DNA-Nanoröhren als ein vielseitiges Werkzeug, semiflexiblen Polymere zu studieren
Summary
Semiflexiblen Polymere zeigen einzigartige mechanische Eigenschaften, die ausgiebig von Lebewesen angewendet werden. Systematische Studien über Biopolymere sind jedoch beschränkt, da Eigenschaften wie Polymer Steifigkeit nicht zugänglich sind. Dieses Manuskript wird beschrieben, wie diese Einschränkung durch programmierbare DNA-Nanoröhren, experimentelle Studien über die Auswirkungen der Glühfaden Steifigkeit ermöglicht umgangen wird.
Abstract
Mechanische Eigenschaften von komplexen, Polymer-basierten weiche Materie, wie Zellen oder Biopolymer Netzwerke können im weder klassische Rahmen von flexiblen Polymeren noch starre Stäbe verstanden werden. Zugrunde liegenden Fäden bleiben ausgestreckten aufgrund ihrer nicht-verschwindende Rückgrat Steifigkeit, die über die Persistenz-Länge (lp) quantifiziert wird, aber sie sind auch starken thermischen Schwankungen unterworfen. Ihre endlicher Biegesteifigkeit führt zu einzigartigen, nicht-triviale kollektive Mechanik lose Netzwerke, ermöglicht die Bildung von stabilen Gerüste bei geringer Lautstärke Fraktionen gleichzeitig große Maschenweiten. Dieses Prinzip ist weit verbreitet in der Natur (z. B. in Zellen oder Gewebe), hohen Gehalt an molekularen und wodurch diffusive oder aktiven Transport zu minimieren. Aufgrund ihrer biologischen Auswirkungen und mögliche technologische Anwendungen in biokompatible Hydrogele wurden semiflexiblen Polymere beträchtliche Studie unterzogen. Nachvollziehbare Untersuchungen blieb jedoch herausfordernd, da sie auf natürlichen Polymeren, z. B. Actinfilamente, gestützt, die nicht frei einstellbaren sind. Trotz dieser Einschränkungen und aufgrund des Fehlens von synthetischen, mechanisch einstellbaren und semiflexiblen Polymere wurden Actinfilamente als gemeinsame Modellsystem etabliert. Eine große Einschränkung ist, dass die zentrale Menge lp frei optimiert werden kann, um ihre Auswirkungen auf die makroskopischen Massen Strukturen zu untersuchen. Diese Einschränkung wurde behoben, durch den Einsatz von strukturell programmierbarer DNA-Nanoröhren, ermöglicht kontrollierte Veränderung der Filament-Steifigkeit. Sie entstehen durch Kachel-basierte Designs, wo eine diskrete Menge von teilweise komplementäre Stränge in eine Ringstruktur mit einem diskreten Umfang hybridisieren. Diese Ringe sind mit klebrige enden, ermöglichen der effektive Polymerisation in Filamente mehreren Mikrometern in der Länge, und ähnliche Polymerisation Kinetik als natürliche Biopolymere anzuzeigen. Diese Rohre sind aufgrund ihrer programmierbaren Mechanik vielseitig, neuartige Instrumente zur Untersuchung der Auswirkungen von lp auf der Einzelmolekül-sowie der Bulk-Skala. Im Gegensatz zu Actinfilamente sie über Wochen ohne nennenswerte Degeneration, stabil bleiben und ihre Handhabung ist vergleichsweise einfach.
Introduction
Aufgrund der komplexen Verhaltensweisen ermöglicht durch ihre einzigartigen mechanischen Eigenschaften sind semiflexiblen Polymere Grundbausteine der lebenden Materie. Im Gegensatz zu flexiblen Polymeren verabschieden semiflexiblen Polymere eine ausgestreckte Konfiguration aufgrund ihrer nicht-verschwindende Rückgrat Steifigkeit zwar noch immer unter starken thermischen Schwankungen1. Somit können nicht rein stochastische Modelle auf ihr Verhalten, wie bei den extremen voll flexible oder starre Polymere angewendet werden. Das so genannte Endlosschraube-wie Kette Modell2,3,4 wurde entwickelt, um diese Steifheit über die lp, zu quantifizieren, ist die konstante Zerfall der Tangente Tangente Korrelation entlang der Filament-4. Wenn lp die Kontur Länge (lc) des Fadens vergleichbar ist, wird das Polymer semiflexiblen1betrachtet. Analog zu den Polen eines Zeltes, ihre Arrangements in Netzwerken oder Bündel stabilisiert das gesamte kollektive System bei geringer Lautstärke Brüche, führt zu ungewöhnlichen viskoelastischen Eigenschaften5,6,7, 8,9. Diese Strukturen bieten hohe Elastizitäten in großen Größen10, mechanische Integrität während noch diffusive zu erleichtern und aktiven Transportprozesse ineinander greifen. Diese Eigenschaft eignet sich besonders für biologische Systeme wie das Zytoskelett oder die extrazelluläre Matrix, aber es ist auch weit verbreitet in Essen engineering1,11,12.
