Uso de un Mosquito recombinante Densovirus como un Vector de la entrega de genes para el análisis funcional de Genes en larvas de mosquitos
Summary
Nos informe utilizando una artificial pequeño intronic RNA expresión estrategia para desarrollar un recombinante defectuoso no Aedes aegypti densovirus (AaeDV) en vivo el sistema de entrega. Se describe un procedimiento detallado para la construcción, envases y análisis cuantitativo de los vectores rAaeDV, así como por infección larval.
Abstract
Microinyección en vivo es la técnica de transferencia de genes más comúnmente utilizado para el análisis de las funciones del gene en los mosquitos. Sin embargo, este método requiere más técnicamente exigente operación y consiste en complicados procedimientos, especialmente cuando se utiliza en las larvas debido a su pequeño tamaño, relativamente delgada y frágil de la cutícula y alta mortalidad, que limitan su aplicación. Por el contrario, vectores virales para la entrega del gene se han desarrollado para superar las barreras extracelulares e intracelulares. Estos sistemas tienen las ventajas de fácil manipulación, eficiencia de transducción genética alta, mantenimiento a largo plazo de la expresión génica y la capacidad para producir efectos persistentes en vivo. Mosquito densoviruses (MDVs) son específicos de mosquito, pequeños virus de ADN de monocatenario que efectivamente pueden entregar extranjeros los ácidos nucleicos en células de mosquito; sin embargo, la sustitución o inserción de genes foráneos a crear virus recombinantes que típicamente causa una pérdida de capacidades de envases o replicación, que es un obstáculo para el desarrollo de estos virus como vectores de la entrega.
Adjunto, divulgamos usando una estrategia de expresión de ARN pequeño intronic artificial para desarrollar un recombinante defectuoso no Aedes aegypti densovirus (AaeDV) en vivo el sistema de entrega. Se describen los procedimientos detallados para la construcción, envases y análisis cuantitativo de los vectores rAaeDV y para la infección de larvas.
Este estudio demuestra, por primera vez, la viabilidad del desarrollo de un no-defectuosa recombinante MDV micro RNA (miRNA) sistema de la expresión, proporcionando una potente herramienta para el análisis funcional de genes en mosquito y establecer una base para la aplicación de paratransgenesis viral para el control de enfermedades transmitidas por mosquitos. Hemos demostrado que larvas de Aedes albopictus 1st estadio podrían ser fácilmente y efectivamente infectadas mediante la introducción de virus en el cuerpo de agua del sitio de cría de larvas y que el rAaeDVs desarrollado podría utilizarse para sobreexpresar o derribar el expresión de un gen Diana en larvas, proporcionando una herramienta para el análisis funcional del mosquito de genes.
Introduction
Enfermedades transmitidas por mosquitos como la malaria, dengue, fiebre zika y fiebre amarilla, son problemas de salud pública internacional importante que siguen representan una fracción significativa de la carga global enfermedades infecciosas1,2. Los insecticidas convencionales, que han sido utilizados en respuesta a vectores, son un componente importante de la estrategia de control de mosquito integrado sostenible para la prevención de enfermedades transmitidas por mosquitos. Sin embargo, tales estrategias han probado para ser relativamente ineficaz o indeseables debido a los impactos ambientales negativos asociados, así como la evolución de la resistencia en las poblaciones de mosquitos3,4. Por estas razones, hay una necesidad urgente de métodos alternativos de mosquito control y el uso de métodos transgénicos para producir mosquitos machos estériles y la liberación de mosquitos resistentes al patógeno han surgido como prometedoras nuevas estrategias de control. Para desarrollar nuevo control efectivo métodos, tales como seguros y efectivos enfoques en vivo entrega de gen, el análisis integral de funciones de los genes mosquito es necesario.
Microinyección directa de plásmido ADN, doble había trenzado RNA (dsRNA) o ARN interferente pequeño (siRNA) es el más comúnmente utilizado en vivo gene entrega en mosquitos. De hecho, la producción de variedades transgénicas de mosquitos todavía dependen de un proceso de embrión microinyección5,6,7. Sin embargo, microinyección tiene varias limitaciones. En primer lugar, esta técnica es técnicamente exigente y consiste en complicados procedimientos. En segundo lugar, la inyección causa una ofensa física a los embriones, larvas, pupas y adulto, que afecta directamente a la viabilidad del organismo diana. En tercer lugar, es difícil de inmovilizar las larvas de mosquito para microinyección porque la mayoría vive en un hábitat acuático y posee una característica moverse movimiento. En cuarto lugar, el tamaño de 1st-2 larvas desegundo estadio es 10 a 20 veces más pequeño que el de 4th instar y larvas más viejas y las cutículas de los primeros son más delicadas. Estas características hacen difícil manipular 1st-2 larvas desegundo estadio en comparación con aquellos en etapas mayores. Combinados, estos factores contribuyen a una tasa de supervivencia después de la inyección reducida para larvas (aproximadamente 5%) en comparación con adultos8. Sistemas de entrega basados en viral se han desarrollado para superar las barreras asociadas extracelulares e intracelulares. Estos sistemas tienen las ventajas de fácil manipulación, eficiencia de transducción alto, robustos y a largo plazo niveles de expresión y la capacidad para producir efectos persistentes en vivo. Por lo tanto, gene sistemas utilizando adenovirus, retrovirus y lentivirus han sido ampliamente utiliza líneas celulares de inmammalian y especies modelo. El sistema de expresión virales Sindbis se había utilizado anteriormente para analizar la función del gene en el mosquito adulto; Además de las preocupaciones de seguridad de la biotecnología, sin embargo, la inyección es todavía un proceso necesario para la infección viral9. Aunque la administración oral sumergiendo las larvas en la solución de dsRNA se ha divulgado previamente como un método factible, es adecuado para pequeños RNA función análisis10. Por lo tanto, métodos de distribución viral eficaz todavía deben desarrollar para los mosquitos.
