DNA nanotüpler Semiflexible polimerler eğitim için çok yönlü bir araç olarak
Summary
Semiflexible polimerler canlı sistemler tarafından yaygın olarak uygulanan benzersiz mekanik özellikler görüntüler. Ancak, polimer sertlik gibi özellikleri erişilemez olduğundan biyopolimer sistematik çalışmalar sınırlıdır. Bu müsvedde filaman sertlik etkisi üzerinde deneysel çalışmalar etkinleştirme programlanabilir DNA nanotüpler tarafından bu sınırlama nasıl hile açıklar.
Abstract
Mekanik özellikleri maddenin karmaşık, polimer esaslı yumuşak hücreleri veya biyopolimer ağlar, gibi ben de klasik çerçevede esnek polimerlerin ne de katı çubuklar anlaşılabilir. Temel filamentler hangi sebat uzunluğu (lp) sayısal, onların sigara ufuk omurga sertlik nedeniyle, uzanmış kalır ama onlar da güçlü termal dalgalanmalara tabidir. Onların sonlu bükme sertlik büyük kafes boyutları sağlarken, düşük hacimli kesirler istikrarlı iskele oluşumunu sağlayan toplu ağlarını, benzersiz, önemsiz olmayan toplu mekaniği yol açar. Bu temel prensip yüksek moleküler içeriği ve böylece diffusive kolaylaştırmak veya aktif taşıma en aza indirme (Örneğin, hücreleri veya doku), doğada yaygındır. Onların biyolojik etkileri ve Biyouyumlu hydrogels potansiyel teknolojik uygulamalar nedeniyle, semiflexible polimerler tabi önemli çalışma olmuştur. Ancak, ondan beri onlar gibi serbestçe ayarlanabilir değildir aktin filamentleri doğal polimerler dayanıyordu anlaşılır araştırmalar zorlu kaldı. Bu sınırlamalar rağmen ve sentetik, mekanik olarak ayarlanabilir ve semiflexible polimerler eksikliği nedeniyle aktin filamentleri ortak modeli sistem olarak kurulmuştur. Merkezi miktar lp serbestçe makroskopik toplu yapıları üzerindeki etkisini incelemek için ayarlı değil bir büyük kısıtlamadır. Bu sınırlama ile kontrollü filaman sertlik İLETİMLERİNİZE etkinleştirme yapısal olarak programlanabilir DNA nanotüpler istihdam ederek giderilmiştir. Onlar nerede kısmen tamamlayıcı iplikçikleri ayrı bir dizi melezlemek ayrı bir çevresi ile bir yüzük yapıda kiremit tabanlı tasarımlar meydana gelir. Bu halkalar yapışkan biter, etkili polimerizasyon filamentler içine birkaç mikron uzunluğunda, etkinleştirme özelliği ve benzer polimerizasyon Kinetik doğal biyopolimer görüntüler. Onların programlanabilir mekaniği nedeniyle bu tüpler lp tek molekül yanı sıra toplu ölçek etkisini incelemek için çok yönlü, yeni araçlardır. Aktin filamentleri, aksine onlar olmadan önemli dejenerasyon, hafta boyunca istikrarlı kalır ve kullandıklarında daha nispeten kolaydır.
Introduction
Kendi benzersiz mekanik özellikleri tarafından etkin karmaşık davranışları nedeniyle semiflexible polimerler yaşam maddenin temel yapı taşları vardır. Esnek polimerler aksine semiflexible polimerler hala güçlü termal dalgalanmaları1tabi kalarak uzanmış bir yapılandırma onların sigara ufuk omurga sertlik nedeniyle evlat. Böylece, tamamen Stokastik Modeller ile tam esnek veya rijit polimerler gibi aşırı davranışları için uygulanamaz. Sözde solucan benzeri zinciri modeli2,3,4 lp, üzerinden bu sertlik çürümesine sabit boyunca filaman4tanjant-teğet korelasyon olduğu ölçmek için geliştirilmiştir. Lp filaman kontur uzunluğu (lc) karşılaştırılabilir ise, polimer semiflexible1kabul edilir. Benzer bir çadır direkleri, kendi düzenlemeleri ağlar veya demetleri tüm toplu sistem düşük hacimli kesirler, sıradışı visko elastik özellikleri5,6,7‘ yelider, stabilize, 8,9. Bu yapıların yüksek elasticities geniş boyutları10hala diffusive kolaylaştırılması ve aktif taşıma işlemleri sırasında mekanik bütünlüğünü korumak, kafes sağlamak. Bu özellik özellikle sitoiskeleti veya hücre dışı matriks gibi biyolojik sistemleri için uygundur, ancak Gıda Mühendisliği1,11,12‘ de yaygın olarak kullanılır.
