Nanotubos de ADN como una herramienta versátil para el estudio de polímeros Semiflexible
Summary
Polímeros semiflexible mostrar propiedades mecánicas únicas que se aplican extensivamente por los sistemas de vida. Sin embargo, estudios sistemáticos sobre biopolímeros son limitados puesto que propiedades como la rigidez del polímero son inaccesibles. Este manuscrito describe cómo esta limitación es burlada por nanotubos de ADN programables, permitiendo estudios experimentales sobre los efectos de la rigidez del filamento.
Abstract
Propiedades mecánicas de la materia suave complejo, basados en polímeros, tales como células o redes de biopolímero, pueden entenderse en ninguno de los dos el marco clásico de polímeros flexibles ni de varillas rígidas. Filamentos subyacentes permanecen extendidos debido a su rigidez de columna vertebral no desaparece, que es cuantificada a través de la longitud de persistencia (lp), pero también están sujetos a fuertes fluctuaciones térmicas. Su rigidez de flexión finita conduce a la mecánica colectiva única, no trivial de redes a granel, lo que permite la formación de andamios estables en fracciones de volumen bajo mientras que proporciona los tamaños de malla grande. Este principio subyacente es frecuente en la naturaleza (por ejemplo, en células o tejidos), minimizando el alto contenido molecular y facilitando la difusión o transporte activo. Debido a sus implicaciones biológicas y potenciales aplicaciones tecnológicas en hidrogeles biocompatibles, semiflexible polímeros han sido objeto de considerable estudio. Sin embargo, investigaciones comprensibles seguía siendo difíciles desde que los polímeros naturales, tales como filamentos de actina, que no son libremente ajustables. A pesar de estas limitaciones y debido a la falta de polímeros sintéticos, mecánicamente ajustables y semiflexible, filamentos de actina se establecieron como el sistema de modelo común. Una limitación importante es que la cantidad central lp no puede ajustarse libremente para estudiar su impacto en las estructuras macroscópicas a granel. Esta limitación fue resuelto mediante el empleo de nanotubos de ADN estructuralmente programables, permitiendo la alteración controlada de la rigidez del filamento. Se forman a través de diseños de azulejos, donde un discreto conjunto de filamentos parcialmente complementarios hibridar en una estructura de anillo con una circunferencia de discreta. Estos anillos presentan extremos pegajosos, lo que permite la polimerización efectiva en filamentos de varias micras de longitud y mostrar la cinética de polimerización similar como biopolímeros naturales. Debido a su mecánica programable, estos tubos son herramientas versátiles, novela para estudiar el impacto de lp de la solo-molécula así como la escala mayor. En contraste con los filamentos de actina, permanecen estables durante semanas, sin notable degeneración, y su manejo es sencillo comparable.
Introduction
Debido a los comportamientos complejos habilitados por sus propiedades mecánicas únicas, polímeros semiflexible son bloques de construcción fundamentales de la materia viva. En contraste con los polímeros flexibles, semiflexible polímeros adoptan una configuración extendida debido a su rigidez de la columna vertebral no desapareciendo mientras que aún permanecen sujetos a fuertes fluctuaciones térmicas1. Por lo tanto, modelos puramente estocásticos no pueden aplicarse a sus comportamientos, al igual que con los extremos de los polímeros rígidos o totalmente flexibles. El supuesto gusano-como cadena modelo2,3,4 fue desarrollado para cuantificar esta rigidez por medio del lp, que es la constante de decaimiento de la correlación de tangente-tangente a lo largo de los filamentos4. Si lp es comparable a la longitud del contorno (lc) del filamento, el polímero se considera semiflexible1. Análogo a los polos de una tienda de campaña, sus arreglos en redes o en haces se estabiliza el sistema colectivo en fracciones de bajo volumen, a viscoelástica inusuales propiedades5,6,7, 8,9. Estas estructuras proporcionan tamaños10, manteniendo la integridad mecánica sigue facilitando la difusión y procesos de transporte activo de malla de alta elasticidad en general. Esta propiedad es especialmente conveniente para los sistemas biológicos como el citoesqueleto con la matriz extracelular, pero es también ampliamente utilizado en alimentos ingeniería1,11,12.
