Verwendung von einem rekombinanten Moskito Densovirus als gen Lieferung Vektor für die funktionelle Analyse von Genen in Mückenlarven
Summary
Wir berichten mit einer künstlichen intronischen kleine RNA Ausdruck Strategie, um eine mangelfreie rekombinante Aedes Aegypti Densovirus (AaeDV) in Vivo -Delivery-System zu entwickeln. Eine detaillierte Anleitung für den Bau, die Verpackung und die Quantitative Analyse der rAaeDV Vektoren sowie für Larven Infektion wird beschrieben.
Abstract
In Vivo Mikroinjektion ist die am häufigsten verwendeten Gen Übertragung Technik für die Analyse der Genfunktionen in einzelne Mücken. Allerdings ist diese Methode erfordert eine technisch anspruchsvollere Betrieb und beinhaltet komplizierte Verfahren, besonders beim Einsatz in Larven aufgrund ihrer geringen Größe, relativ dünne und empfindliche Nagelhaut und hohe Sterblichkeit, die ihre Anwendung einschränken. Im Gegensatz dazu wurden virale Vektoren für gen-Lieferung entwickelt, um die extrazelluläre und intrazelluläre Barrieren zu überwinden. Diese Systeme haben den Vorteil der einfache Handhabung, hohe gen Transduktion Effizienz, langfristige Erhaltung der Genexpression und die Fähigkeit, dauerhafte Effekte in Vivozu produzieren. Moskito-Densoviruses (MDVs) sind Moskito-spezifische, kleine einzelsträngigen DNA-Viren, die effektiv ausländische Nukleinsäuren in Mücke Zellen liefern können; den Ersatz oder die Einfügung von Fremdgenen rekombinante Viren erstellen in der Regel verursacht jedoch einen Verlust von Verpackung und/oder Replikation Fähigkeiten, der ein Hindernis für die Entwicklung dieser Viren als Vektoren der Lieferung ist.
Hier berichten wir mit einer künstlichen intronischen kleine RNA-Ausdruck-Strategie, um eine mangelfreie rekombinante Aedes Aegypti Densovirus (AaeDV) in Vivo -Delivery-System zu entwickeln. Modalitäten für den Bau, die Verpackung und die Quantitative Analyse der rAaeDV Vektoren und Larven Infektion werden beschrieben.
Diese Studie zeigt zum ersten Mal die Möglichkeit der Entwicklung eines mangelfreien rekombinante MDV micro RNA (MiRNA) Ausdruck, und so bietet ein leistungsfähiges Werkzeug für die funktionelle Analyse von Genen in Mücke und eine Grundlage für die Anwendung des viralen Paratransgenesis zur Steuerung von Moskitos übertragenen Krankheiten. Wir gezeigt, dass Aedes Albopictus 1St Instar Larven infiziert sein könnte durch die Einführung des Virus in den Wasserkörper der Larven Zucht Website einfach und effektiv und entwickelte rAaeDVs verwendet werden könnte, um overexpress oder niederzuschlagen die Ausdruck eines bestimmten Ziel-Gens in Larven, und ein Tool für die funktionelle Analyse von Moskito Gene anbieten.
Introduction
Moskitos übertragenen Krankheiten wie Malaria, Dengue-Fieber, Zika-Fieber und Gelbfieber, sind große internationale öffentliche Gesundheitsprobleme, die weiterhin ein beträchtlicher Teil des globalen Infektionskrankheit Last1,2ausmachen. Herkömmliche Insektizide, die als Reaktion auf Vektoren verwendet wurden, sind ein wichtiger Bestandteil des nachhaltigen integrierten Moskito Regelstrategie für die Prävention von Moskitos übertragenen Krankheiten. Aber erwiesen solche Strategien sich als relativ unwirksam oder nicht wünschenswert aufgrund der damit verbundenen negativen Umweltauswirkungen sowie die Entwicklung von Resistenzen in Mücke Bevölkerung3,4. Aus diesen Gründen gibt es ein dringender Bedarf an alternativen Methoden der Mücke, Kontrolle und die Verwendung von transgenen Methoden, sterile männliche Mücken zu produzieren und die Freigabe der Erreger resistent Mücken entstanden als viel versprechende neue Bekämpfungsstrategien. Entwickeln wirksame neue control-Methoden, wie sichere und wirksame Ansätze zur in-Vivo -gen Lieferung, die umfassende Analyse der Genfunktion Moskito ist erforderlich.