Mosquito densoviruses (MDVs) forman parte de la subfamilia Densovirinae de Parvoviridaey todo pero una caída dentro del género Brevidensovirus11. MDV viriones son no-envueltos y constan de un genoma de ADN (ssDNA) monocatenario y una cápside icosaédrica (20 nm de diámetro). El genoma viral es de aproximadamente 4 kb de tamaño y se replica dentro de los núcleos de las células del huésped. MDVs son relativamente estables en el medio ambiente y muestran una gama estrecha con alta especificidad para los mosquitos. Estos virus tienen el potencial de propagarse y naturalmente persisten en las poblaciones de mosquitos y pueden invadir casi todos los órganos y tejidos de estos insectos, incluyendo el midgut, túbulos de Malpighi, grasa corporal, musculatura, neuronas y glándulas salivales12.
Genomas MDV intactos pueden subcloned en vectores plásmidos para producir clones infecciosos basados en el plásmido; Cuando estos clones se entregan en células de mosquito, el genoma viral se extrae el vector plásmido, y se producen partículas virales infecciosas. Porque MDV tiene un genoma pequeño de ssDNA, clones infecciosos se construyen fácilmente y el genoma viral puede ser fácilmente manipulado11,13. Estas características hacen de MDV un agente valioso para examinar la biología del mosquito. Sin embargo, porque casi la totalidad de la secuencia del genoma viral es esencial para la proliferación viral, la creación de virus recombinantes a través de la sustitución o inserción de genes foráneos provoca una pérdida en la capacidad de envases o replicación viral, que crea un barrera para el desarrollo de MDVs como vectores entrega del gene. Adjunto, divulgamos usando una estrategia de expresión de ARN pequeño intronic artificial para desarrollar un rAaeDV de no-defectuosa en vivo RNA sistema de entrega que tiene las ventajas de la construcción del plásmido fácil y el mantenimiento de un virus funcional que puede producir expresión estable y a largo plazo en las células del huésped sin necesidad de virus de tipo salvaje. Además, este método permite la transducción fácil de larvas.
En este estudio se describen los protocolos para los siguientes pasos: 1) diseño de rAaeDVs un casete de expresión de ARN pequeño intronic, 2) producción de partículas de virus recombinantes usando la célula de embalaje C6/36 de la codificación de línea, 3) análisis cuantitativo de la libre rAaeDV genoma copiar números y 4) infección de larvas de Ae. albopictus por introducción directa del virus en el cuerpo de agua del hábitat larval. En general, este trabajo demostró que específico RNAs pequeños genes diana pueden ser overexpressed o derribados en larvas de mosquitos mediante el sistema de entrega MDV desarrollado.
Protocol
Representative Results
Discussion
Es importante superar dos de las principales barreras que limitan la construcción de rAaeDV. La primera es la producción de virus recombinante defectuoso. Se ha reportado que MDV se puede utilizar como un vector para expresar apropiadamente genes extranjeros, como el escorpión insectos específicos neurotoxins20 y la proteína GFP; sin embargo, independientemente de la estrategia de construcción, una vez ORFs de MDV se inserta o se reemplazan con genes exógenos, los viriones no pueden formar independientemente a men…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores reconocen el apoyo financiero de la investigación clave y programa de desarrollo de China (2016YFC1200500 a Xiao Guang Chen), la nacional Ciencias naturales Fundación de China (81672054 y 81371846), el programa equipo de investigación de lo Natural Fundación de Ciencias de Guangdong (2014A030312016) y el programa científico y tecnológico de Guangzhou (201508020263). Agradecemos a profesor Jonathan Carlson (Colorado State University) amablemente la plásmidos pUCA y p7NS1-GFP y de lectura crítica de este manuscrito.
Materials
| Centrifuge machine | Thermo Scientific | 75004260 | |
| Centrifuge System | Beckman Coulter | 363118 | |
| GeneJET Gel Extraction Kit | Thermo Scientific | K0691 | |
| E.Z.N.A. Plasmid Midi Kit | Omega Biotech | D6904 | |
| Purified Agar | OXOID | LP0028A | |
| FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase (1 U/µL) | Thermo Scientific | EF0651 | |
| FastDigest HpaI | Thermo Scientific | FD1034 | |
| FastDigest XbaI | Thermo Scientific | FD0684 | |
| T4 DNA Ligase (5 U/µL) | Thermo Scientific | EL0011 | |
| TransStbl3 Chemically Competent Cell | Beijing Transgen Biotech | CD521-01 | |
| Ampicillin | Beijing Tiangen Biotech | RT501 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Gibco， Life Technologies | 21875109 | |
| Fetal Bovine Serum（ Australia Origin） | Gibco， Life Technologies | 10099141 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco， Life Technologies | 15070063 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen，Life Technologies | 11668019 | |
| Proteinase K | Promega | MC5008 | |
| DNase I (RNase-free) | Invitrogen，Life Technologies | AM2222 | |
| SuperReal PreMix Plus (SYBR Green) | Beijing Tiangen Biotech | FP205 |
Referências
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