Va más allá de su importancia a la materia viva, es crucial examinar exhaustivamente las propiedades físicas de estas estructuras para poder tener las herramientas para desarrollar materiales biomiméticos o hidrogeles novela. En términos de polímeros semiflexible, esto implica la determinación sistemática de las propiedades colectivas de las redes resultantes de propiedades solo filamento como lp y el desarrollo de un marco teórico descriptivo. En estudios pioneros, la actina celular biopolímero se estableció como un sistema modelo para polímeros semiflexible y todavía es considerada como el estándar de oro5,13,14,15 , 16 , 17. sin embargo, estudios exhaustivos se limitan con este sistema ya que están limitados a las propiedades inherentes de esta proteína. Varios enfoques teóricos han destinado a la construcción de una descripción de los comportamientos mecánicos no triviales en el nivel del solo filamento y han provocado especialmente diferentes escala las predicciones para la dependencia del módulo del esquileo meseta elástico lineal, G 0 (es decir, la “elasticidad” de la red), con respecto a la concentración (c) y lp6,7,13,14, 15,18,19,20,21,22,23. Mientras que la escala de concentración es fácilmente accesible en experimentos con actinia-basado o en otros sistemas modelo y mientras que las predicciones teóricas han sido rigurosamente verificado13,16,24, 25, la escala con respecto a lp ha permanecido inaccesible experimentalmente. Esto, sin embargo, es una limitación importante, ya que lp es también una variable independiente que es la definición cantidad de polímeros semiflexible.
Esta limitación natural, central impuesta por fijo lp de la actina o de otros polímeros biológicamente derivados tales como colágeno ha sido recientemente resuelto mediante el empleo de tubos de ADN basada en azulejos, que son ajustables en sus propiedades mecánicas 9 , 26 , 27 , 28. ligeras variaciones en las arquitecturas de los tubos (por ejemplo, diferentes cantidades de ADN constituyen filamentos dentro del anillo de la unidad) producen distintos valores para lp, que puede evaluarse mediante microscopía de fluorescencia, analizando un tubo fluctuante o mediante la evaluación de las configuraciones de curvas de varios tubos adheridos, como se ha descrito anteriormente9,28. Estos análisis revelaron que lp valores de las poblaciones de tubo diferentes varían en más de un orden de magnitud y que técnicas de evaluación diferentes dan resultados consistentes9,28.
Sorprendentemente, la escala total de la meseta elástico lineal cortante módulo G0 con respecto a la concentración y lp se ha divulgado para ser incompatibles con los anteriores planteamientos teóricos 9, demostrando en particular mucho más fuerte que prevista dependencia lp. Estos resultados enfatizan el valor de un nuevo sistema modelo para estudiar las propiedades centrales de polímeros semiflexible. Empleando n-tubos de ADN hélice dramáticamente amplía el alcance de estas investigaciones. No sólo puede lp libremente variar sin cambiar la materia prima, sino la propia naturaleza programable del ADN permite el examen sistemático de elementos adicionales, tales como reticulaciones o procesos cinéticos de conmutación. Además, estos tubos son solubles en agua y, en contraste con la mayoría de las proteínas, estables en pH adecuado y condiciones iónicas durante varias semanas, sin degradación perceptible9.
