שימוש Densovirus יתוש רקומביננטי כמו וקטור משלוח ג'ין לניתוח פונקציונלי של גנים רימות היתוש
Summary
. מדווחים באמצעות מלאכותיים intronic קטן RNA ביטוי אסטרטגיית לפתח חלבון תקינה densovirus (AaeDV) Aedes aegypti ויוו מערכת המשלוח. הליך מפורט עבור בנייה, אריזה, ניתוח כמותי של וקטורים rAaeDV כמו גם כ נגוע זחל מתואר.
Abstract
Microinjection in vivo הוא הטכניקה העברת גנים הנפוצות ביותר לניתוח הפונקציות ג’ין יתושים בודדים. אולם, שיטה זו דורשת יותר טכנית בדרישה מבצע, כרוך פרוצדורות מסובכות, במיוחד כשמשתמשים בהם הזחלים שלהם גודל קטן, יחסית דק ושברירי לציפורן וכתוצאה תמותה גבוהה, אשר להגביל היישום שלה. לעומת זאת, וקטורים ויראלי למסירה גן פותחו כדי להתגבר על המחסומים חוץ-תאית, תאיים. המערכות הללו יש את היתרונות של טיפול קל, ג’ין גבוה התמרה חושית יעילות, תחזוקה לטווח הארוך של ביטוי גנים, את היכולת לייצר תופעות מתמשכות ויוו. יתוש densoviruses (MDVs) הם וירוסים דנ א חד גדילי ספציפי נגד יתושים, קטנים שיכולים לספק ביעילות חומצות גרעין זר לתוך תאים יתושים; עם זאת, החלפת או החדרת גנים זרים כדי ליצור וירוסים רקומביננטי בדרך כלל גורמת לאובדן יכולות אריזה ו/או שכפול, המהווה מחסום לפיתוח של וירוסים אלה כמו משלוח וקטורים.
במסמך זה, מדווחים באמצעות אסטרטגיית מלאכותי ביטוי קטן-RNA intronic לפתח חלבון תקינה densovirus (AaeDV) Aedes aegypti ויוו מערכת המשלוח. מתוארים הליכים מפורטים עבור בנייה, אריזה אנליזה כמותית של הווקטורים rAaeDV, זיהום זחל.
מחקר זה מדגים, בפעם הראשונה, את הכדאיות של פיתוח מפורמטת רקומביננטי MDV מיקרו RNA (miRNA) ביטוי מערכת, ובכך לספק כלי רב עוצמה לניתוח פונקציונלי של גנים יתושים ואת הקמת בסיס יישום של נגיפי paratransgenesis לפיקוח על מחלות בעקיצות יתוש. הפגנו כי אדס 1סנט לחלל הזחלים יכול להיות בקלות וביעילות נגוע על ידי החדרת הנגיף לגוף מים הזחלים רבייה אתר, כי rAaeDVs מפותחת יכול לשמש overexpress או להפיל ביטוי של גנים יעד ספציפיות של הזחלים, מתן כלי לניתוח פונקציונלי של יתוש גנים.
Introduction
בעקיצות יתוש מחלות כמו מלריה, קדחת דנגי, קדחת zika, קדחת צהובה, הן בעיות בריאות הציבור הבינלאומיים הגדולים ימשיך להביא בחשבון חלק משמעותי של מחלה זיהומית העולמי נטל1,2. חומרי הדברה קונבנציונאליים, אשר שימשו בתגובה וקטורים, הם מרכיב מרכזי של קיימא יתושים משולבת אסטרטגיה הבקרה למניעת מחלות בעקיצות יתוש. עם זאת, אסטרטגיות מעין אלו הוכיחו להיות יחסית לא יעילה או לא רצוי בשל את המשויך השפעות סביבתיות שליליות, כמו גם את האבולוציה של עמידות נגד יתושים אוכלוסיות3,4. מסיבות אלו, יש צורך דחוף שיטות אלטרנטיביות של יתוש שליטה, וכן השימוש בשיטות הטרנסגניים לייצר יתושים זכרים מעוקרים, שחרורו של יתושים פתוגן עמיד שהתעוררו כמו אסטרטגיות שליטה חדש מבטיח. לפתח אפקטיבי חדש לשלוט בשיטות, כגון גישות בטוח ויעיל עבור ויוו המסירה הגן, ניתוח מקיף של יתוש ג’ין פונקציה זו נדרשת.
