JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengenharia

DNA 纳米管作为研究半聚合物的万能工具

Published: October 25, 2017
doi:
10.3791/56056
, , , , , , , ,
1Fraunhofer Institute for Cell Therapy and Immunology, 2Institute of Experimental Physics I,Universität Leipzig

Summary

半聚合物显示独特的机械性能, 广泛应用于生活系统。然而, 由于聚合物刚性等性质无法进入, 对生物聚合物的系统研究是有限的。这篇手稿描述了如何利用可编程的 DNA 纳米管规避这一限制, 从而对纤维刚性的影响进行实验研究。

Abstract

复杂的, 聚合物的软物质的机械性能, 如细胞或生物网络, 可以理解在既不经典框架的柔性聚合物也不是刚性棒。由于其非的主干刚度 (通过持久长度 (lp) 进行量化), 底层细丝仍会伸展, 但它们也会受到强烈的热波动的影响。它们的有限弯曲刚度导致了独特的、非平凡的体积网络集体力学, 使得在低体积分数下形成稳定的支架, 同时提供大的网格尺寸。这一基本原理在自然界中很普遍 (例如,在细胞或组织中的), 使高分子含量最小化, 从而促进扩散或主动运输。由于其生物学意义和潜在的技术应用在生物相容的水凝胶, 半聚合物已受到相当多的研究。然而, 可理解的调查仍然具有挑战性, 因为他们依赖天然的聚合物, 如肌动蛋白丝, 这是不能自由调谐。尽管有这些限制, 由于缺乏合成, 机械可调谐, 和半聚合物, 肌动蛋白花丝被建立作为共同的模型系统。一个主要的限制是, 不能自由调整中心数量lp来研究其对宏观体积结构的影响。通过采用结构化可编程的 DNA 纳米管, 实现了对灯丝刚度的控制改变, 从而解决了这一缺陷。它们是通过型的设计形成的, 在这里, 一组离散的部分互补的链杂交在一个具有离散圆周的环形结构中。这些环的特点是粘性的两端, 使有效的聚合成丝数微米的长度, 并显示类似的聚合动力学作为天然的生物聚合物。由于他们的可编程的力学, 这些管是多才多艺的, 新颖的工具, 研究的影响, lp对分子和散装规模。与肌动蛋白丝相比, 它们在几周内保持稳定, 没有明显的变性, 它们的处理也比较简单。

Introduction

由于其独特的力学性能使复杂的行为, 半聚合物是基本的生活物质的基石。与柔性聚合物相比, 半聚合物采用了一种伸展的结构, 由于其非的骨架刚度, 同时仍受强热波动的影响1。因此, 纯粹的随机模型不能应用于他们的行为, 就像极端的完全灵活或刚性的聚合物。so-called 蠕虫样链模型2,3,4被开发为通过lp来量化此刚度, 它是沿灯丝4的切线相关的衰减常数。如果lp与灯丝的轮廓长度 (lc) 相媲美, 则该聚合物被视为半1。类似于帐篷的两极, 他们在网络或捆绑的安排稳定整个集体系统在低体积分数, 导致异常粘弹性属性5,6,7, 8,9。这些结构在大型网格大小10中提供了高弹性, 保持了机械完整性, 同时还促进了扩散和活动的传输过程。该特性特别适用于生物系统, 如骨架或胞外基质, 但它也广泛应用于食品工程1,11,12。

为了能有发展仿生材料或新型水凝胶的工具, 对这些结构的物理性质进行全面的检验, 对其意义深远。在半聚合物方面, 这意味着系统地确定由 single-filament 属性 (如lp和描述性理论框架的开发) 产生的网络的集体属性。在开创性研究中, 细胞生物肌动蛋白被建立为半聚合物的模型系统, 并仍被广泛认为是金标准5,13,14,15,16,17. 然而, 这一系统的详尽研究是有限的, 因为它们与这种蛋白质的固有特性息息相关。各种理论方法的目的是建立一个描述的非平凡的机械行为在 single-filament 水平, 并导致明显不同的比例预测的依赖线性弹性高原剪切模量, G 0 (即网络的 “弹性”), 就集中度 (c) 和lp6,7,13,14, 15,18,19,20,21,22,23。虽然在 actin-based 或其他模型系统的实验中可以方便地进行浓度缩放, 而理论预测已得到严格验证13,16,24,25, 相对于lp的缩放在实验上仍然不可访问。但是, 这是一个主要的限制, 因为lp也是一个独立变量, 它是半聚合物的定义数量。

