Nanotubes d’ADN comme un outil polyvalent pour l’étude des polymères semi-flexibles
Summary
Polymères semi-flexibles affichent des propriétés mécaniques uniques qui sont largement appliquées par les systèmes vivants. Toutefois, des études systématiques sur les biopolymères sont limitées puisque les propriétés telles que la rigidité de polymère sont inaccessibles. Ce manuscrit décrit comment cette limitation est contournée par programmable ADN nanotubes, permettant des études expérimentales sur l’impact de la rigidité du filament.
Abstract
Les propriétés mécaniques de la matière molle complexe, à base de polymères, tels que les cellules ou les réseaux de biopolymère, peuvent être comprises dans ni le cadre classique des polymères flexibles, ni de tiges rigides. Filaments sous-jacente restent tendus en raison de leur rigidité de la colonne vertébrale non-en voie de disparition, qui est quantifiée par la longueur de persistance (l,p), mais ils sont également soumis à fortes fluctuations thermiques. Leur rigidité en flexion finie mène à mécanique collective unique, non trivial de réseaux en vrac, ce qui permet la formation d’échafaudages stables à des fractions de faible volume, tout en offrant des tailles de mailles larges. Ce principe est répandu dans la nature (p. ex., dans les cellules ou les tissus), pour réduire le contenu moléculaire élevé et ce qui facilite diffusive ou transport actif. En raison de leurs implications biologiques et des applications technologiques potentielles dans les hydrogels biocompatibles, semi-flexibles polymères ont fait l’objet de nombreuses études. Cependant, enquêtes compréhensibles est resté difficiles puisqu’ils s’appuyaient sur des polymères naturels, tels que les filaments d’actine, qui ne sont pas librement réglables. Malgré ces limites et en raison du manque de polymères synthétiques et mécaniquement accordables semi-flexibles, filaments d’actine ont été établis sous le régime de modèle commun. Une limitation majeure est que la quantité central lp ne peut pas être librement à l’écoute afin d’étudier son impact sur les structures macroscopiques en vrac. Cette limitation a été résolue en employant des nanotubes ADN structurellement programmables, permettant la modification contrôlée de la raideur du filament. Elles sont constituées par des conceptions basées sur les carreaux, où un ensemble discret de brins partiellement complémentaires s’hybrident dans une structure d’anneau avec une circonférence de discrète. Ces anneaux disposent les extrémités cohésives, permettant la polymérisation efficace en filaments de quelques microns de longueur et affiche similaires cinétique de polymérisation sous forme de biopolymères naturels. En raison de leur mécanique programmable, ces tubes sont polyvalents, de nouveaux outils pour étudier l’impact de lp sur la molécule unique ainsi que l’échelle en vrac. Contrairement aux filaments d’actine, ils restent stables au cours des semaines, sans dégénérescence notable, et leur manipulation est relativement simple.
Introduction
En raison des comportements complexes activés par leurs propriétés mécaniques uniques, polymères semi-flexibles sont les blocs constitutifs de la matière vivante. À la différence des polymères flexibles, semi-flexibles polymères adoptent une configuration tendue en raison de leur rigidité d’épine dorsale non-en voie de disparition, tout en restant soumis à fortes fluctuations thermiques1. Ainsi, des modèles stochastiques purement impossible d’appliquer à leurs comportements, comme avec les extrêmes de polymères entièrement flexibles ou rigides. Le modèle de ce que l’on appelle ver-comme chaîne2,3,4 a été développé afin de quantifier cette rigidité via la lp, qui est la constante de désintégration de la corrélation de tangente tangente le long du filament4. Si lp est comparable à la longueur du contour (lc) du filament, le polymère est considérée comme semi-flexibles1. Analogue aux pôles d’une tente, leurs arrangements en réseaux ou bottes stabilise l’ensemble du système collectif à des fractions de faible volume, conduisant à une inhabituelle viscoélastique propriétés5,6,7, 8,9. Ces structures fournissent au grand haute élasticité mesh tailles10, maintien de l’intégrité mécanique tout en facilitant la diffusion et les processus de transport actif. Cette propriété est particulièrement adaptée aux systèmes biologiques comme le cytosquelette ou de la matrice extracellulaire, mais il est également employé couramment en nourriture génie1,11,12.
Au-delà de leur signification avec la matière vivante, il est crucial d’examiner globalement les propriétés physiques de ces structures afin d’avoir les outils pour développer des matériaux biomimétiques ou roman hydrogels. En ce qui concerne les polymères semi-flexibles, ceci implique la détermination systématique des propriétés collectives des réseaux résultant des propriétés de single-filament comme lp et l’élaboration d’un cadre théorique descriptive. Pionnier dans l’étude, l’actine cellulaire biopolymère a été établi comme un système modèle pour polymères semi-flexibles et est toujours considéré comme l’étalon-or5,13,14,15 , 16 , 17. Cependant, les études exhaustives sont limités avec ce système car ils sont liés aux propriétés intrinsèques de cette protéine. Différentes approches théoriques ont visant à donner une description des comportements mécaniques non négligeables au niveau de single-filament et ont entraîné notamment mise à l’échelle des prévisions différentes pour la dépendance de la module de cisaillement de plateau élastique linéaire, G 0 (c’est-à-dire, le « élasticité » du réseau), en ce qui concerne la concentration (c) et lp6,7,13,14, 15,18,19,20,21,22,23. Alors que l’échelle de concentration est facilement accessible dans les expériences avec axée sur l’actine ou autres systèmes modèles et que les prédictions théoriques ont été rigoureusement vérifiés13,16,24, 25, la mise à l’échelle en ce qui concerne lp est resté expérimentalement inaccessible. Ceci, cependant, est une limitation majeure puisque lp est également une variable indépendante qui est la quantité déterminante de polymères semi-flexibles.
