استخدام دينسوفيروس المؤتلف البعوض ناقل توصيل جينات للتحليل الوظيفي للجينات في يرقات البعوض
Summary
نحن تقرير استخدام اصطناعية إينترونيك صغيرة رنا تعبير استراتيجية لتطوير غير تالف المؤتلف دينسوفيروس (آيدف) بعوض الزاعجة المصرية في فيفو نظام التسليم. ويرد وصف إجراء مفصل للبناء والتعبئة والتغليف، والتحليل الكمي لناقلات رايدف، وكذلك فيما يتعلق بالإصابة باليرقات.
Abstract
في فيفو microinjection هو تقنية نقل الجينات الأكثر استخداماً لتحليل وظائف الجينات في البعوض الفردية. ومع ذلك، هذا الأسلوب يتطلب أكثر تقنيا مطالبين بعملية وينطوي على إجراءات معقدة، لا سيما عند استخدامها في اليرقات بسبب صغر حجمها، وبشرة رقيقة وهشة نسبيا، وارتفاع معدل الوفيات، التي تحد من تطبيقها. وفي المقابل، وضعت النواقل الفيروسية لإيصال الجينات التغلب على الحواجز خارج الخلية وداخل الخلية. هذه النظم لها المزايا من السهل التلاعب وتوصيل الجينات عالية الكفاءة والصيانة على المدى الطويل من التعبير الجيني والقدرة على إنتاج الآثار المستمرة في فيفو. دينسوفيروسيس البعوض (مدفس) هي فيروسات الحمض النووي واحد-الذين تقطعت بهم السبل الخاصة بالبعوض، والصغيرة التي يمكن أن يحقق فعالية الأحماض النووية الأجنبية إلى خلايا البعوض؛ بيد الاستبدال أو الإدراج للجينات الأجنبية لإنشاء الفيروسات المؤتلف عادة ما يسبب فقدان قدرات التعبئة والتغليف و/أو النسخ المتماثل، مما يشكل عائقا أمام تطوير هذه الفيروسات نواقل التسليم.
هنا، نحن التقرير باستخدام استراتيجية تعبير الصغيرة-الجيش الملكي النيبالي إينترونيك اصطناعي لتطوير غير تالف المؤتلف دينسوفيروس (آيدف) بعوض الزاعجة المصرية في فيفو نظام التسليم. ويرد وصف إجراءات مفصلة للبناء والتغليف والتحليل الكمي لناقلات رايدف، والإصابة بعدوى اليرقات.
وتوضح هذه الدراسة، للمرة الأولى، إمكانية وضع غير تالف المؤتلف MDV الصغرى الحمض النووي الريبي (ميرنا) تعبير نظام، وهكذا يوفر أداة قوية للتحليل الوظيفي للجينات في البعوض ووضع أساس تطبيق باراترانسجينيسيس الفيروسية للسيطرة على الأمراض التي ينقلها البعوض. أظهرنا أن Aedes albopictus 1st الطور اليرقات يمكن أن تكون مصابة بسهولة وفعالية بإدخال الفيروس في الجسم المياه من اليرقات تربية الموقع وأن رايدفس المتقدمة يمكن أن تستخدم أوفيريكسبريس أو هدم تعبير الجينات المستهدفة المحددة في يرقات، توفير أداة للتحليل الوظيفي للبعوض الجينات.
Introduction
الأمراض التي ينقلها البعوض مثل الملاريا وحمى الضنك والحمى زيكا والحمى الصفراء، وهي المشاكل الرئيسية للصحة العامة الدولية التي ما زالت تستأثر بجزء كبير من العبء العالمي للأمراض المعدية1،2. مبيدات الحشرات التقليدية، التي جرى استخدامها في الاستجابة للنواقل، عنصرا رئيسيا لاستراتيجية مكافحة البعوض المتكاملة المستدامة للوقاية الأمراض التي ينقلها البعوض. ومع ذلك، أثبتت هذه الاستراتيجيات أن تكون نسبيا غير فعالة أو غير مرغوب فيه بسبب الآثار البيئية السلبية المرتبطة بها، فضلا عن تطور مقاومة البعوض السكان3،4. لهذه الأسباب، هناك حاجة ملحة إلى طرق بديلة من البعوض السيطرة، واستخدام أساليب معدلة وراثيا لإنتاج البعوض الذكور العقيمة والإفراج عن البعوض المقاوم الممرض نشأت كاستراتيجيات مراقبة جديدة واعدة. تطوير التحكم فعالة جديدة الأساليب، مثل نهج آمنة وفعالة للتسليم في فيفو الجينات، والتحليل الشامل لوظيفة الجينات البعوض مطلوب.