A estos tubos, se utiliza un conjunto discreto de oligonucleótidos de ADN, que contiene dos dominios que comparten secuencias complementarias de base a los dos filamentos vecinos (debido a las secuencias específicas, un solo filamento no puede formar estructuras como horquillas para el cabello). Las secuencias complementarias hibridan de forma cíclica, formando anillos cerrados, superposición de mitad de segmentos helicoidales doble n interconectadas (figura 1A y B). Éstos forman anillos discretos de diámetro (figura 1), y su configuración de medio traslapo expone axiales extremos pegajosos complementarios a los extremos pegajosos de otro anillo. Esta adición selectiva de emparejar oligonucleótidos desencadena un apilamiento de los anillos, conduciendo a la polimerización efectiva de filamentosos tubos de hélice de ADN de tamaño n (nHT). Sus longitudes contornos miden típicamente varias micras de longitud, y su distribución de la longitud es comparable a la de actina filamentos9,26,27,28. Se ha demostrado para nanotubos de ADN similares que de hecho presentan cinética de polimerización similar a las de los microtúbulos y filamentos de actinaclase p = “xref” > 29. Según el número n de los filamentos de la DNA que componen la estructura básica del anillo, la arquitectura nHT, así como su circunferencia y diámetro, pueden controllably variar. Usando más hebras de ADN aumenta la circunferencia de los tubos de anillos, y el correspondiente cambio arquitectónico cambia las propiedades mecánicas a valores más altos dep l(figura 1), correspondiente a una rigidez más alta. En la escala mesoscópica, estos valores dep mayores de ltraducen en conformaciones menos doblados debido a la tiesura más alta (figura 1 y E).
Protocol
Representative Results
Discussion
Para obtener correctamente formadas redes, montaje de los nanotubos de ADN es un paso crucial. Errores durante el proceso de síntesis un impacto negativo en la calidad del tubo; por lo tanto, se recomienda usar HPLC o un proceso más riguroso para purificar los oligonucleótidos. Puesto que la formación de discretos en lugar de agregados nanotubos de ADN, así como su distribución de longitud, depende de la estequiometría equimolar de los oligonucleótidos constituyentes n dentro del conjunto, es necesario q…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Reconocemos financiación por DFG (1116/17-1) y la Facultad de Ciencias naturales de Leipzig “BuildMoNa” (SGC 185). Este trabajo ha sido apoyado a través del proyecto de Fraunhofer atraer 601 683. T. H. reconoce la financiación del Fondo Social Europeo (FSE-100077106).
Materials
| AFM cantilever ACTA | AppNano | ||
| AFM – NanoWizard 3 | JPK Instruments | ||
| CCD camera | Andor | iXon DV887 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DNA oligonucleotides | Biomers.net | For sequences see Table 1 | |
| DNA Cy3-labeled oligonucleotides | Biomers.net | For sequence see Table 1 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E-9884 | |
| Epi-fluorescence micro-scope | Leica | DM-IRB | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M-8266 | |
| Mica "V1", 12 mm round | Plano GmbH | 50-12 | |
| MicroAmp® Fast Optical 96-Well Reaction Plate | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4346907 | |
| MicroAmp® Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4306311 | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| 100x objective | Leica5 | 506168 | |
| Purified water | Merk Millipore – Milli-Q & Elix | ||
| Sapphire PCR tubes | Greiner Bio-One | 683271 | |
| TProfessional Standard PCR Thermocycler | Core Life Sciences Inc. | 070- Standard | |
| 7900HT Fast Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4351405 | |
| Rheometer | TA Instruments | ARES | |
| SYBR® Green I nucleic acid gel stain | Thermo Fisher Scientific Inc. | S7567 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T4661 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich Co. | X-100 | Suppresses evaporation of sample at air-water interface |
Referências
- Huber, F., et al. Emergent complexity of the cytoskeleton: from single filaments to tissue. Adv Phys. 62 (1), 1-112 (2013).
- Kratky, O., Porod, G. Röntgenuntersuchung gelöster Fadenmoleküle. Recl Trav Chim Pays-Bas. 68 (12), 1106-1122 (1949).
- Saitô, N., Takahashi, K., Yunoki, Y. The Statistical Mechanical Theory of Stiff Chains. J Phys Soc Jpn. 22 (1), 219-226 (1967).
- Doi, M., Edwards, S. F. . The Theory of Polymer Dynamics. , (1986).
- Mueller, O., Gaub, H. E., Baermann, M., Sackmann, E. Viscoelastic moduli of sterically and chemically cross-linked actin networks in the dilute to semidilute regime: measurements by oscillating disk rheometer. Macromolecules. 24 (11), 3111-3120 (1991).
- MacKintosh, F. C., Käs, J., Janmey, P. A. Elasticity of semiflexible biopolymer networks. Phys Rev Lett. 75 (24), 4425-4428 (1995).