Bunların önemini yaşayan konuya gidiyor, kapsamlı bir şekilde biomimetic malzeme veya roman hydrogels geliştirmek için araçlar için bu yapıların fiziksel özelliklerini incelemek önemlidir. Semiflexible polimerler açısından bu lp ve açıklayıcı bir Kuramsal çerçeve geliştirilmesi gibi tek-filament özelliklerinden kaynaklanan ağlarının toplu özelliklerini sistematik olarak belirlenmesi anlamına gelir. Öncü çalışmalar, hücresel biyopolimer aktin semiflexible polimerler için bir model sistem olarak kurulmuş ve hala yaygın olarak altın standart5,13,14,15 olarak kabul edilir , 16 , 17. bu proteinin doğal özelliklerine bağlıdır beri Ancak, ayrıntılı çalışmalar bu sistemi ile sınırlıdır. Çeşitli teorik yaklaşımlar tek-filament düzeyinde olmayan önemsiz mekanik davranışları açıklamasını binasında nişan ve özellikle farklı ölçekleme öngörüleri doğrusal elastik Yaylası kesme modülü, G için bağımlılığı için yol açmıştır 0 (Yani, ağ “esneklik”), konsantrasyon (c) ve lp6,7,13,14, 15,18,19,20,21,22,23. Konsantrasyon ölçekleme aktin esaslı ile deneyler veya diğer model sistemleri kolayca erişilebilir olmakla ve teorik Öngörüler titizlikle olmuştur iken13,16,24, doğrulanmadı 25, lp ile ilgili olarak ölçekleme deneysel olarak erişilemeyen kalmıştır. Ayrıca semiflexible polimerler belirleyici miktarıdır bağımsız bir değişken olduğu için lp bu, ancak, büyük bir sınırlama var.
Bu Merkez, doğal sınırlama aktin sabit lp veya diğer biyolojik kaynaklı polimerler kollajen gibi son zamanlarda mekanik özelliklerini tunable kiremit tabanlı DNA tüpler, istihdam ederek çözümlenmiş 9 , 26 , 27 , 28. mimarileri hafif değişimler (örn., farklı sayıda kurucu DNA iplikçikleri birim halka içinde) tüplerin verim lpFloresans mikroskobu ile değerlendirilebilir, için farklı değerler olarak bir dalgalanan tüp analiz veya birkaç yapıştırılır tüpler eğri yapılandırmaları değerlendirilmesi,9,28daha önce açıklanan. Bu analizler lp değerleri farklı tüp nüfusun birden fazla büyüklük üzerinde değişiklik ve farklı değerlendirme teknikleri tutarlı sonuçlar9,28verim saptandı.
Doğal olarak, konsantrasyon ve lp doğrusal elastik Yaylası kesme modül G0 genel ölçeklendirme tüm önceki teorik yaklaşımlar ile tutarsız olarak bildirilmiştir özellikle bir çok gösteren 9, lptahmin edilen bağımlı daha güçlü. Bu bulgular semiflexible polimerler Merkezi özelliklerini incelemek için yeni bir modeli sistem değerini vurgulamak. Nistihdam-sarmal DNA tüpler önemli ölçüde bu soruşturmalar kapsamını genişletiyor. Sadece lp temel malzeme değiştirmeden serbestçe değiştirilebilir, ancak DNA’ın doğasında programlanabilir doğa Glossar veya Kinetik anahtarlama işlemleri gibi ek öğeleri sistematik incelenmesi etkinleştirebilirsiniz. Ayrıca, bu tüpler suda çözünür ve yeterli pH ve algılanabilir bozulması9olmadan birkaç hafta iyonik koşullarında çoğu proteinler aksine, istikrarlı.
