Uso de um Mosquito recombinante Densovirus como um vetor de entrega do Gene para a análise funcional de Genes em larvas do Mosquito
Summary
Nós relatamos usando uma artificial intrônicas pequeno RNA expressão estratégia para desenvolver um recombinante com defeito não Aedes aegypti densovirus (AaeDV) na vivo sistema de entrega. Um procedimento detalhado para a construção, embalagens e análise quantitativa dos vetores rAaeDV tão bem quanto a infecção larval é descrito.
Abstract
Microinjection in vivo é a técnica de transferência do gene mais comumente usados para analisar as funções do gene em mosquitos individuais. No entanto, esse método requer uma mais tecnicamente exigente operação e envolve procedimentos complicados, especialmente quando usado em larvas devido ao seu pequeno tamanho, cutícula relativamente fina e frágil e alta mortalidade, que limitam a sua aplicação. Em contraste, vetores virais para a entrega do gene foram desenvolvidos para superar barreiras extracelulares e intracelulares. Estes sistemas têm as vantagens de fácil manipulação, gene alta eficiência de transdução, manutenção a longo prazo da expressão do gene e a capacidade de produzir efeitos persistentes na vivo. Mosquito densoviruses (MDVs) são específicos de mosquito, pequenos vírus de DNA único-encalhado que podem efetivamente entregar estrangeiros ácidos nucleicos nas células de mosquito; no entanto, a substituição ou a inserção de genes estrangeiros para criar vírus recombinantes normalmente provoca uma perda de habilidades de embalagens e/ou replicação, que é uma barreira para o desenvolvimento destes vírus como vetores de entrega.
Neste documento, nós relatamos utilizando uma estratégia intrônicas artificial pequeno-RNA expressão para desenvolver um recombinante com defeito não Aedes aegypti densovirus (AaeDV) na vivo sistema de entrega. São descritos os procedimentos detalhados para a construção, a embalagem e a análise quantitativa dos vetores rAaeDV e para infecção larval.
Este estudo demonstra, pela primeira vez, a viabilidade de desenvolver um com defeito não recombinante MDV micro RNA (miRNA) expressão sistema, desta forma fornecendo uma poderosa ferramenta de análise funcional de genes no mosquito e estabelecendo uma base para o aplicação de paratransgenesis viral para controlar doenças transmitidas por mosquitos. Demonstrámos que instar as larvas do Aedes albopictus 1st podem ser facilmente e eficazmente infectadas introduzindo o vírus para o corpo de água das larvas reprodução local e que o rAaeDVs desenvolvido poderia ser usado para overexpress ou derrubar o expressão de um gene alvo específico em larvas, fornecendo uma ferramenta de análise funcional de mosquito genes.
Introduction
Doenças transmitidas por mosquitos, como malária, febre do dengue, febre zika e febre amarela, são problemas de saúde pública internacional que continuam a ser responsáveis por uma fração significativa da carga global de doenças infecciosas1,2. Insecticidas convencionais, que têm sido utilizados em resposta a vetores, são um componente importante da estratégia de controle de mosquito integrado sustentável para a prevenção de doenças transmitidas por mosquitos. No entanto, tais estratégias provaram para ser relativamente ineficazes ou indesejáveis devido os impactos ambientais negativos associados, bem como a evolução da resistência no mosquito populações3,4. Por estas razões, há uma necessidade urgente de métodos alternativos de mosquito controle e o uso de métodos transgênicos para produzir mosquitos machos estéreis e o lançamento de mosquitos resistentes ao patógeno surgiram como promissoras novas estratégias de controle. Para desenvolver novo eficaz controlar métodos, tais como seguras e eficazes abordagens para na vivo entrega de gene, a análise abrangente da função do gene de mosquito é necessária.
Microinjeção direta de plasmídeo, dobro encalhado RNA (dsRNA) ou RNA de interferência pequeno (siRNA) é o mais comumente usado em vivo gene entrega método em mosquitos. Na verdade, a produção de variedades transgênicas de mosquitos ainda dependem de um processo de embrião microinjeção5,6,7. No entanto, microinjeção tem várias limitações. Em primeiro lugar, esta técnica é tecnicamente exigente e envolve procedimentos complicados. Em segundo lugar, a injeção faz com que um insulto físico para o embrião, larvas, pupas e adultos, que afecta directamente a viabilidade do organismo alvo. Em terceiro lugar, é difícil imobilizar as larvas de mosquito para microinjection porque a maioria vive em um habitat aquático e possuem uma característica que se contorcendo de movimento. Em quarto lugar, o tamanho de 1st-2nd ínstar larvas é 10 a 20 vezes menor do que a de 4th ínstar e larvas mais velhas e as cutículas da antiga são mais delicadas. Estas características tornam difícil de manipular 1st-2nd ínstar larvas em comparação com aqueles em estágios mais antigos. Combinados, esses fatores contribuem para uma taxa de sobrevivência de pós-injeção reduzida para larvas (cerca de 5%) em comparação com adultos8. Sistemas de entrega baseada em viral foram desenvolvidos para superar as barreiras extracelulares e intracelulares associadas. Estes sistemas têm as vantagens de fácil manipulação, transdução de alta eficiência, a longo prazo e robustos níveis de expressão e a capacidade de produzir efeitos persistentes na vivo. Portanto, gene entrega sistemas utilizando lentivírus, retrovírus e adenovírus foram amplamente utilizado linhas de células inmammalian e espécie de modelo. O sistema de expressão viral de Sindbis tinha sido anteriormente usado para analisar a função do gene no mosquito adulto; Além das preocupações de segurança biológica, no entanto, a injeção é ainda um processo necessário para infecção viral9. Embora, a entrega oral por larvas de imersão na solução dsRNA tem sido relatada anteriormente como um método de entrega viável, é inadequada para o pequeno RNA função análise10. Então, métodos de efetiva entrega viral ainda devem ser desenvolvidos para os mosquitos.