Microinjection ישירה של פלסמיד ה-DNA, כפול תקועים RNA (dsRNA) או RNA קטנים מפריעות (siRNA) היא הנפוצה ביותר ויוו ג’ין משלוח השיטה יתושים. למעשה, ייצור הטרנסגניים זנים של יתושים עדיין מסתמכים על תהליך של העובר microinjection5,6,7. עם זאת, microinjection יש מספר מגבלות. ראשית, טכניקה זו הוא תובעני מבחינה טכנית, כרוך פרוצדורות מסובכות. שנית, הזרקת גורם של עלבון פיזית אל העובר, הזחלים, גלמים, מבוגר, אשר משפיע ישירות על הכדאיות של האורגניזם היעד. שלישית, קשה לשתק רימות היתוש עבור microinjection כי רוב לגור גידול מימיים והינם בעלי מאפיין נזחל התנועה. רביעית, בגודל של 1סנט-2nd לחלל הזחלים היא 10 – עד 20 פי קטן יותר מזה של 4th לחלל הזחלים בוגרים, ואת את ציפורנייך של לשעבר הם עדינים יותר. תכונות אלה מקשות לתמרן 1סנט-2nd לחלל הזחלים בהשוואה לאלו בשלבים בוגרים. משולב, גורמים אלה תורמים סיכויי הישרדות שלאחר הזרקת מופחת עבור הזחלים (כ- 5%) לעומת מבוגרים8. מערכות מבוססות ויראלי משלוח פותחו כדי להתגבר על המחסומים חוץ-תאית, תאיים הקשורים. המערכות הללו יש את היתרונות של טיפול קל, יעילות גבוהה התמרה חושית, לטווח ארוך וחזק רמות ביטוי ביכולתה לייצר תופעות מתמשכות ויוו. לכן, ג’ין מערכות אספקה ניצול רטרווירוסים, lentiviruses ו- adenoviruses היה נרחב בשימוש שורות תאים inmammalian ומינים מודל. מערכת ביטוי ויראלי Sindbis היה בשימוש בעבר כדי לנתח את פונקציית ג’ין היתוש למבוגרים; מלבד החשש אבטחה, הזרקת זאת, עדיין תהליך הכרחי עבור זיהום ויראלי9. אמנם, משלוח אוראלי למסמס את הזחלים בפתרון dsRNA דווחה בעבר שיטת משלוח ריאלי, זה מתאים ניתוח פונקציה RNA קטנים10. אז, יש עדיין לפתח שיטות משלוח ויראלי יעיל ליתושים.
יתוש densoviruses (MDVs) הם חלק תת משפחה Densovirinae Parvoviridae, ונפילתה, כולם בתוך הסוג של Brevidensovirus11. MDV virions שאינו אפוף הינם מורכבים של גנום חד גדילי הדנ א (ssDNA), של capsid icosahedral (20 ננומטר בקוטר). הגנום הנגיפי משוכפל בתוך הגרעינים של התאים המארחים והיא בגודל של-4 kb. MDVs יציבים יחסית בסביבת ולהציג מגוון מארח צר עם ירידה לפרטים גבוה ליתושים. וירוסים אלה יש פוטנציאל התפשטה, מתעקש באופן טבעי אוכלוסיות יתוש, יכול לפלוש כמעט כל איברים ורקמות של חרקים אלה, לרבות פיתול, Malpighian בקוריאנית, שומן הגוף, מערכת השרירים, נוירונים, בלוטות הרוק12.