Microinjection مباشرة من بلازميد الحمض النووي، مزدوج تقطعت الحمض النووي الريبي (dsRNA) أو الحمض النووي الريبي التدخل الصغيرة (siRNA) هو الأكثر استخداماً في فيفو الجينات طريقة التسليم في البعوض. في الواقع، لا تزال تعتمد إنتاج سلالات معدلة وراثيا من البعوض في عملية جنين microinjection5،،من67. ومع ذلك، قد microinjection العديد من القيود. أولاً، أن هذا الأسلوب تقنيا تطالب وينطوي على إجراءات معقدة. ثانيا، يؤدي الحقن إهانة مادية للأجنة واليرقات، الخوادر، والكبار، مما يؤثر تأثيراً مباشرا على صلاحية الكائن المستهدف. وثالثاً، من الصعب شل يرقات البعوض ل microinjection نظراً لأن معظم يعيش في الموائل المائية وتمتلك خاصية مشارعهم الحركة. الرابع، حجم 1st-2nd يرقات الطور 10 إلى 20 ضعفا أصغر من ذلك من 4ال الطور واليرقات الأكبر سنا، والبشرة السابقة أكثر حساسية. هذه الميزات تجعل من الصعب على التلاعب 1st-2nd يرقات الطور مقارنة بتلك التي في مراحل قديمة. جنبا إلى جنب، تسهم هذه العوامل بمعدل انخفاض حقن بعد بقاء لليرقات (حوالي 5 في المائة) بالمقارنة مع البالغين8. وقد وضعت منظومات الإيصال الفيروسية التغلب على الحواجز خارج الخلية وداخل الخلية المرتبطة بها. هذه النظم لها المزايا من السهل التلاعب وتوصيل عالية الكفاءة ومستويات قوية وطويلة الأجل للتعبير والقدرة على إنتاج الآثار المستمرة في فيفو. ولذلك، استخدام الجينات قد تم إيصالها الاستفادة من الفيروسات القهقرية و lentiviruses غدية على نطاق واسع خطوط الخلايا إينماماليان والأنواع النموذجية. نظام التعبير الفيروسية سيندبيس قد استخدمت سابقا لتحليل وظيفة الجينات في البعوضة الكبار؛ وباﻹضافة إلى شواغل السلامة الأحيائية، ولكن الحقن لا يزال عملية ضرورية للعدوى الفيروسية9. وعلى الرغم من التسليم الشفوي بامتصاص اليرقات في حل دسرنا أفيد سابقا كأسلوب تسليم ممكناً، أنها غير ملائمة ل تحليل وظيفة الحمض النووي الريبي الصغيرة10. لذلك، لا يزال ينبغي وضع طرق التسليم الفيروسية الفعالة للبعوض.
دينسوفيروسيس البعوض (مدفس) جزء من فصيلة دينسوفيريناي بارفوفيريداي، وتقع كافة ولكن واحد في جنس بريفيدينسوفيروس11. فيريونس MDV هي غير المغلفة وتتكون من جينوم الحمض النووي (سدنا) واحد-الذين تقطعت بهم السبل وقفيصه icosahedral (20 نانومتر في القطر). الجينوم الفيروسي حوالي 4 كيلو بايت في الحجم، ويتم تكرارها داخل نواة الخلايا المضيفة. مدفس مستقرة نسبيا في البيئة وإظهار مجموعة مضيف ضيقة مع خصوصية عالية للبعوض. هذه الفيروسات يمكن أن تنتشر وتستمر بطبيعة الحال في السكان البعوض، ويمكن أن تغزو تقريبا جميع الأعضاء والأنسجة من هذه الحشرات، بما في ذلك الأمامي، Malpighian الأنابيب، والدهون في الجسم والجهاز العضلي، والخلايا العصبية، والغدد اللعابية12.