Direkte Mikroinjektion von Plasmid DNA, doppelte stranded RNA (DsRNA) oder kleine interferierende RNA (SiRNA) ist die am häufigsten verwendeten in Vivo gen Übermittlungsmethode in Mücken. In der Tat die Herstellung transgener Linien von Mücken noch verlassen sich auf einen Prozess der Embryo Mikroinjektion5,6,7. Mikroinjektion hat jedoch einige Einschränkungen. Zuerst, diese Technik ist technisch anspruchsvoll und komplizierte Verfahren beinhaltet. Zweitens verursacht Injektion eine körperliche Beleidigung des Embryos, Larven, Puppen und Erwachsenen, die direkten Einfluss auf die Lebensfähigkeit des Zielorganismus. Drittens ist es schwierig, Mückenlarven für die Mikroinjektion zu immobilisieren, weil die meisten in einem aquatischen Lebensraum leben und besitzen eine charakteristische Bewegung zappelt. Viertens ist die Größe der 1St-2Nd Instar Larven 10 bis 20 Mal kleiner als die 4th Instar und älteren Larven und die Nagelhaut der erstere empfindlicher sind. Diese Funktionen machen es schwierig, 1St-2Nd Instar Larven im Vergleich zu denen in älteren Stadien zu manipulieren. Kombiniert, tragen diese Faktoren zu einer reduzierten nach der Injektion Überlebensrate für Larven (ca. 5 %) im Vergleich zu Erwachsenen8. Viral-basierte Systeme wurden entwickelt, um die damit verbundenen extrazellulären und intrazellulären Barrieren zu überwinden. Diese Systeme haben den Vorteil der einfachen Handhabung, hohe Transduktion Effizienz, langfristige und stabile Ebenen des Ausdrucks und die Fähigkeit, dauerhafte Effekte in Vivozu produzieren. Daher verwendet gen, die Nutzung der Retroviren, Lentiviren und Adenoviren-Delivery-Systeme weit verbreitet gewesen sein Inmammalian Zelllinien und Modell-Arten. Sindbis Virus Expressionssystems hatte früher die Genfunktion in der Erwachsenmoskito zu analysieren; Neben der biologischen Sicherheit Bedenken ist die Injektion noch ein notwendiger Prozess für virale Infektion9. Obwohl die mündlichen Lieferung durch Larven in der DsRNA-Lösung einweichen vorher als möglich Lieferung Methode berichtet worden ist, ist es für kleine RNA Funktion Analyse10ungeeignet. Also, müssen wirksame virale Liefermethoden für Mücken noch entwickelt werden.
Moskito-Densoviruses (MDVs) sind Teil der Unterfamilie Densovirinae Parvoviridaeund alle außer einem Fall innerhalb der Gattung Brevidensovirus11. MDV Virionen sind unbehüllte und bestehen aus einem Genom einzelsträngiger DNA (SsDNA) und einem ikosaedrischen Kapsid (20 nm im Durchmesser). Das virale Genom ist etwa 4 kb groß und wird in den Kernen der Wirtszellen repliziert. MDVs sind relativ stabil in der Umgebung und zeigen einen schmalen Wirtsspektrums mit hoher Spezifität für Moskitos. Diese Viren haben das Potenzial, zu verbreiten und natürlich in Moskito-Populationen bestehen und fast allen Organen und Geweben von diesen Insekten, darunter den Mitteldarm Malpighian Tubuli, fetten Körper, Muskulatur, Neuronen und Speicheldrüsen12eindringen können.