Ihre Bedeutung für lebende Materie hinausgehen, ist es entscheidend, die physikalischen Eigenschaften dieser Strukturen umfassend zu untersuchen, um die Werkzeuge, um biomimetischer Materialien oder neuartige Hydrogele zu entwickeln. In Bezug auf die semiflexiblen Polymere bedeutet dies die systematische Ermittlung der kollektive Eigenschaften von Netzwerken aus Single-Filament Eigenschaften wie l–p und die Entwicklung eines beschreibenden theoretischen Rahmens. In bahnbrechenden Studien der zellulären Biopolymer-Aktin entstand als Modellsystem für semiflexiblen Polymere und ist immer noch weithin als der Goldstandard5,13,14,15 , 16 , 17. gründlichen Studien sind jedoch mit diesem System beschränkt, da sie die inhärenten Eigenschaften dieses Proteins gebunden sind. Verschiedene theoretische Ansätze zielten auf eine Baubeschreibung der nicht-triviale mechanischen Verhaltensweisen auf der Single-Filament-Ebene und führten zu insbesondere unterschiedliche Skalierung Prognosen für die Abhängigkeit von der linearen elastischen Plateau Schubmodul, G 0 (d. h. die “Elastizität” des Netzes), in Bezug auf die Konzentration (c) und lp6,7,13,14, 15,18,19,20,21,22,23. Während die Konzentration Skalierung leicht zugänglich in Experimenten mit Actin-basierte oder andere Modellsysteme ist und theoretische Vorhersagen rigoros wurden überprüft13,16,24, 25, die Skalierung in Bezug auf lp experimentell unzugänglich geblieben. Dies ist jedoch eine wichtige Einschränkung, da lp auch eine unabhängige Variable ist, die definierende Menge semiflexiblen Polymere.
Diese zentrale, natürliche Limitierung durch die festen lp von Aktin oder andere biologisch abgeleitet Polymere wie Kollagen wurde vor kurzem behoben, durch den Einsatz von Kachel-basierte DNA-Röhren, die einstellbaren in ihren mechanischen Eigenschaften sind 9 , 26 , 27 , 28. geringfügige Abweichungen in den Architekturen der Rohre (z. B. unterschiedliche Anzahl von einzelnen DNA-Stränge innerhalb der Einheit Ring) ergeben unterschiedliche Werte für lp, welches per Fluoreszenz-Mikroskopie ausgewertet werden kann, durch die Analyse einer schwankender Röhre oder durch die Auswertung der gebogenen Konfigurationen von mehreren Rohren eingehalten als zuvor beschriebenen9,28. Diese Analysen ergaben, dass l–p -Werte der verschiedenen Rohr Bevölkerungen über mehr als eine Größenordnung variieren und unterschiedliche Bewertungstechniken konsistente Ergebnisse9,28ergeben.
Überraschenderweise wurde die allgemeine Skalierung des linear elastischen Plateau Shear Modulus G0 in Bezug auf die Konzentration und lp berichtet, dass mit allen bisherigen Theorieansätze inkonsistent 9, insbesondere zeigen eine viel stärker als vorhergesagt Abhängigkeit von lp. Diese Ergebnisse unterstreichen den Wert eines neuen Modell-Systems, die zentralen Eigenschaften von semiflexiblen Polymeren zu studieren. Einsatz von n-Helix DNA Röhren drastisch erweitert den Anwendungsbereich dieser Untersuchungen. Nicht nur lp frei variiert werden ohne das Grundmaterial zu ändern, sondern die inhärente programmierbare Natur der DNA kann die systematische Untersuchung von Zusatzelementen, wie Querverbindungen oder kinetische Schaltvorgänge ermöglichen. Darüber hinaus diese Rohre sind in Wasser löslich und im Gegensatz zu den meisten Proteine stabil in angemessenen pH-Wert und ionischen Bedingungen für mehrere Wochen, ohne erkennbare Verschlechterung9.