يمكن أن سوبكلونيد سليمة MDV الجينوم إلى بلازميد موجهات لإنتاج الحيوانات المستنسخة على أساس بلازميد المعدية؛ عندما يتم تسليم هذه النسخ إلى خلايا البعوضة، يستخرج الجينوم الفيروسي من ناقلات بلازميد، وتنتج الجسيمات الفيروسية المعدية. بسبب MDV جينوم ssDNA صغيرة، استنساخ المعدية هي التي شيدت بسهولة والجينوم الفيروسي يمكن أن تكون بسهولة التلاعب بها11،13. هذه الخصائص تجعل MDV عامل قيمة لدراسة البيولوجيا البعوض. ومع ذلك، نظراً لأن ما يقرب من كل تسلسل الجينوم الفيروسي ضروري لانتشار الفيروس، إنشاء الفيروسات المؤتلف من خلال استبدال أو الإدراج من الجينات الأجنبية تتسبب في فقد في قدرات التعبئة والتغليف و/أو النسخ المتماثل الفيروسية، مما يخلق حاجز لتطوير مدفس كمتجهات إيصال الجينات. هنا، نحن التقرير باستخدام استراتيجية تعبير الصغيرة-الجيش الملكي النيبالي إينترونيك اصطناعية لوضع رايدف غير معيبة في فيفو الجيش الملكي النيبالي تسليم نظام يحتوي على مزايا بلازميد سهلة البناء والحفاظ على الفيروس الوظيفية التي يمكن أن تنتج تعبير مستقر وطويل الأجل في الخلايا المضيفة دون الحاجة إلى البرية من نوع الفيروس. بالإضافة إلى ذلك، يسمح هذا الأسلوب لتوصيل سهل لليرقات.
يتم وصف البروتوكولات للخطوات التالية في هذه الدراسة: 1) تصميم رايدفس ترميز كاسيت إينترونيك الصغيرة-الجيش الملكي النيبالي تعبير، 2) إنتاج جزيئات الفيروس المؤتلف الخلية C6/36 التغليف باستخدام خط، 3) التحليل الكمي للخلية الحرة رايدف الجينوم نسخ الأرقام، و 4) الإصابة بيرقات Ae. albopictus بالتقديم المباشر للفيروس في جسم المياه الموئل اليرقات. إجمالاً، أظهرت هذا العمل أن يمكن overexpressed الكشف صغيرة محددة أو الجينات المستهدفة أو ترسيتها في يرقات البعوض باستخدام نظام التسليم MDV المتقدمة.
Protocol
Representative Results
Discussion
من المهم أن التغلب على اثنين من الحواجز الرئيسية التي تحد من البناء رايدف. الأول هو إنتاج فيروس المؤتلف معيبة. فقد أفيد أن MDV يمكن أن تستخدم كوسيلة للتعبير عن شكل مناسب الحجم الجينات الأجنبية، مثل العقرب neurotoxins20 الخاصة بالحشرات والبروتين التجارة والنقل؛ بيد بغض النظر عن استراتيجية التشييد…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب تقر دعما ماليا من البحوث الرئيسية الوطنية وبرنامج التنمية في الصين (2016YFC1200500 “تشن” شياو قوانغ)، الوطني العلوم الطبيعية مؤسسة في الصين (81672054 و 81371846)، وبرنامج فريق البحوث الطبيعية المؤسسة للعلوم في قوانغدونغ (2014A030312016)، والبرامج العلمية والتكنولوجية في قوانغتشو (201508020263). ونعترف مع الامتنان البروفيسور جوناثان كارلسون (جامعة ولاية كولورادو) يرجى تقديم والبلازميدات بوكا و p7NS1-التجارة والنقل ونقديا قراءة هذه المخطوطة.
Materials
| Centrifuge machine | Thermo Scientific | 75004260 | |
| Centrifuge System | Beckman Coulter | 363118 | |
| GeneJET Gel Extraction Kit | Thermo Scientific | K0691 | |
| E.Z.N.A. Plasmid Midi Kit | Omega Biotech | D6904 | |
| Purified Agar | OXOID | LP0028A | |
| FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase (1 U/µL) | Thermo Scientific | EF0651 | |
| FastDigest HpaI | Thermo Scientific | FD1034 | |
| FastDigest XbaI | Thermo Scientific | FD0684 | |
| T4 DNA Ligase (5 U/µL) | Thermo Scientific | EL0011 | |
| TransStbl3 Chemically Competent Cell | Beijing Transgen Biotech | CD521-01 | |
| Ampicillin | Beijing Tiangen Biotech | RT501 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Gibco， Life Technologies | 21875109 | |
| Fetal Bovine Serum（ Australia Origin） | Gibco， Life Technologies | 10099141 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco， Life Technologies | 15070063 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen，Life Technologies | 11668019 | |
| Proteinase K | Promega | MC5008 | |
| DNase I (RNase-free) | Invitrogen，Life Technologies | AM2222 | |
| SuperReal PreMix Plus (SYBR Green) | Beijing Tiangen Biotech | FP205 |
Referências
- Tolle, M. A. Mosquito-borne diseases. Current problems in pediatric and adolescent health care. 39, 97-140 (2009).