Intakte MDV Genome können in Plasmid-Vektoren, Plasmid-basierte infektiöse Klone produzieren subcloned; Wenn diese Klone in Mücke Zellen geliefert werden, das virale Genom wird gewonnen aus dem Plasmid-Vektor und infektiöse Viruspartikel produziert. Da MDV eine kleine SsDNA Genom hat, kann infektiöse Klone sind leicht gebaut und das virale Genom leicht manipulierbar11,13. Diese Eigenschaften machen MDV ein wertvolles Mittel für die Prüfung von Moskito-Biologie. Da fast alle das virale Genom-Sequenz ist unerlässlich für die virale Verbreitung, die Schaffung von rekombinanten Virus durch den Ersatz oder Einbau von fremden Genen verursacht jedoch einen Verlust in virale Verpackung und/oder Replikation Fähigkeiten schafft eine Hindernis für die Entwicklung der MDVs gen Lieferung Vektoren. Hier berichten wir mit einer künstlichen intronischen kleine RNA-Ausdruck-Strategie eine mangelfreie rAaeDV in Vivo RNA-Delivery-System zu entwickeln, die hat die Vorteile der einfachen Plasmid Bau und die Wartung eines funktionalen Virus, die produzieren kann stabile und langfristige Ausdruck in Wirtszellen ohne die Notwendigkeit der Wildtyp Virus. Darüber hinaus ermöglicht diese Methode für die einfache Transduktion von Larven.
Die Protokolle für die folgenden Schritte werden in dieser Studie beschrieben: (1) Design der Codierung eine intronischen kleine RNA Expressionskassette, 2) die Produktion von rekombinanten Virus-Partikel mit der Verpackung Zelle C6/36 rAaeDVs Linie, Quantitative Analyse (3) der zellfreien rAaeDV Genom kopieren Zahlen und 4) Infektion von Ae. Albopictus Larven durch direkte Einschleppung des Virus in den Wasserkörper des larvalen Lebensraums. Insgesamt zeigte diese Arbeit, dass bestimmten kleinen RNAs oder Zielgene überexprimiert oder klopfte in Mückenlarven mit den entwickelten MDV-Delivery-System.
Protocol
Representative Results
Discussion
Es ist wichtig, zwei der wichtigsten Hindernisse zu überwinden, die rAaeDV Konstruktion zu begrenzen. Die erste ist die Produktion von defekten rekombinanten Virus. Es wurde berichtet, dass MDV als ein Vektor angemessen zum Ausdruck bringen fremde Gene, wie Skorpion Insekt-spezifische neurotoxins20 und das GFP-Protein Größe verwendet werden kann; aber unabhängig von der Aufbau-Strategie, können nicht sobald die ORFs MDV eingefügt oder mit exogenen Gene ersetzt Virionen selbständig bilden, wenn ein Helfer Plasmid c…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren erkennen finanziellen Unterstützung von National Key Research and Development Program of China (2016YFC1200500, Xiao Guang Chen), der National Natural Science Foundation of China (81672054 und 81371846), das Team Forschungsprogramm des natürlichen Science Foundation von Guangdong (2014A030312016), und die wissenschaftliche und technologische Programm von Guangzhou (201508020263). Wir erkennen dankbar Professor Jonathan Carlson (Colorado State University) für freundlicherweise die pUCA und p7NS1-GFP Plasmide und kritisch lesen dieses Manuskript.
Materials
| Centrifuge machine | Thermo Scientific | 75004260 | |
| Centrifuge System | Beckman Coulter | 363118 | |
| GeneJET Gel Extraction Kit | Thermo Scientific | K0691 | |
| E.Z.N.A. Plasmid Midi Kit | Omega Biotech | D6904 | |
| Purified Agar | OXOID | LP0028A | |
| FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase (1 U/µL) | Thermo Scientific | EF0651 | |
| FastDigest HpaI | Thermo Scientific | FD1034 | |
| FastDigest XbaI | Thermo Scientific | FD0684 | |
| T4 DNA Ligase (5 U/µL) | Thermo Scientific | EL0011 | |
| TransStbl3 Chemically Competent Cell | Beijing Transgen Biotech | CD521-01 | |
| Ampicillin | Beijing Tiangen Biotech | RT501 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Gibco， Life Technologies | 21875109 | |
| Fetal Bovine Serum（ Australia Origin） | Gibco， Life Technologies | 10099141 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco， Life Technologies | 15070063 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen，Life Technologies | 11668019 | |
| Proteinase K | Promega | MC5008 | |
| DNase I (RNase-free) | Invitrogen，Life Technologies | AM2222 | |
| SuperReal PreMix Plus (SYBR Green) | Beijing Tiangen Biotech | FP205 |
Referências
- Tolle, M. A. Mosquito-borne diseases. Current problems in pediatric and adolescent health care. 39, 97-140 (2009).
