., et al. Self-assembly of hierarchically ordered structures in DNA nanotube systems. New J Phys. 18 (5), 055001 (2016).
- Schiffels, D., Liedl, T., Fygenson, D. K. Nanoscale Structure and Microscale Stiffness of DNA Nanotubes. ACS Nano. 7 (8), 6700-6710 (2013).
- Hariadi, R. F., Yurke, B., Winfree, E. Thermodynamics and kinetics of DNA nanotube polymerization from single-filament measurements. Chem Sci. 6 (4), 2252-2267 (2015).
- de Gennes, P. G. Reptation of a Polymer Chain in the Presence of Fixed Obstacles. J Chem Phys. 55 (2), 572-579 (1971).
- Huss, V. A. R., Festl, H., Schleifer, K. H. Studies on the spectrophotometric determination of DNA hybridization from renaturation rates. Syst Appl Microbio. 4 (2), 184-192 (1983).
- Breslauer, K. J., Frank, R., Blöcker, H., Marky, L. A. Predicting DNA duplex stability from the base sequence. Proc Natl Acad Sci U S A. 83 (11), 3746-3750 (1986).
- You, Y., Tataurov, A. V., Owczarzy, R. Measuring thermodynamic details of DNA hybridization using fluorescence. Biopolymers. 95 (7), 472-486 (2011).
- Zipper, H. Investigations on DNA intercalation and surface binding by SYBR Green I, its structure determination and methodological implications. Nucleic Acids Res. 32 (12), e103-e103 (2004).
- Sobczak, J. -. P. J., Martin, T. G., Gerling, T., Dietz, H. Rapid Folding of DNA into Nanoscale Shapes at Constant Temperature. Science. 338 (6113), 1458-1461 (2012).
- Snodin, B. E. K., Romano, F., Rovigatti, L., Ouldridge, T. E., Louis, A. A., Doye, J. P. K. Direct Simulation of the Self-Assembly of a Small DNA Origami. ACS Nano. 10 (2), 1724-1737 (2016).
- Das, R. K., Gocheva, V., Hammink, R., Zouani, O. F., Rowan, A. E. Stress-stiffening-mediated stem-cell commitment switch in soft responsive hydrogels. Nat Mater. 15 (3), 318-325 (2015).
- Sharma, A., et al. Strain-controlled criticality governs the nonlinear mechanics of fibre networks. Nat Phys. 12 (6), 584-587 (2016).
- Lieleg, O., Claessens, M. M. A. E., Bausch, A. R. Structure and dynamics of cross-linked actin networks. Soft Matter. 6 (2), 218-225 (2010).
- Claessens, M. M. A. E., Semmrich, C., Ramos, L., Bausch, A. R. Helical twist controls the thickness of F-actin bundles. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (26), 8819-8822 (2008).
- Claessens, M. M. A. E., Bathe, M., Frey, E., Bausch, A. R. Actin-binding proteins sensitively mediate F-actin bundle stiffness. Nat Mater. 5 (9), 748-753 (2006).
- Schnauß, J., Händler, T., Käs, J. Semiflexible Biopolymers in Bundled Arrangements. Polymers. 8 (8), 274 (2016).
- Heussinger, C., Schüller, F., Frey, E. Statics and dynamics of the wormlike bundle model. Phys Rev E. 81 (2), (2010).
- Schnauß, J., et al. Transition from a Linear to a Harmonic Potential in Collective Dynamics of a Multifilament Actin Bundle. Phys Rev Lett. 116 (10), (2016).
- Strehle, D., et al. Transiently crosslinked F-actin bundles. Eur Biophys J. 40 (1), 93-101 (2011).
- Backouche, F., Haviv, L., Groswasser, D., Bernheim-Groswasser, A. Active gels: dynamics of patterning and self-organization. Phys Biol. 3 (4), 264-273 (2006).
- Surrey, T. Physical Properties Determining Self-Organization of Motors and Microtubules. Science. 292 (5519), 1167-1171 (2001).
- Nedelec, F. J., Surrey, T., Maggs, A. C., Leibler, S. Self-organization of microtubules and motors. Nature. 389 (6648), 305-308 (1997).
- Smith, D., et al. Molecular Motor-Induced Instabilities and Cross Linkers Determine Biopolymer Organization. Biophys J. 93 (12), 4445-4452 (2007).
- Huber, F., Strehle, D., Schnauß, J., Käs, J. Formation of regularly spaced networks as a general feature of actin bundle condensation by entropic forces. New J Phys. 17 (4), 043029 (2015).