הגנום MDV שלם יכול להיות subcloned לתוך פלסמיד וקטורים לייצר שיבוטים זיהומיות המבוסס על פלסמיד; כאשר שיבוטים אלה מועברים לתאים יתושים, הגנום הנגיפי מופק מן הווקטור פלסמיד, נגיפים זיהומיות מיוצרים. מכיוון MDV יש גנום קטן ssDNA, שיבוטים זיהומיות נבנות בקלות וניתן הגנום הנגיפי בקלות בעורמה11,13. מאפיינים אלה להפוך MDV סוכן יקר לבחינת ביולוגיה נגד יתושים. עם זאת, כי כמעט את כל רצף הגנום הנגיפי חיונית עבור הפצה ויראלית, היצירה של וירוס רקומביננטי באמצעות החלפת או החדרת גנים זרים גורמת הפסד יכולות אריזה ו/או שכפול ויראלי, אשר יוצר מכשול להתפתחות של MDVs כמו ג’ין משלוח וקטורים. במסמך זה, אנחנו מדווחים באמצעות אסטרטגיית מלאכותי ביטוי קטן-RNA intronic לפתח מפורמטת rAaeDV ויוו RNA משלוח מערכת בעלת היתרונות של בנייה קלה פלסמיד ותחזוקה של וירוס פונקציונלי יכול לייצר ביטוי ארוכות טווח ויציבה בתאי המארח ללא צורך פראי-סוג וירוס. בנוסף, שיטה זו מאפשרת התמרה חושית קל של הזחלים.
הפרוטוקולים עבור השלבים הבאים מתוארים במחקר זה: שורה 1) העיצוב של rAaeDVs קידוד של קלטת ביטוי קטן-RNA intronic, 2) לייצור חלקיקי וירוס רקומביננטי שימוש בתא C6/36 אריזה, 3) ניתוח כמותי של התא-חופשית הגנום rAaeDV להעתיק מספרים ו- 4) זיהום של Ae. albopictus הזחלים על ידי ישיר החדרת וירוס לתוך הגוף מים של הגידול הזחל. בסך הכל, עבודה זו הוכיחה כי RNAs קטן מסוים או גנים היעד שניתן overexpressed או הפיל ב הזחלים יתושים באמצעות מערכת מפותחת של משלוח MDV.
Protocol
Representative Results
Discussion
חשוב להתגבר על שני המחסומים מפתח המגבילות בנייה rAaeDV. הראשון הוא הייצור של וירוס רקומביננטי פגומה. בעבר דווח כי MDV יכול לשמש וקטור לבטא כראוי בגודל גנים זרים, כגון עקרב חרקים ייחודיות neurotoxins20 החלבון GFP; עם זאת, משנה האסטרטגיה הבנייה, ברגע ORFs של MDV נוספו או מוחלף גנים אקסוגני, virions לא יכול ליצור ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים לאשר תמיכה כספית מן המחקר הלאומי מפתח תוכנית הפיתוח של סין (2016YFC1200500 אל שיאו-גואנג חן), את נבחרת מדעי הטבע קרן של סין (81672054 ו- 81371846), התכנית צוות המחקר של הטבעי קרן המדע של גואנג-דונג (2014A030312016), התכנית המדעית והטכנולוגית של גואנגג’ואו (201508020263). אנו להכיר בהכרת תודה פרופסור ג’ונתן קרלסון (קולורדו סטייט) עבור מתבקשים לספק את פלסמידים ןלמה ו- p7NS1-GFP, אנושות קריאת כתב היד הזה.
Materials
| Centrifuge machine | Thermo Scientific | 75004260 | |
| Centrifuge System | Beckman Coulter | 363118 | |
| GeneJET Gel Extraction Kit | Thermo Scientific | K0691 | |
| E.Z.N.A. Plasmid Midi Kit | Omega Biotech | D6904 | |
| Purified Agar | OXOID | LP0028A | |
| FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase (1 U/µL) | Thermo Scientific | EF0651 | |
| FastDigest HpaI | Thermo Scientific | FD1034 | |
| FastDigest XbaI | Thermo Scientific | FD0684 | |
| T4 DNA Ligase (5 U/µL) | Thermo Scientific | EL0011 | |
| TransStbl3 Chemically Competent Cell | Beijing Transgen Biotech | CD521-01 | |
| Ampicillin | Beijing Tiangen Biotech | RT501 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Gibco， Life Technologies | 21875109 | |
| Fetal Bovine Serum（ Australia Origin） | Gibco， Life Technologies | 10099141 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco， Life Technologies | 15070063 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen，Life Technologies | 11668019 | |
| Proteinase K | Promega | MC5008 | |
| DNase I (RNase-free) | Invitrogen，Life Technologies | AM2222 | |
| SuperReal PreMix Plus (SYBR Green) | Beijing Tiangen Biotech | FP205 |
Referências
- Tolle, M. A. Mosquito-borne diseases. Current problems in pediatric and adolescent health care. 39, 97-140 (2009).