Diese Rohre montieren eine diskrete Menge von DNA-Oligonukleotide verwendet wird, von denen jede enthält zwei Domänen, die komplementäre Basensequenzen zu zwei benachbarten Stränge Teilen (aufgrund der spezifischen Reihenfolgen kann kein einzigen Strang Strukturen wie Haarnadeln bilden). Die komplementäre Sequenzen hybridisieren zyklisch, geschlossene, halb-überlappende Ringe der doppelt-schraubenartigen Segmente n miteinander verbunden bilden (Abbildung 1A und B). Diese Ringe bilden bei einem diskreten Durchmesser (Abbildung 1) und deren Hälfte-überlappende Konfiguration stellt axiale klebrige enden, die komplementär zu den klebrigen Enden von einem anderen Ring. Diese selektive Ergänzung passender Oligonukleotide löst eine Stapelung der Ringe, führt zu der effektiven Polymerisation filamentöse DNA Helix Schläuche der Größe n (nHT). Ihre Konturen Längen messen in der Regel einige Mikrometer in der Länge, und ihre Längenverteilung ist vergleichbar mit der von Aktin Filamente9,26,27,28. Es wurde für ähnliche DNA Nanoröhrchen gezeigt, dass sie in der Tat Polymerisation Kinetik ähnlich denen von Aktin-Filamenten und Mikrotubuli aufweisenp Class = “Xref” > 29. Abhängig von der Anzahl n der einzelnen DNA-Stränge, aus denen die grundlegenden Ringstruktur ist die nHT-Architektur sowie seinen Umfang und Durchmesser, kontrollierbar variierbar. Weitere DNA-Stränge, erhöht den Umfang der Ringe/Rohre, und die entsprechende Änderung des architektonischen verschiebt sich die mechanischen Eigenschaften zu höheren l–p -Werte (Abbildung 1), entsprechend eine höhere Steifigkeit. Auf der mesoskopischen Skala, übersetzen diese größeren l–p -Werte weniger gebogen Konformationen aufgrund der höheren Steifigkeit (Abbildung 1 und E).
Protocol
Representative Results
Discussion
Um richtig geformte Netze zu erhalten, ist die Montage der DNA-Nanoröhren ein entscheidender Schritt. Fehler während der Syntheseprozess beeinträchtigen die Rohrqualität; Daher wird es empfohlen, HPLC oder ein strenger Prozess verwendet werden, um die Oligonukleotide zu reinigen. Da die Bildung von diskreten anstatt aggregierten DNA-Nanoröhren sowie ihre Längenverteilung der äquimolaren Stöchiometrie der n konstituierende Oligonukleotide innerhalb des Satzes abhängt, ist es notwendig, die Konzentratione…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir anerkennen die Finanzierung durch die DFG (1116/17-1) und der Leipzig School of Natural Sciences “BuildMoNa” (GSC-185). Diese Arbeit wurde durch das Fraunhofer-Attract-Projekt 601 683 unterstützt. T. H. nimmt zur Kenntnis, Mittel aus dem Europäischen Sozialfonds (ESF-100077106).
Materials
| AFM cantilever ACTA | AppNano | ||
| AFM – NanoWizard 3 | JPK Instruments | ||
| CCD camera | Andor | iXon DV887 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DNA oligonucleotides | Biomers.net | For sequences see Table 1 | |
| DNA Cy3-labeled oligonucleotides | Biomers.net | For sequence see Table 1 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E-9884 | |
| Epi-fluorescence micro-scope | Leica | DM-IRB | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M-8266 | |
| Mica "V1", 12 mm round | Plano GmbH | 50-12 | |
| MicroAmp® Fast Optical 96-Well Reaction Plate | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4346907 | |
| MicroAmp® Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4306311 | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| 100x objective | Leica5 | 506168 | |
| Purified water | Merk Millipore – Milli-Q & Elix | ||
| Sapphire PCR tubes | Greiner Bio-One | 683271 | |
| TProfessional Standard PCR Thermocycler | Core Life Sciences Inc. | 070- Standard | |
| 7900HT Fast Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4351405 | |
| Rheometer | TA Instruments | ARES | |
| SYBR® Green I nucleic acid gel stain | Thermo Fisher Scientific Inc. | S7567 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T4661 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich Co. | X-100 | Suppresses evaporation of sample at air-water interface |
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