Utilisation d’un moustique Recombinant Densovirus comme un vecteur de livraison de gène pour l’analyse fonctionnelle des gènes chez les larves de moustiques
Summary
Nous rapportons en utilisant une artificiel intronic petit RNA expression stratégie à élaborer un recombinant non défectueux densovirus (AaeDV) Aedes aegypti in vivo système de livraison. Une procédure détaillée pour la construction, emballage et l’analyse quantitative des vecteurs rAaeDV aussi bien en ce qui concerne l’infection larvaire est décrite.
Abstract
In vivo microinjection est la technique de transfert de gène plus couramment utilisés pour analyser la fonction des gènes chez les moustiques individuels. Toutefois, cette méthode requiert une plus techniquement difficile opération et implique des procédures compliquées, surtout lorsqu’il est utilisé chez les larves en raison de leur petite taille, cuticule relativement mince et fragile et une mortalité élevée, qui limite son application. En revanche, les vecteurs viraux pour la livraison de gène ont été développés afin de surmonter les obstacles extracellulaires et intracellulaires. Ces systèmes présentent les avantages de manipulation facile, efficacité de transduction génétique élevée, maintien à long terme de l’expression génique et la capacité de produire des effets persistants en vivo. Mosquito densoviruses (FDM) sont spécifiques à moustique, petits virus à ADN simple brin qui peuvent efficacement des étrangers d’acides nucléiques dans des cellules de moustique ; Toutefois, le remplacement ou l’insertion de gènes étrangers à créer des virus recombinants en général entraîne une perte des capacités de conditionnement et/ou de la réplication, qui est un obstacle au développement de ces virus comme vecteurs de livraison.
Nous rapportons ici, en utilisant une stratégie artificielle intronic petits ARN expression d’élaborer un recombinant non défectueux densovirus (AaeDV) Aedes aegypti in vivo système de livraison. Procédures détaillées pour la construction, l’emballage et l’analyse quantitative des vecteurs rAaeDV et d’infection larvaire sont décrites.
Cette étude démontre, pour la première fois, la faisabilité de mettre au point un non défectueux recombinant MDV micro RNA (miRNA) expression système, fournissant un outil puissant pour l’analyse fonctionnelle des gènes chez les moustiques et établir une base pour la demande de paratransgenesis virale pour contrôler les maladies transmises par les moustiques. Nous avons démontré Aedes albopictus 1st larvaire pourrait s’infecter facilement et efficacement en introduisant le virus dans le plan d’eau des larves site de reproduction et que les rAaeDVs développés pourraient servir à surexpriment ou abattre le expression d’un gène cible spécifique chez les larves, fournissant un outil pour l’analyse fonctionnelle des moustiques de gènes.
Introduction
Maladies transmises par les moustiques comme le paludisme, dengue, fièvre zika et la fièvre jaune, sont des problèmes de santé publique international majeur qui continuent de représenter une fraction significative de la charge mondiale des maladies infectieuses1,2. Les insecticides classiques, qui ont été utilisés en réponse à des vecteurs, sont une composante majeure de la stratégie de contrôle des moustiques intégrée durable pour la prévention des maladies transmises par les moustiques. Toutefois, ces stratégies sont révélés relativement inefficaces ou indésirable en raison des impacts environnementaux négatifs associés ainsi que l’évolution des résistances dans les populations de moustiques3,4. Pour ces raisons, il y a un besoin urgent pour des méthodes alternatives de moustique control et l’utilisation de méthodes transgéniques pour produire des moustiques mâles stériles et la libération de moustiques résistant aux agents pathogènes sont apparus comme prometteuses nouvelles stratégies de contrôle. Pour développer apparente nouveau contrôler méthodes, tels que des approches sécuritaires et efficaces pour in vivo la livraison de gène, l’analyse globale de la fonction du gène moustique est nécessaire.
Microinjection directe du plasmide ADN, double stranded RNA (dsRNA) ou petits ARN interférents (siARN) est la plus couramment utilisé en vivo gène méthode de livraison chez les moustiques. En fait, la production de souches transgéniques de moustiques dépendent encore un processus d’embryon microinjection5,6,7. Toutefois, la microinjection présente plusieurs limites. Tout d’abord, cette technique est techniquement difficile et implique des procédures compliquées. Deuxièmement, l’injection provoque une agression physique à l’embryon, larves, nymphes et adultes, qui affecte directement la viabilité de l’organisme cible. En troisième lieu, il est difficile immobiliser les larves de moustiques pour microinjection parce que la plupart vivent dans un habitat aquatique et possède une caractéristique se tortillant de mouvement. Quatrièmement, la taille de 1m-2ème stade larvaire est 10 – 20 fois plus petit que celui de la 4ème stade larvaire et larves plus âgées et les cuticules du premier sont plus délicats. Ces caractéristiques, il est difficile de manipuler 1st-2ème stade larvaire par rapport à ceux des stades plus âgés. Combinés, ces facteurs contribuent à un taux de réduction de la survie après l’injection de larves (environ 5 %) par rapport aux adultes8. Base virale livraison systèmes ont été développés afin de surmonter les obstacles extracellulaires et intracellulaires associés. Ces systèmes présentent les avantages de manipulation facile, efficacité élevée de transduction, solides et à long terme des niveaux d’expression et la capacité de produire des effets persistants en vivo. Par conséquent, gène vecteurs utilisant des rétrovirus, lentivirus et adénovirus ont été largement utilisé les lignées inmammalian et espèces modèles. Le système d’expression virus de Sindbis avait été précédemment utilisé pour analyser la fonction du gène dans le moustique adulte ; Outre les préoccupations de sécurité biologique, cependant, l’injection est toujours un processus nécessaire pour infection virale9. Même si, à l’administration orale en trempant des larves dans la solution de dsRNA a été signalée auparavant comme un mode de livraison possible, il ne convient pas pour petits RNA fonction analyse10. Ainsi, méthodes de livraison viral efficace encore il faut développer pour les moustiques.