- Gardel, M. L. Elastic Behavior of Cross-Linked and Bundled Actin Networks. Science. 304 (5675), 1301-1305 (2004).
- Sonn-Segev, A., Bernheim-Groswasser, A., Diamant, H., Roichman, Y. Viscoelastic Response of a Complex Fluid at Intermediate Distances. Phys Rev Lett. 112 (8), (2014).
- Schuldt, C., et al. Tuning Synthetic Semiflexible Networks by Bending Stiffness. Phys Rev Lett. 117 (19), (2016).
- Käs, J., et al. F-actin, a model polymer for semiflexible chains in dilute, semidilute, and liquid crystalline solutions. Biophys J. 70 (2), 609-625 (1996).
- Ross-Murphy, S. B. Structure-property relationships in food biopolymer gels and solutions. J Rheol. 39 (6), 1451-1463 (1995).
- Fletcher, D. A., Mullins, R. D. Cell mechanics and the cytoskeleton. Nature. 463 (7280), 485-492 (2010).
- Hinner, B., Tempel, M., Sackmann, E., Kroy, K., Frey, E. Entanglement, Elasticity, and Viscous Relaxation of Actin Solutions. Phys Rev Lett. 81 (12), 2614-2617 (1998).
- Palmer, A., Mason, T. G., Xu, J., Kuo, S. C., Wirtz, D. Diffusing Wave Spectroscopy Microrheology of Actin Filament Networks. Biophys J. 76 (2), 1063-1071 (1999).
- Gardel, M. L., Valentine, M. T., Crocker, J. C., Bausch, A. R., Weitz, D. A. Microrheology of Entangled F-Actin Solutions. Phys Rev Lett. 91 (15), (2003).
- Liu, J., et al. Microrheology Probes Length Scale Dependent Rheology. Phys Rev Lett. 96 (11), (2006).
- Golde, T., Schuldt, C., Schnauß, J., Strehle, D., Glaser, M., Käs, J. Fluorescent beads disintegrate actin networks. Phys Rev E. 88 (4), (2013).
- Isambert, H., Maggs, A. C. Dynamics and Rheology of Actin Solutions. Macromolecules. 29 (3), 1036-1040 (1996).
- Käs, J., Strey, H., Sackmann, E. Direct imaging of reptation for semiflexible actin filaments. Nature. 368 (6468), 226-229 (1994).
- Schmidt, C. F., Baermann, M., Isenberg, G., Sackmann, E. Chain dynamics, mesh size, and diffusive transport in networks of polymerized actin: a quasielastic light scattering and microfluorescence study. Macromolecules. 22 (9), 3638-3649 (1989).
- Kroy, K., Frey, E. Force-Extension Relation and Plateau Modulus for Wormlike Chains. Phys Rev Lett. 77 (2), 306-309 (1996).
- Morse, D. C. Tube diameter in tightly entangled solutions of semiflexible polymers. Phys Rev E. 63 (3), (2001).
- Broedersz, C. P., MacKintosh, F. C. Modeling semiflexible polymer networks. Rev Mod Phys. 86 (3), 995-1036 (2014).
- Tassieri, M., Evans, R. M. L., Barbu-Tudoran, L., Khaname, G. N., Trinick, J., Waigh, T. A. Dynamics of Semiflexible Polymer Solutions in the Highly Entangled Regime. Phys Rev Lett. 101 (19), (2008).
- Non-Affine Shear Modulus in Entangled Networks of Semiflexible Polymers. arXiv:0907.1875[cond-mat] Available from: https://arxiv.org/abs/0907.1875 (2009)
- Yin, P., et al. Programming DNA Tube Circumferences. Science. 321 (5890), 824-826 (2008).
- Glaser, M., et al. Self-assembly of hierarchically ordered structures in DNA nanotube systems. New J Phys. 18 (5), 055001 (2016).
- Schiffels, D., Liedl, T., Fygenson, D. K. Nanoscale Structure and Microscale Stiffness of DNA Nanotubes. ACS Nano. 7 (8), 6700-6710 (2013).