这种中央, 自然的限制强加由固定的lp的肌动蛋白或其他生物衍生聚合物, 如胶原蛋白, 最近已经解决了使用型 DNA 管, 这是可调谐的机械性能9,26,27,28. 管结构的细微变化 (例如,在单位环内的不同数量的组成 DNA 链) 产生独特的值为lp, 可以通过荧光显微镜进行评估,通过分析一个波动管或评估几个粘附管的弯曲配置, 如前面所描述的9,28。这些分析显示, 不同管种群的lp值在多个数量级上变化, 并且不同的评估技术产生一致的结果9,28。

令人惊讶的是, 线性弹性高原切变模量的整体比例G0关于浓度和lp已报告与所有以前的理论方法不一致9, 特别是在lp上演示了比预测依赖强得多的依赖性。这些发现强调了一个新的模型系统的价值, 研究半聚合物的中心性质。使用n-螺旋 DNA 管极大地拓宽了这些调查的范围。lp不仅可以在不改变基本材料的情况下自由变化, 而且 DNA 的固有可编程性可以使系统地检查其他元素, 如通道或动态切换过程。此外, 这些管子可溶于水, 与大多数蛋白质相比, 在适当的 pH 值和离子条件下稳定数周, 没有可检测的降解9。

为了组装这些管子, 我们使用了一组离散的 DNA 寡核苷酸, 每个都包含两个域, 共享互补的碱基序列到两个相邻的链 (由于特定的序列, 单链不能形成结构, 如发夹)。互补序列杂交的循环方式, 形成封闭的, half-overlapping 环的n互联的双段 (图 1A和 B)。这些环形成在一个离散的直径 (图 1C), 其 half-overlapping 配置暴露了轴向粘性两端互补的另一环的粘性两端。这种选择性添加匹配的寡核苷酸触发了环的堆叠, 导致有效聚合的丝状 DNA 螺旋管的大小n (nHT)。他们的外形长度通常测量几微米长度, 并且他们的长度分布是可比较的肌动蛋白花丝9,26,27,28。它已经证明了类似的 DNA 纳米管, 他们确实展示聚合动力学类似的肌动蛋白丝和微管内p 类 = “xref” > 29。根据组成基本环结构的单个 DNA 链的数字n , nHT 体系结构以及其周长和直径可控变化。使用更多的 DNA 链增加环/管的周长, 相应的结构变化将机械性能转移到更高的lp值 (图 1C), 对应于更高的刚性。在介观尺度上, 这些较大的lp值转换为更高的刚度 (图 1D和E) 的弯曲构象。

Protocol

1. 准备 n 高温超导 注: 在这里, n 表示在某一大小的螺旋管的形成中所涉及的不同单 DNA 链的数量。对于 n = 8, 八不同的单个 DNA 链组成一个单位环. 从合适的 dna 合成服务中购买 dna 序列 (HPLC 纯度级或更高), 或执行高质量的合成和纯化 (在 表 1 中给出的模范序列). 在纯化水中重冻干寡核苷酸, 并按照该公司相应手册中的…

Representative Results

通过温度斜坡 (图 2) 进行 DNA 纳米管的组装是形成这些人造半聚合物的一种非常可靠的方法。这些聚合物与自然发生的对应物有相似的特征, 例如肌动蛋白丝, 但提供一个更加宽广的实验框架, 因为他们的机械物产可以被控改变9,27.与生物聚合物一样, 它们可以在网络中进行排列 (图 3), ?…