Bu tüpler birleştirmek için kullanılan DNA oligonucleotides ayrı bir kümesi, her biri iki komşu iplikçik için tamamlayıcı temel sıraları paylaşan iki etki alanı içeren (belirli dizileri nedeniyle, bir tek tel saç pins gibi yapıların oluşamıyor). Tamamlayıcı dizileri birbirine bağlı n çift sarmallı kesimleri kapalı, yarı üst üste halkaları oluşturan bir döngüsel şekilde melezlemek (şekil 1A ve B). Bu yüzük form Kesikli çapı (şekil 1 c) ve yarı üst üste yapılandırmalarını Aksiyel yapışkan uçlar başka bir yüzük yapışkan sonuna kadar tamamlayıcı gösterir. Oligonucleotides eşleşen bu seçmeli ek Yüzüklerin ipliksi DNA sarmalı tüpler boyutu n (nHT) etkili polimerizasyon için önde gelen bir istifleme tetikler. Kontur onların uzunlukları genellikle birkaç mikron uzunluğunda ölçmek ve onların uzunluğu dağıtım aktin filamentleri9,26,27,28karşılaştırılabilir. Onlar gerçekten de polimerizasyon Kinetik bu aktin filamentleri ve mikrotübüller benzer sergilemek için benzer DNA nanotüpler gösterilmiştirp sınıf “xref” = > 29. Sayı n temel halka yapısı kadar yapma bireysel DNA iplikçiklerinin bağlı olarak, nHT mimari, hem de circumference ve diameter, controllably değiştirilebilir. Yüzük/tüpler çevresi artırır daha fazla DNA dizilerini kullanarak ve daha yüksek rijidite için karşılık gelen yüksek lp değerleri (şekil 1 c), mekanik özelliklerine karşılık gelen mimari değişikliği kaydırır. Mezoskopik ölçekte daha yüksek sertlik nedeniyle daha az bükülmüş biçimler bu büyük lp değerleri çevirmek (şekil 1 d ve E).
Protocol
Representative Results
Discussion
Uygun şekilde oluşturulmuş ağlar elde etmek için DNA nanotüpler montaj önemli bir adımdır. Sentez işlemi sırasında hatalar tüp kalite olumsuz; Bu nedenle, HPLC veya daha sıkı bir süreç oligonucleotides arındırmak için kullanılması önerilir. N kurucu oligonucleotides kümesi içinde ekimolar stoichiometry üzerine toplanan DNA nanotüpler yanı sıra kendi uzunluğu dağıtım yerine ayrık oluşumu bağlı olduğundan, konsantrasyonları remeasure gereklidir satın alınan ipliklerini beri…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz finansman DFG (1116/17-1) ve Leipzig doğal bilimler “BuildMoNa” (GSC 185) tarafından kabul. Bu eser Fraunhofer çekin projeye 601 683 desteklemiştir. T. H. Avrupa Sosyal Fonu (ESF-100077106) finansman kabul eder.
Materials
| AFM cantilever ACTA | AppNano | ||
| AFM – NanoWizard 3 | JPK Instruments | ||
| CCD camera | Andor | iXon DV887 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DNA oligonucleotides | Biomers.net | For sequences see Table 1 | |
| DNA Cy3-labeled oligonucleotides | Biomers.net | For sequence see Table 1 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E-9884 | |
| Epi-fluorescence micro-scope | Leica | DM-IRB | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M-8266 | |
| Mica "V1", 12 mm round | Plano GmbH | 50-12 | |
| MicroAmp® Fast Optical 96-Well Reaction Plate | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4346907 | |
| MicroAmp® Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4306311 | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| 100x objective | Leica5 | 506168 | |
| Purified water | Merk Millipore – Milli-Q & Elix | ||
| Sapphire PCR tubes | Greiner Bio-One | 683271 | |
| TProfessional Standard PCR Thermocycler | Core Life Sciences Inc. | 070- Standard | |
| 7900HT Fast Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4351405 | |
| Rheometer | TA Instruments | ARES | |
| SYBR® Green I nucleic acid gel stain | Thermo Fisher Scientific Inc. | S7567 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T4661 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich Co. | X-100 | Suppresses evaporation of sample at air-water interface |
Referências
- Huber, F., et al. Emergent complexity of the cytoskeleton: from single filaments to tissue. Adv Phys. 62 (1), 1-112 (2013).
- Kratky, O., Porod, G. Röntgenuntersuchung gelöster Fadenmoleküle. Recl Trav Chim Pays-Bas. 68 (12), 1106-1122 (1949).
- Saitô, N., Takahashi, K., Yunoki, Y. The Statistical Mechanical Theory of Stiff Chains. J Phys Soc Jpn. 22 (1), 219-226 (1967).