- Petersen, L. R., Jamieson, D. J., Powers, A. M., Honein, M. A. Zika Virus. The New England journal of medicine. 374, 1552-1563 (2016).
- Roberts, D. R., Andre, R. G. Insecticide resistance issues in vector-borne disease control. The American journal of tropical medicine and hygiene. 50, 21-34 (1994).
- Attaran, A., Roberts, D. R., Curtis, C. F., Kilama, W. L. Balancing risks on the backs of the poor. Nature medicine. 6, 729-731 (2000).
- Volohonsky, G., et al. Transgenic Expression of the Anti-parasitic Factor TEP1 in the Malaria Mosquito Anopheles gambiae. PLoS pathogens. 13, 1006113 (2017).
- Galizi, R., et al. A synthetic sex ratio distortion system for the control of the human malaria mosquito. Nature communications. 5, 3977 (2014).
- Bourtzis, K., Lees, R. S., Hendrichs, J., Vreysen, M. J. More than one rabbit out of the hat: Radiation, transgenic and symbiont-based approaches for sustainable management of mosquito and tsetse fly populations. Acta tropica. 157, 115-130 (2016).
- Kumar, S. S., Puttaraju, H. P. Improvised microinjection technique for mosquito vectors. The Indian journal of medical research. 136, 971-978 (2012).
- Attardo, G. M., Higgs, S., Klingler, K. A., Vanlandingham, D. L., Raikhel, A. S. RNA interference-mediated knockdown of a GATA factor reveals a link to anautogeny in the mosquito Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 13374-13379 (2003).
- Singh, A. D., Wong, S., Ryan, C. P., Whyard, S. Oral delivery of double-stranded RNA in larvae of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti: implications for pest mosquito control. Journal of insect science. 13, 69 (2013).
- Ward, T. W., et al. Aedes aegypti transducing densovirus pathogenesis and expression in Aedes aegypti and Anopheles gambiae larvae. Insect molecular biology. 10, 397-405 (2001).
- Carlson, J., Suchman, E., Buchatsky, L. Densoviruses for control and genetic manipulation of mosquitoes. Advances in virus research. 68, 361-392 (2006).
- Barreau, C., Jousset, F. X., Bergoin, M. Pathogenicity of the Aedes albopictus parvovirus (AaPV), a denso-like virus, for Aedes aegypti mosquitoes. Journal of invertebrate pathology. 68, 299-309 (1996).
- Liu, P., et al. Development of non-defective recombinant densovirus vectors for microRNA delivery in the invasive vector mosquito, Aedes albopictus. Scientific reports. 6, 20979 (2016).
- Ortega, M. M., Bouamar, H. Guidelines on Designing MicroRNA Sponges: From Construction to Stable Cell Line. Methods in molecular biology. 1509, 221-233 (2017).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. Journal of visualized experiments : JoVE. , e253 (2007).
- Afanasiev, B. N., Kozlov, Y. V., Carlson, J. O., Beaty, B. J. Densovirus of Aedes aegypti as an expression vector in mosquito cells. Experimental parasitology. 79, 322-339 (1994).
- Hu, H. Y., et al. Evolution of the human-specific microRNA miR-941. Nature communications. 3, 1145 (2012).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74, 5463-5467 (1977).
- Dalby, B., et al. Advanced transfection with Lipofectamine 2000 reagent: primary neurons, siRNA, and high-throughput applications. Methods (San Diego, Calif). 33, 95-103 (2004).
- Gu, J. B., Dong, Y. Q., Peng, H. J., Chen, X. G. A recombinant AeDNA containing the insect-specific toxin, BmK IT1, displayed an increasing pathogenicity on Aedes albopictus. The American journal of tropical medicine and hygiene. 83, 614-623 (2010).
- Hou, Y., Zhang, H., Miranda, L., Lin, S. Serious overestimation in quantitative PCR by circular (supercoiled) plasmid standard: microalgal pcna as the model gene. PloS one. 5, 9545 (2010).
- Ding, J., et al. Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2016).