Mosquito densoviruses (MDVs) fazem parte da subfamília Densovirinae de Parvoviridaee uma queda do género Brevidensovirus11. Virions MDV são não-envelopado e consistem de um genoma de DNA (ssDNA) single-stranded e um capsídeo icosaédrica (20 nm de diâmetro). O genoma viral é aproximadamente 4 kb em tamanho e é replicado dentro dos núcleos das células do hospedeiro. MDVs são relativamente estáveis no ambiente e mostram uma gama de hospedeiros estreitas com alta especificidade para os mosquitos. Estes vírus têm o potencial para se espalhar e persistir naturalmente em populações de mosquito e podem invadir quase todos os órgãos e tecidos desses insetos, incluindo o midgut, Malpighi túbulos, gordura corporal, massa muscular, neurônios e glândulas salivares12.
Genomas MDV intactas podem ser subcloned em vetores do plasmídeo para produzir clones infecciosos baseados no plasmídeo; Quando estes clones são entregues em células de mosquito, o genoma viral é extraído do vetor do plasmídeo, e partículas virais infecciosas são produzidas. Porque MDV tem um genoma pequeno ssDNA, clones infecciosos são facilmente construídos e o genoma viral pode ser facilmente manipulado11,13. Estas características fazem MDV um valioso agente para examinar a biologia do mosquito. No entanto, porque quase toda a sequência do genoma viral é essencial para proliferação viral, a criação de vírus recombinantes através da substituição ou inserção de genes estrangeiros provoca uma perda na capacidade de embalagens e/ou replicação viral, que cria um barreira para o desenvolvimento de MDVs como vetores de entrega do gene. Neste documento, nós relatamos usando uma estratégia intrônicas artificial pequeno-RNA expressão para desenvolver um rAaeDV não-defeituoso na vivo RNA entrega sistema que tem as vantagens da construção fácil do plasmídeo e a manutenção de um vírus funcional que pode produzir estável e de longo prazo expressão em células hospedeiras, sem a necessidade de vírus do tipo selvagem. Além disso, este método permite a fácil transdução de larvas.
Os protocolos para as etapas a seguir são descritos neste estudo: linha 1) projeto de rAaeDVs codificação uma gaveta intrônicas expressão pequeno-RNA, 2) produção de partículas de vírus recombinantes usando a célula de empacotamento C6/36, 3) análise quantitativa de célula livre rAaeDV genoma copiar números e 4) infecção do Ae. albopictus larvas por introdução directa de vírus para o corpo de água do habitat larval. Em geral, este trabalho demonstrou que RNAs pequeno específico genes-alvo podem ser overexpressed ou derrubados em larvas de mosquito, usando o sistema de entrega MDV desenvolvido.
Protocol
Representative Results
Discussion
É importante superar dois das principais barreiras que limitam a construção rAaeDV. O primeiro é a produção de vírus recombinantes com defeito. Tem sido relatado que o MDV pode ser usado como um vetor para expressar apropriadamente dimensionada genes estrangeiros, tais como neurotoxins20 de inseto específico de escorpião e a proteína GFP; no entanto, independentemente da estratégia de construção, uma vez que as ORFs do MDV são inserido ou substituído com genes exógenos, virions não podem formar independe…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores reconhecem o apoio financeiro da pesquisa nacional de chave e programa de desenvolvimento da China (2016YFC1200500 de Chen Xiao Guang), Nacional Natural Science Foundation da China (81672054 e 81371846), a equipe de investigação do Natural Fundação de ciência de Guangdong (2014A030312016) e o programa científico e tecnológico de Guangzhou (201508020263). Reconhecemos com gratidão Professor Jonathan Carlson (Colorado State University) para gentilmente fornecendo os plasmideos pUCA e p7NS1-GFP e ler criticamente este manuscrito.
Materials
| Centrifuge machine | Thermo Scientific | 75004260 | |
| Centrifuge System | Beckman Coulter | 363118 | |
| GeneJET Gel Extraction Kit | Thermo Scientific | K0691 | |
| E.Z.N.A. Plasmid Midi Kit | Omega Biotech | D6904 | |
| Purified Agar | OXOID | LP0028A | |
| FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase (1 U/µL) | Thermo Scientific | EF0651 | |
| FastDigest HpaI | Thermo Scientific | FD1034 | |
| FastDigest XbaI | Thermo Scientific | FD0684 | |
| T4 DNA Ligase (5 U/µL) | Thermo Scientific | EL0011 | |
| TransStbl3 Chemically Competent Cell | Beijing Transgen Biotech | CD521-01 | |
| Ampicillin | Beijing Tiangen Biotech | RT501 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Gibco， Life Technologies | 21875109 | |
| Fetal Bovine Serum（ Australia Origin） | Gibco， Life Technologies | 10099141 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco， Life Technologies | 15070063 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen，Life Technologies | 11668019 | |
| Proteinase K | Promega | MC5008 | |
| DNase I (RNase-free) | Invitrogen，Life Technologies | AM2222 | |
| SuperReal PreMix Plus (SYBR Green) | Beijing Tiangen Biotech | FP205 |
Referências
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