- Hariadi, R. F., Yurke, B., Winfree, E. Thermodynamics and kinetics of DNA nanotube polymerization from single-filament measurements. Chem Sci. 6 (4), 2252-2267 (2015).
- de Gennes, P. G. Reptation of a Polymer Chain in the Presence of Fixed Obstacles. J Chem Phys. 55 (2), 572-579 (1971).
- Huss, V. A. R., Festl, H., Schleifer, K. H. Studies on the spectrophotometric determination of DNA hybridization from renaturation rates. Syst Appl Microbio. 4 (2), 184-192 (1983).
- Breslauer, K. J., Frank, R., Blöcker, H., Marky, L. A. Predicting DNA duplex stability from the base sequence. Proc Natl Acad Sci U S A. 83 (11), 3746-3750 (1986).
- You, Y., Tataurov, A. V., Owczarzy, R. Measuring thermodynamic details of DNA hybridization using fluorescence. Biopolymers. 95 (7), 472-486 (2011).
- Zipper, H. Investigations on DNA intercalation and surface binding by SYBR Green I, its structure determination and methodological implications. Nucleic Acids Res. 32 (12), e103-e103 (2004).
- Sobczak, J. -. P. J., Martin, T. G., Gerling, T., Dietz, H. Rapid Folding of DNA into Nanoscale Shapes at Constant Temperature. Science. 338 (6113), 1458-1461 (2012).
- Snodin, B. E. K., Romano, F., Rovigatti, L., Ouldridge, T. E., Louis, A. A., Doye, J. P. K. Direct Simulation of the Self-Assembly of a Small DNA Origami. ACS Nano. 10 (2), 1724-1737 (2016).
- Das, R. K., Gocheva, V., Hammink, R., Zouani, O. F., Rowan, A. E. Stress-stiffening-mediated stem-cell commitment switch in soft responsive hydrogels. Nat Mater. 15 (3), 318-325 (2015).
- Sharma, A., et al. Strain-controlled criticality governs the nonlinear mechanics of fibre networks. Nat Phys. 12 (6), 584-587 (2016).
- Lieleg, O., Claessens, M. M. A. E., Bausch, A. R. Structure and dynamics of cross-linked actin networks. Soft Matter. 6 (2), 218-225 (2010).
- Claessens, M. M. A. E., Semmrich, C., Ramos, L., Bausch, A. R. Helical twist controls the thickness of F-actin bundles. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (26), 8819-8822 (2008).
- Claessens, M. M. A. E., Bathe, M., Frey, E., Bausch, A. R. Actin-binding proteins sensitively mediate F-actin bundle stiffness. Nat Mater. 5 (9), 748-753 (2006).
- Schnauß, J., Händler, T., Käs, J. Semiflexible Biopolymers in Bundled Arrangements. Polymers. 8 (8), 274 (2016).
- Heussinger, C., Schüller, F., Frey, E. Statics and dynamics of the wormlike bundle model. Phys Rev E. 81 (2), (2010).
- Schnauß, J., et al. Transition from a Linear to a Harmonic Potential in Collective Dynamics of a Multifilament Actin Bundle. Phys Rev Lett. 116 (10), (2016).
- Strehle, D., et al. Transiently crosslinked F-actin bundles. Eur Biophys J. 40 (1), 93-101 (2011).
- Backouche, F., Haviv, L., Groswasser, D., Bernheim-Groswasser, A. Active gels: dynamics of patterning and self-organization. Phys Biol. 3 (4), 264-273 (2006).
- Surrey, T. Physical Properties Determining Self-Organization of Motors and Microtubules. Science. 292 (5519), 1167-1171 (2001).
- Nedelec, F. J., Surrey, T., Maggs, A. C., Leibler, S. Self-organization of microtubules and motors. Nature. 389 (6648), 305-308 (1997).
- Smith, D., et al. Molecular Motor-Induced Instabilities and Cross Linkers Determine Biopolymer Organization. Biophys J. 93 (12), 4445-4452 (2007).
- Huber, F., Strehle, D., Schnauß, J., Käs, J. Formation of regularly spaced networks as a general feature of actin bundle condensation by entropic forces. New J Phys. 17 (4), 043029 (2015).