- Doi, M., Edwards, S. F. . The Theory of Polymer Dynamics. , (1986).
- Mueller, O., Gaub, H. E., Baermann, M., Sackmann, E. Viscoelastic moduli of sterically and chemically cross-linked actin networks in the dilute to semidilute regime: measurements by oscillating disk rheometer. Macromolecules. 24 (11), 3111-3120 (1991).
- MacKintosh, F. C., Käs, J., Janmey, P. A. Elasticity of semiflexible biopolymer networks. Phys Rev Lett. 75 (24), 4425-4428 (1995).
- Gardel, M. L. Elastic Behavior of Cross-Linked and Bundled Actin Networks. Science. 304 (5675), 1301-1305 (2004).
- Sonn-Segev, A., Bernheim-Groswasser, A., Diamant, H., Roichman, Y. Viscoelastic Response of a Complex Fluid at Intermediate Distances. Phys Rev Lett. 112 (8), (2014).
- Schuldt, C., et al. Tuning Synthetic Semiflexible Networks by Bending Stiffness. Phys Rev Lett. 117 (19), (2016).
- Käs, J., et al. F-actin, a model polymer for semiflexible chains in dilute, semidilute, and liquid crystalline solutions. Biophys J. 70 (2), 609-625 (1996).
- Ross-Murphy, S. B. Structure-property relationships in food biopolymer gels and solutions. J Rheol. 39 (6), 1451-1463 (1995).
- Fletcher, D. A., Mullins, R. D. Cell mechanics and the cytoskeleton. Nature. 463 (7280), 485-492 (2010).
- Hinner, B., Tempel, M., Sackmann, E., Kroy, K., Frey, E. Entanglement, Elasticity, and Viscous Relaxation of Actin Solutions. Phys Rev Lett. 81 (12), 2614-2617 (1998).
- Palmer, A., Mason, T. G., Xu, J., Kuo, S. C., Wirtz, D. Diffusing Wave Spectroscopy Microrheology of Actin Filament Networks. Biophys J. 76 (2), 1063-1071 (1999).
- Gardel, M. L., Valentine, M. T., Crocker, J. C., Bausch, A. R., Weitz, D. A. Microrheology of Entangled F-Actin Solutions. Phys Rev Lett. 91 (15), (2003).
- Liu, J., et al. Microrheology Probes Length Scale Dependent Rheology. Phys Rev Lett. 96 (11), (2006).
- Golde, T., Schuldt, C., Schnauß, J., Strehle, D., Glaser, M., Käs, J. Fluorescent beads disintegrate actin networks. Phys Rev E. 88 (4), (2013).
- Isambert, H., Maggs, A. C. Dynamics and Rheology of Actin Solutions. Macromolecules. 29 (3), 1036-1040 (1996).
- Käs, J., Strey, H., Sackmann, E. Direct imaging of reptation for semiflexible actin filaments. Nature. 368 (6468), 226-229 (1994).
- Schmidt, C. F., Baermann, M., Isenberg, G., Sackmann, E. Chain dynamics, mesh size, and diffusive transport in networks of polymerized actin: a quasielastic light scattering and microfluorescence study. Macromolecules. 22 (9), 3638-3649 (1989).
- Kroy, K., Frey, E. Force-Extension Relation and Plateau Modulus for Wormlike Chains. Phys Rev Lett. 77 (2), 306-309 (1996).
- Morse, D. C. Tube diameter in tightly entangled solutions of semiflexible polymers. Phys Rev E. 63 (3), (2001).
- Broedersz, C. P., MacKintosh, F. C. Modeling semiflexible polymer networks. Rev Mod Phys. 86 (3), 995-1036 (2014).
- Tassieri, M., Evans, R. M. L., Barbu-Tudoran, L., Khaname, G. N., Trinick, J., Waigh, T. A. Dynamics of Semiflexible Polymer Solutions in the Highly Entangled Regime. Phys Rev Lett. 101 (19), (2008).
- Non-Affine Shear Modulus in Entangled Networks of Semiflexible Polymers. arXiv:0907.1875[cond-mat] Available from: https://arxiv.org/abs/0907.1875 (2009)
- Yin, P., et al. Programming DNA Tube Circumferences. Science. 321 (5890), 824-826 (2008).
- Glaser, M., et al. Self-assembly of hierarchically ordered structures in DNA nanotube systems. New J Phys. 18 (5), 055001 (2016).