Cette limitation centrale, naturelle, imposée par le fixe lp de l’actine ou autres polymères d’origine biologique comme le collagène a récemment été résolue en employant basé sur l’ADN tubes qui sont accordables dans leurs propriétés mécaniques 9 , 26 , 27 , 28. légères variations dans les architectures des tubes (par exemple, un nombre différent de l’ADN constituant chapelets dans l’anneau d’unité) donnent des valeurs distinctes pour lp, qui peut être évaluée par l’intermédiaire de la microscopie de fluorescence, en analysant un tube fluctuant ou en évaluant les configurations de courbes de plusieurs tubes collés, comme décrit précédemment9,28. Ces analyses ont révélé que lp valeurs des populations différentes tube varient au cours de plus d’un ordre de grandeur, et que les techniques d’évaluation différentes donnent des résultats cohérents9,28.
Étonnamment, la mise à l’échelle globale du cisaillement module Gplateau élastiques linéaire0 en ce qui concerne la concentration et lp a été signalée est incompatible avec toutes les précédentes approches théoriques 9, montrant en particulier une bien plus forte que prévue tributaire de lp. Ces résultats mettent l’accent sur la valeur d’un nouveau système modèle pour étudier les propriétés centrales de polymères semi-flexibles. Employant des n-tubes à hélices ADN élargit considérablement la portée de ces enquêtes. Non seulement lp librement réglable sans changer le matériel de base, mais la nature inhérente programmable d’ADN peut permettre l’examen systématique des éléments supplémentaires, tels que les croisements ou processus de commutation cinétiques. En outre, ces tubes sont solubles dans l’eau et, contrairement à la plupart des protéines, stable au pH adéquat et des conditions ioniques pendant plusieurs semaines, sans dégradation détectable9.
Pour assembler ces tubes, sert un ensemble discret d’oligonucléotides d’ADN, dont chacune contient deux domaines qui partagent des séquences de base complémentaires à deux brins voisins (due à des séquences spécifiques, un seul brin ne peuvent pas constituer des structures telles que les épingles à cheveux). Les séquences complémentaires s’hybrident de façon cyclique, formant des anneaux fermés, moitié-chevauchement de segments double hélice n interconnectés (Figure 1 a et B). Ces forment des anneaux à un diamètre discrète (Figure 1) et leur configuration se chevauchent moitié expose les extrémités cohésives axiales complémentaires aux extrémités collantes d’une autre bague. Cet ajout sélectif des correspondants des oligonucléotides déclenche un empilement des anneaux, conduisant à la polymérisation efficace des tubes à hélices ADN filamenteux de taille n (nHT). Leurs longueurs contours mesurent généralement de quelques microns de longueur, et la distribution de leur longueur est comparable à celle des filaments d’actine9,26,27,28. Il a été démontré pour les nanotubes d’ADN similaires qu’ils présentent en effet cinétique de polymérisation semblable à celles des microtubules et des filaments d’actineclasse p = « xref » > 29. Selon le nombre n des brins d’ADN individuels qui composent la structure de l’anneau de base, l’architecture nHT, ainsi que sa circonférence et le diamètre, contrôlable réglable. À l’aide de brins d’ADN plus augmente la circonférence des anneaux/tubes, et le changement architectural correspondant déplace les propriétés mécaniques à des valeurs plus élevées dep l(Figure 1), correspondant à une rigidité supérieure. À l’échelle mésoscopique, ces valeurs plus élevées dep ltraduisent en conformations moins courbées en raison de la rigidité accrue (Figure 1 et E).
Protocol
Representative Results
Discussion
Pour obtenir des réseaux correctement formés, assembler les nanotubes d’ADN est une étape cruciale. Erreurs lors du processus de synthèse des effets négatifs sur la qualité du tube ; par conséquent, il est recommandé que HPLC ou un processus plus rigoureux servir à purifier les oligonucléotides. Étant donné que la formation de discrètes plutôt qu’agrégées nanotubes d’ADN, ainsi que leur répartition, leur longueur dépend de la stoechiométrie équimolaire des oligonucléotides constitutifs n</…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous reconnaissons le financement par la DFG (1116/17-1) et la Faculté des Sciences naturelles de Leipzig « BuildMoNa » (CGC 185). Ce travail a été soutenu par le projet de Fraunhofer Attract 601 683. T. H. reconnaît le financement par le Fonds Social européen (FSE-100077106).
Materials
| AFM cantilever ACTA | AppNano | ||
| AFM – NanoWizard 3 | JPK Instruments | ||
| CCD camera | Andor | iXon DV887 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DNA oligonucleotides | Biomers.net | For sequences see Table 1 | |
| DNA Cy3-labeled oligonucleotides | Biomers.net | For sequence see Table 1 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E-9884 | |
| Epi-fluorescence micro-scope | Leica | DM-IRB | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M-8266 | |
| Mica "V1", 12 mm round | Plano GmbH | 50-12 | |
| MicroAmp® Fast Optical 96-Well Reaction Plate | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4346907 | |
| MicroAmp® Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4306311 | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| 100x objective | Leica5 | 506168 | |
| Purified water | Merk Millipore – Milli-Q & Elix | ||
| Sapphire PCR tubes | Greiner Bio-One | 683271 | |
| TProfessional Standard PCR Thermocycler | Core Life Sciences Inc. | 070- Standard | |
| 7900HT Fast Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4351405 | |
| Rheometer | TA Instruments | ARES | |
| SYBR® Green I nucleic acid gel stain | Thermo Fisher Scientific Inc. | S7567 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T4661 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich Co. | X-100 | Suppresses evaporation of sample at air-water interface |
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