- Petersen, L. R., Jamieson, D. J., Powers, A. M., Honein, M. A. Zika Virus. The New England journal of medicine. 374, 1552-1563 (2016).
- Roberts, D. R., Andre, R. G. Insecticide resistance issues in vector-borne disease control. The American journal of tropical medicine and hygiene. 50, 21-34 (1994).
- Attaran, A., Roberts, D. R., Curtis, C. F., Kilama, W. L. Balancing risks on the backs of the poor. Nature medicine. 6, 729-731 (2000).
- Volohonsky, G., et al. Transgenic Expression of the Anti-parasitic Factor TEP1 in the Malaria Mosquito Anopheles gambiae. PLoS pathogens. 13, 1006113 (2017).
- Galizi, R., et al. A synthetic sex ratio distortion system for the control of the human malaria mosquito. Nature communications. 5, 3977 (2014).
- Bourtzis, K., Lees, R. S., Hendrichs, J., Vreysen, M. J. More than one rabbit out of the hat: Radiation, transgenic and symbiont-based approaches for sustainable management of mosquito and tsetse fly populations. Acta tropica. 157, 115-130 (2016).
- Kumar, S. S., Puttaraju, H. P. Improvised microinjection technique for mosquito vectors. The Indian journal of medical research. 136, 971-978 (2012).
- Attardo, G. M., Higgs, S., Klingler, K. A., Vanlandingham, D. L., Raikhel, A. S. RNA interference-mediated knockdown of a GATA factor reveals a link to anautogeny in the mosquito Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 13374-13379 (2003).
- Singh, A. D., Wong, S., Ryan, C. P., Whyard, S. Oral delivery of double-stranded RNA in larvae of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti: implications for pest mosquito control. Journal of insect science. 13, 69 (2013).
- Ward, T. W., et al. Aedes aegypti transducing densovirus pathogenesis and expression in Aedes aegypti and Anopheles gambiae larvae. Insect molecular biology. 10, 397-405 (2001).
- Carlson, J., Suchman, E., Buchatsky, L. Densoviruses for control and genetic manipulation of mosquitoes. Advances in virus research. 68, 361-392 (2006).
- Barreau, C., Jousset, F. X., Bergoin, M. Pathogenicity of the Aedes albopictus parvovirus (AaPV), a denso-like virus, for Aedes aegypti mosquitoes. Journal of invertebrate pathology. 68, 299-309 (1996).
- Liu, P., et al. Development of non-defective recombinant densovirus vectors for microRNA delivery in the invasive vector mosquito, Aedes albopictus. Scientific reports. 6, 20979 (2016).
- Ortega, M. M., Bouamar, H. Guidelines on Designing MicroRNA Sponges: From Construction to Stable Cell Line. Methods in molecular biology. 1509, 221-233 (2017).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. Journal of visualized experiments : JoVE. , e253 (2007).
- Afanasiev, B. N., Kozlov, Y. V., Carlson, J. O., Beaty, B. J. Densovirus of Aedes aegypti as an expression vector in mosquito cells. Experimental parasitology. 79, 322-339 (1994).
- Hu, H. Y., et al. Evolution of the human-specific microRNA miR-941. Nature communications. 3, 1145 (2012).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74, 5463-5467 (1977).
- Dalby, B., et al. Advanced transfection with Lipofectamine 2000 reagent: primary neurons, siRNA, and high-throughput applications. Methods (San Diego, Calif). 33, 95-103 (2004).
- Gu, J. B., Dong, Y. Q., Peng, H. J., Chen, X. G. A recombinant AeDNA containing the insect-specific toxin, BmK IT1, displayed an increasing pathogenicity on Aedes albopictus. The American journal of tropical medicine and hygiene. 83, 614-623 (2010).
- Hou, Y., Zhang, H., Miranda, L., Lin, S. Serious overestimation in quantitative PCR by circular (supercoiled) plasmid standard: microalgal pcna as the model gene. PloS one. 5, 9545 (2010).
- Ding, J., et al. Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2016).