Discussion

要获得适当形成的网络, 组装 DNA 纳米管是一个关键的步骤。合成过程中的误差对管质量产生负面影响;因此, 建议采用 HPLC 法或更严格的工艺来纯化寡核苷酸。由于离散而非聚合的 DNA 纳米管的形成, 以及它们的长度分布, 取决于集合中的n组成的寡核苷酸的摩尔化学计量, 因此必须测量浓度被购买的子线, 因为被给的价值可能从实际集中极大地变化。例如, 可以通过紫外可见光谱在 260 nm 的吸收…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

我们承认 DFG (1116/17-1) 和莱比锡自然科学学校 “BuildMoNa” (GSC 185) 的资助。这项工作得到了通过弗劳恩霍夫吸引项目 601 683。骅承认欧洲社会基金 (ESF-100077106) 提供的资金。

Materials

AFM cantilever ACTA AppNano
AFM – NanoWizard 3 JPK Instruments
CCD camera Andor iXon DV887
DMSO Sigma-Aldrich D2650
DNA oligonucleotides Biomers.net For sequences see Table 1
DNA Cy3-labeled oligonucleotides Biomers.net For sequence see Table 1
EDTA Sigma-Aldrich E-9884
Epi-fluorescence micro-scope Leica DM-IRB
MgCl2 Sigma-Aldrich M-8266
Mica "V1", 12 mm round Plano GmbH 50-12
MicroAmp® Fast Optical 96-Well Reaction Plate Thermo Fisher Scientific Inc. 4346907
MicroAmp® Optical Adhesive Film Thermo Fisher Scientific Inc. 4306311
NanoDrop 1000 Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific Inc.
100x objective Leica5 506168
Purified water Merk Millipore – Milli-Q & Elix
Sapphire PCR tubes Greiner Bio-One 683271
TProfessional Standard PCR Thermocycler Core Life Sciences Inc. 070- Standard
7900HT Fast Real-Time PCR System Applied Biosystems 4351405
Rheometer TA Instruments ARES
SYBR® Green I nucleic acid gel stain Thermo Fisher Scientific Inc. S7567
Tris Sigma-Aldrich T4661
Triton X-100 Sigma-Aldrich Co. X-100 Suppresses evaporation of sample at air-water interface
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Huber, F., et al. Emergent complexity of the cytoskeleton: from single filaments to tissue. Adv Phys. 62 (1), 1-112 (2013).
  2. Kratky, O., Porod, G. Röntgenuntersuchung gelöster Fadenmoleküle. Recl Trav Chim Pays-Bas. 68 (12), 1106-1122 (1949).
  3. Saitô, N., Takahashi, K., Yunoki, Y. The Statistical Mechanical Theory of Stiff Chains. J Phys Soc Jpn. 22 (1), 219-226 (1967).
  4. Doi, M., Edwards, S. F. . The Theory of Polymer Dynamics. , (1986).
  5. Mueller, O., Gaub, H. E., Baermann, M., Sackmann, E. Viscoelastic moduli of sterically and chemically cross-linked actin networks in the dilute to semidilute regime: measurements by oscillating disk rheometer. Macromolecules. 24 (11), 3111-3120 (1991).
  6. MacKintosh, F. C., Käs, J., Janmey, P. A. Elasticity of semiflexible biopolymer networks. Phys Rev Lett. 75 (24), 4425-4428 (1995).
  7. Gardel, M. L. Elastic Behavior of Cross-Linked and Bundled Actin Networks. Science. 304 (5675), 1301-1305 (2004).
  8. Sonn-Segev, A., Bernheim-Groswasser, A., Diamant, H., Roichman, Y. Viscoelastic Response of a Complex Fluid at Intermediate Distances. Phys Rev Lett. 112 (8), (2014).
  9. Schuldt, C., et al. Tuning Synthetic Semiflexible Networks by Bending Stiffness. Phys Rev Lett. 117 (19), (2016).
  10. Käs, J., et al. F-actin, a model polymer for semiflexible chains in dilute, semidilute, and liquid crystalline solutions. Biophys J. 70 (2), 609-625 (1996).
  11. Ross-Murphy, S. B. Structure-property relationships in food biopolymer gels and solutions. J Rheol. 39 (6), 1451-1463 (1995).
  12. Fletcher, D. A., Mullins, R. D. Cell mechanics and the cytoskeleton. Nature. 463 (7280), 485-492 (2010).