- Schiffels, D., Liedl, T., Fygenson, D. K. Nanoscale Structure and Microscale Stiffness of DNA Nanotubes. ACS Nano. 7 (8), 6700-6710 (2013).
- Hariadi, R. F., Yurke, B., Winfree, E. Thermodynamics and kinetics of DNA nanotube polymerization from single-filament measurements. Chem Sci. 6 (4), 2252-2267 (2015).
- de Gennes, P. G. Reptation of a Polymer Chain in the Presence of Fixed Obstacles. J Chem Phys. 55 (2), 572-579 (1971).
- Huss, V. A. R., Festl, H., Schleifer, K. H. Studies on the spectrophotometric determination of DNA hybridization from renaturation rates. Syst Appl Microbio. 4 (2), 184-192 (1983).
- Breslauer, K. J., Frank, R., Blöcker, H., Marky, L. A. Predicting DNA duplex stability from the base sequence. Proc Natl Acad Sci U S A. 83 (11), 3746-3750 (1986).
- You, Y., Tataurov, A. V., Owczarzy, R. Measuring thermodynamic details of DNA hybridization using fluorescence. Biopolymers. 95 (7), 472-486 (2011).
- Zipper, H. Investigations on DNA intercalation and surface binding by SYBR Green I, its structure determination and methodological implications. Nucleic Acids Res. 32 (12), e103-e103 (2004).
- Sobczak, J. -. P. J., Martin, T. G., Gerling, T., Dietz, H. Rapid Folding of DNA into Nanoscale Shapes at Constant Temperature. Science. 338 (6113), 1458-1461 (2012).
- Snodin, B. E. K., Romano, F., Rovigatti, L., Ouldridge, T. E., Louis, A. A., Doye, J. P. K. Direct Simulation of the Self-Assembly of a Small DNA Origami. ACS Nano. 10 (2), 1724-1737 (2016).
- Das, R. K., Gocheva, V., Hammink, R., Zouani, O. F., Rowan, A. E. Stress-stiffening-mediated stem-cell commitment switch in soft responsive hydrogels. Nat Mater. 15 (3), 318-325 (2015).
- Sharma, A., et al. Strain-controlled criticality governs the nonlinear mechanics of fibre networks. Nat Phys. 12 (6), 584-587 (2016).
- Lieleg, O., Claessens, M. M. A. E., Bausch, A. R. Structure and dynamics of cross-linked actin networks. Soft Matter. 6 (2), 218-225 (2010).
- Claessens, M. M. A. E., Semmrich, C., Ramos, L., Bausch, A. R. Helical twist controls the thickness of F-actin bundles. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (26), 8819-8822 (2008).
- Claessens, M. M. A. E., Bathe, M., Frey, E., Bausch, A. R. Actin-binding proteins sensitively mediate F-actin bundle stiffness. Nat Mater. 5 (9), 748-753 (2006).
- Schnauß, J., Händler, T., Käs, J. Semiflexible Biopolymers in Bundled Arrangements. Polymers. 8 (8), 274 (2016).
- Heussinger, C., Schüller, F., Frey, E. Statics and dynamics of the wormlike bundle model. Phys Rev E. 81 (2), (2010).
- Schnauß, J., et al. Transition from a Linear to a Harmonic Potential in Collective Dynamics of a Multifilament Actin Bundle. Phys Rev Lett. 116 (10), (2016).
- Strehle, D., et al. Transiently crosslinked F-actin bundles. Eur Biophys J. 40 (1), 93-101 (2011).
- Backouche, F., Haviv, L., Groswasser, D., Bernheim-Groswasser, A. Active gels: dynamics of patterning and self-organization. Phys Biol. 3 (4), 264-273 (2006).
- Surrey, T. Physical Properties Determining Self-Organization of Motors and Microtubules. Science. 292 (5519), 1167-1171 (2001).
- Nedelec, F. J., Surrey, T., Maggs, A. C., Leibler, S. Self-organization of microtubules and motors. Nature. 389 (6648), 305-308 (1997).
- Smith, D., et al. Molecular Motor-Induced Instabilities and Cross Linkers Determine Biopolymer Organization. Biophys J. 93 (12), 4445-4452 (2007).
- Huber, F., Strehle, D., Schnauß, J., Käs, J. Formation of regularly spaced networks as a general feature of actin bundle condensation by entropic forces. New J Phys. 17 (4), 043029 (2015).