- Petersen, L. R., Jamieson, D. J., Powers, A. M., Honein, M. A. Zika Virus. The New England journal of medicine. 374, 1552-1563 (2016).
- Roberts, D. R., Andre, R. G. Insecticide resistance issues in vector-borne disease control. The American journal of tropical medicine and hygiene. 50, 21-34 (1994).
- Attaran, A., Roberts, D. R., Curtis, C. F., Kilama, W. L. Balancing risks on the backs of the poor. Nature medicine. 6, 729-731 (2000).
- Volohonsky, G., et al. Transgenic Expression of the Anti-parasitic Factor TEP1 in the Malaria Mosquito Anopheles gambiae. PLoS pathogens. 13, 1006113 (2017).
- Galizi, R., et al. A synthetic sex ratio distortion system for the control of the human malaria mosquito. Nature communications. 5, 3977 (2014).
- Bourtzis, K., Lees, R. S., Hendrichs, J., Vreysen, M. J. More than one rabbit out of the hat: Radiation, transgenic and symbiont-based approaches for sustainable management of mosquito and tsetse fly populations. Acta tropica. 157, 115-130 (2016).
- Kumar, S. S., Puttaraju, H. P. Improvised microinjection technique for mosquito vectors. The Indian journal of medical research. 136, 971-978 (2012).
- Attardo, G. M., Higgs, S., Klingler, K. A., Vanlandingham, D. L., Raikhel, A. S. RNA interference-mediated knockdown of a GATA factor reveals a link to anautogeny in the mosquito Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 13374-13379 (2003).
- Singh, A. D., Wong, S., Ryan, C. P., Whyard, S. Oral delivery of double-stranded RNA in larvae of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti: implications for pest mosquito control. Journal of insect science. 13, 69 (2013).
- Ward, T. W., et al. Aedes aegypti transducing densovirus pathogenesis and expression in Aedes aegypti and Anopheles gambiae larvae. Insect molecular biology. 10, 397-405 (2001).
- Carlson, J., Suchman, E., Buchatsky, L. Densoviruses for control and genetic manipulation of mosquitoes. Advances in virus research. 68, 361-392 (2006).
- Barreau, C., Jousset, F. X., Bergoin, M. Pathogenicity of the Aedes albopictus parvovirus (AaPV), a denso-like virus, for Aedes aegypti mosquitoes. Journal of invertebrate pathology. 68, 299-309 (1996).
- Liu, P., et al. Development of non-defective recombinant densovirus vectors for microRNA delivery in the invasive vector mosquito, Aedes albopictus. Scientific reports. 6, 20979 (2016).
- Ortega, M. M., Bouamar, H. Guidelines on Designing MicroRNA Sponges: From Construction to Stable Cell Line. Methods in molecular biology. 1509, 221-233 (2017).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. Journal of visualized experiments : JoVE. , e253 (2007).
- Afanasiev, B. N., Kozlov, Y. V., Carlson, J. O., Beaty, B. J. Densovirus of Aedes aegypti as an expression vector in mosquito cells. Experimental parasitology. 79, 322-339 (1994).
- Hu, H. Y., et al. Evolution of the human-specific microRNA miR-941. Nature communications. 3, 1145 (2012).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74, 5463-5467 (1977).
- Dalby, B., et al. Advanced transfection with Lipofectamine 2000 reagent: primary neurons, siRNA, and high-throughput applications. Methods (San Diego, Calif). 33, 95-103 (2004).
- Gu, J. B., Dong, Y. Q., Peng, H. J., Chen, X. G. A recombinant AeDNA containing the insect-specific toxin, BmK IT1, displayed an increasing pathogenicity on Aedes albopictus. The American journal of tropical medicine and hygiene. 83, 614-623 (2010).
- Hou, Y., Zhang, H., Miranda, L., Lin, S. Serious overestimation in quantitative PCR by circular (supercoiled) plasmid standard: microalgal pcna as the model gene. PloS one. 5, 9545 (2010).
- Ding, J., et al. Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2016).