  13. Hinner, B., Tempel, M., Sackmann, E., Kroy, K., Frey, E. Entanglement, Elasticity, and Viscous Relaxation of Actin Solutions. Phys Rev Lett. 81 (12), 2614-2617 (1998).
  14. Palmer, A., Mason, T. G., Xu, J., Kuo, S. C., Wirtz, D. Diffusing Wave Spectroscopy Microrheology of Actin Filament Networks. Biophys J. 76 (2), 1063-1071 (1999).
  15. Gardel, M. L., Valentine, M. T., Crocker, J. C., Bausch, A. R., Weitz, D. A. Microrheology of Entangled F-Actin Solutions. Phys Rev Lett. 91 (15), (2003).
  16. Liu, J., et al. Microrheology Probes Length Scale Dependent Rheology. Phys Rev Lett. 96 (11), (2006).
  17. Golde, T., Schuldt, C., Schnauß, J., Strehle, D., Glaser, M., Käs, J. Fluorescent beads disintegrate actin networks. Phys Rev E. 88 (4), (2013).
  18. Isambert, H., Maggs, A. C. Dynamics and Rheology of Actin Solutions. Macromolecules. 29 (3), 1036-1040 (1996).
  19. Käs, J., Strey, H., Sackmann, E. Direct imaging of reptation for semiflexible actin filaments. Nature. 368 (6468), 226-229 (1994).
  20. Schmidt, C. F., Baermann, M., Isenberg, G., Sackmann, E. Chain dynamics, mesh size, and diffusive transport in networks of polymerized actin: a quasielastic light scattering and microfluorescence study. Macromolecules. 22 (9), 3638-3649 (1989).
  21. Kroy, K., Frey, E. Force-Extension Relation and Plateau Modulus for Wormlike Chains. Phys Rev Lett. 77 (2), 306-309 (1996).
  22. Morse, D. C. Tube diameter in tightly entangled solutions of semiflexible polymers. Phys Rev E. 63 (3), (2001).
  23. Broedersz, C. P., MacKintosh, F. C. Modeling semiflexible polymer networks. Rev Mod Phys. 86 (3), 995-1036 (2014).
  24. Tassieri, M., Evans, R. M. L., Barbu-Tudoran, L., Khaname, G. N., Trinick, J., Waigh, T. A. Dynamics of Semiflexible Polymer Solutions in the Highly Entangled Regime. Phys Rev Lett. 101 (19), (2008).
  25. Non-Affine Shear Modulus in Entangled Networks of Semiflexible Polymers. arXiv:0907.1875[cond-mat] Available from: https://arxiv.org/abs/0907.1875 (2009)
  26. Yin, P., et al. Programming DNA Tube Circumferences. Science. 321 (5890), 824-826 (2008).
  27. Glaser, M., et al. Self-assembly of hierarchically ordered structures in DNA nanotube systems. New J Phys. 18 (5), 055001 (2016).
  28. Schiffels, D., Liedl, T., Fygenson, D. K. Nanoscale Structure and Microscale Stiffness of DNA Nanotubes. ACS Nano. 7 (8), 6700-6710 (2013).
  29. Hariadi, R. F., Yurke, B., Winfree, E. Thermodynamics and kinetics of DNA nanotube polymerization from single-filament measurements. Chem Sci. 6 (4), 2252-2267 (2015).
  30. de Gennes, P. G. Reptation of a Polymer Chain in the Presence of Fixed Obstacles. J Chem Phys. 55 (2), 572-579 (1971).
  31. Huss, V. A. R., Festl, H., Schleifer, K. H. Studies on the spectrophotometric determination of DNA hybridization from renaturation rates. Syst Appl Microbio. 4 (2), 184-192 (1983).
  32. Breslauer, K. J., Frank, R., Blöcker, H., Marky, L. A. Predicting DNA duplex stability from the base sequence. Proc Natl Acad Sci U S A. 83 (11), 3746-3750 (1986).
  33. You, Y., Tataurov, A. V., Owczarzy, R. Measuring thermodynamic details of DNA hybridization using fluorescence. Biopolymers. 95 (7), 472-486 (2011).