Mosquito densoviruses (FDM) font partie de la sous-famille des Densovirinae des Parvoviridaeet tous sauf un automne au sein du genre Brevidensovirus11. MDV virions sont non enveloppés et se composent d’un génome d’ADN (ADN simple brin) simple brin et une capside icosaédrique (20 nm de diamètre). Le génome viral est d’environ 4 Ko de taille et est répliqué dans les noyaux des cellules de l’hôte. FDM est relativement stables dans l’environnement et présentent une gamme d’hôtes étroite spécificité élevée pour les moustiques. Ces virus sont susceptibles de se propager et persister naturellement dans les populations de moustiques et peuvent envahir la quasi-totalité des organes et des tissus de ces insectes, y compris l’intestin moyen, Malpighi tubules, corps gras, musculature, neurones et glandes salivaires12.
Les génomes MDV intacts peuvent être subcloned dans des vecteurs de plasmide pour produire des clones infectieux axée sur le plasmide ; Lorsque ces clones sont livrés dans des cellules de moustique, le génome viral est extraite du vecteur plasmidique, et des particules virales infectieuses sont produites. MDV ayant un génome d’ADN simple brin petite, clones infectieux sont facilement construits et le génome viral peut être facilement manipulables11,13. Ces caractéristiques rendent MDV un agent précieux pour l’examen de biologie de moustique. Cependant, parce que la quasi-totalité de la séquence du génome viral est essentielle à la prolifération virale, la création de virus recombinants par le remplacement ou l’insertion de gènes étrangers entraîne une perte dans les capacités de conditionnement et/ou de la réplication virales, qui crée une barrière pour le développement de FDM comme vecteurs de livraison de gène. Ici, nous rapportons en utilisant une stratégie artificielle intronic expression de petits ARN pour développer un rAaeDV non défectueux en vivo RNA livraison système qui possède les avantages de la construction plasmidique facile et l’entretien d’un virus fonctionnel qui peut produire expression stable et à long terme dans les cellules de l’hôte sans la nécessité pour le virus de type sauvage. De plus, cette méthode permet la transduction facile des larves.
Les protocoles pour les étapes suivantes sont décrites dans la présente étude : line 1) conception de rAaeDVs codant une cassette d’expression de petits ARN intronic, 2) la production de particules de virus recombinant à emballage de la cellule C6/36, 3) l’analyse quantitative d’acellulaire rAaeDV génome copier numéros et 4) infection des larves Ae. albopictus par incorporation directe du virus dans le plan d’eau de l’habitat larvaire. Dans l’ensemble, ces travaux ont démontré que des petits ARN ou des gènes de cible peuvent être surexprimés ou renversées dans les larves de moustiques en utilisant le système de livraison MDV développé.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il est important de surmonter deux des principaux obstacles qui limitent la construction rAaeDV. La première est la production de virus recombinant défectueux. Il a été rapporté que MDV peut être utilisé comme un vecteur d’exprimer convenablement taille des gènes étrangers, tels que scorpion insecte spécifique neurotoxins20 et la protéine GFP ; Cependant, quelle que soit la stratégie de construction, une fois que l’ORF de MDV sont insérés ou remplacé par un gène exogène, virions ne peuvent pas forme…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs reconnaissent l’appui financier du National Key Research and Development Programme of China (2016YFC1200500 à Chen Xiao-Guang), la Fondation nationale sciences naturelles de Chine (81672054 et 81371846), le Programme de l’équipe de recherche du naturel Fondation des sciences de Guangdong (2014A030312016) et le Programme scientifique et technologique de Guangzhou (201508020263). Nous remercions sincèrement professeur Jonathan Carlson (Colorado State University) pour aimablement les plasmides pUCA et p7NS1-GFP et pour la lecture critique de ce manuscrit.
Materials
| Centrifuge machine | Thermo Scientific | 75004260 | |
| Centrifuge System | Beckman Coulter | 363118 | |
| GeneJET Gel Extraction Kit | Thermo Scientific | K0691 | |
| E.Z.N.A. Plasmid Midi Kit | Omega Biotech | D6904 | |
| Purified Agar | OXOID | LP0028A | |
| FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase (1 U/µL) | Thermo Scientific | EF0651 | |
| FastDigest HpaI | Thermo Scientific | FD1034 | |
| FastDigest XbaI | Thermo Scientific | FD0684 | |
| T4 DNA Ligase (5 U/µL) | Thermo Scientific | EL0011 | |
| TransStbl3 Chemically Competent Cell | Beijing Transgen Biotech | CD521-01 | |
| Ampicillin | Beijing Tiangen Biotech | RT501 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Gibco， Life Technologies | 21875109 | |
| Fetal Bovine Serum（ Australia Origin） | Gibco， Life Technologies | 10099141 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco， Life Technologies | 15070063 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen，Life Technologies | 11668019 | |
| Proteinase K | Promega | MC5008 | |
| DNase I (RNase-free) | Invitrogen，Life Technologies | AM2222 | |
| SuperReal PreMix Plus (SYBR Green) | Beijing Tiangen Biotech | FP205 |
Referências
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