  34. Zipper, H. Investigations on DNA intercalation and surface binding by SYBR Green I, its structure determination and methodological implications. Nucleic Acids Res. 32 (12), e103-e103 (2004).
  35. Sobczak, J. -. P. J., Martin, T. G., Gerling, T., Dietz, H. Rapid Folding of DNA into Nanoscale Shapes at Constant Temperature. Science. 338 (6113), 1458-1461 (2012).
  36. Snodin, B. E. K., Romano, F., Rovigatti, L., Ouldridge, T. E., Louis, A. A., Doye, J. P. K. Direct Simulation of the Self-Assembly of a Small DNA Origami. ACS Nano. 10 (2), 1724-1737 (2016).
  37. Das, R. K., Gocheva, V., Hammink, R., Zouani, O. F., Rowan, A. E. Stress-stiffening-mediated stem-cell commitment switch in soft responsive hydrogels. Nat Mater. 15 (3), 318-325 (2015).
  38. Sharma, A., et al. Strain-controlled criticality governs the nonlinear mechanics of fibre networks. Nat Phys. 12 (6), 584-587 (2016).
  39. Lieleg, O., Claessens, M. M. A. E., Bausch, A. R. Structure and dynamics of cross-linked actin networks. Soft Matter. 6 (2), 218-225 (2010).
  40. Claessens, M. M. A. E., Semmrich, C., Ramos, L., Bausch, A. R. Helical twist controls the thickness of F-actin bundles. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (26), 8819-8822 (2008).
  41. Claessens, M. M. A. E., Bathe, M., Frey, E., Bausch, A. R. Actin-binding proteins sensitively mediate F-actin bundle stiffness. Nat Mater. 5 (9), 748-753 (2006).
  42. Schnauß, J., Händler, T., Käs, J. Semiflexible Biopolymers in Bundled Arrangements. Polymers. 8 (8), 274 (2016).
  43. Heussinger, C., Schüller, F., Frey, E. Statics and dynamics of the wormlike bundle model. Phys Rev E. 81 (2), (2010).
  44. Schnauß, J., et al. Transition from a Linear to a Harmonic Potential in Collective Dynamics of a Multifilament Actin Bundle. Phys Rev Lett. 116 (10), (2016).
  45. Strehle, D., et al. Transiently crosslinked F-actin bundles. Eur Biophys J. 40 (1), 93-101 (2011).
  46. Backouche, F., Haviv, L., Groswasser, D., Bernheim-Groswasser, A. Active gels: dynamics of patterning and self-organization. Phys Biol. 3 (4), 264-273 (2006).
  47. Surrey, T. Physical Properties Determining Self-Organization of Motors and Microtubules. Science. 292 (5519), 1167-1171 (2001).
  48. Nedelec, F. J., Surrey, T., Maggs, A. C., Leibler, S. Self-organization of microtubules and motors. Nature. 389 (6648), 305-308 (1997).
  49. Smith, D., et al. Molecular Motor-Induced Instabilities and Cross Linkers Determine Biopolymer Organization. Biophys J. 93 (12), 4445-4452 (2007).
  50. Huber, F., Strehle, D., Schnauß, J., Käs, J. Formation of regularly spaced networks as a general feature of actin bundle condensation by entropic forces. New J Phys. 17 (4), 043029 (2015).

Tags

Keywords: DNA NanotubesSemiflexible PolymersSoft MatterBiopolymersFilamentsNetworksHydrogelsCell MigrationStiffnessRheologyDNA HybridizationDNA StrandsThermocyclerSample PreparationDynamic Shear RheometerSample LoadingEvaporation Prevention
check_url/pt/56056?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Schnauß, J., Glaser, M., Lorenz, J. S., Schuldt, C., Möser, C., Sajfutdinow, M., Händler, T., Käs, J. A., Smith, D. M. DNA Nanotubes as a Versatile Tool to Study Semiflexible Polymers. J. Vis. Exp. (128), e56056, doi:10.3791/56056 (2017).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image