Gebruik van een Recombinant Mosquito Densovirus als een gen levering Vector voor de functionele analyse van genen in muggenlarven
Summary
Wij rapporteren met behulp van een kunstmatige intronic kleine RNA expressie strategie te ontwikkelen van een niet-defecte recombinant Aedes aegypti densovirus (AaeDV) in vivo uitvoeringssysteem. Een gedetailleerde procedure voor de bouw, de verpakking en de kwantitatieve analyse van de rAaeDV vectoren evenals wat larvale infectie wordt beschreven.
Abstract
In vivo microinjection is de meest gebruikte gene transfer techniek voor het analyseren van de functies van de gene in individuele muggen. Echter, deze methode vereist een meer technisch veeleisende operatie en impliceert ingewikkelde procedures, vooral wanneer gebruikt in larven als gevolg van hun geringe omvang, relatief dunne en breekbare cuticula en hoge mortaliteit, die de toepassing ervan te beperken. Daarentegen zijn virale vectoren voor gene levering ontwikkeld om te overwinnen van extracellulaire en intracellulaire belemmeringen. Deze systemen hebben de voordelen van gemakkelijke manipulatie, hoge gene transductie efficiëntie, onderhoud op lange termijn van genexpressie en de mogelijkheid tot blijvende effecten in vivo. Mosquito densoviruses (MDVs) zijn mug-specifieke, kleine single-stranded DNA virussen die effectief buitenlandse nucleic zuren in mug cellen leveren kunnen; de vervanging of het inbrengen van vreemde genen maken recombinante virussen meestal veroorzaakt echter een verlies van de capaciteiten van de verpakking en/of replicatie, die een belemmering voor de ontwikkeling van deze virussen als levering vectoren vormt.
Hierin, rapporteren we met behulp van een kunstmatige intronic kleine-RNA expressie-strategie te ontwikkelen van een niet-defecte recombinant Aedes aegypti densovirus (AaeDV) in vivo uitvoeringssysteem. Gedetailleerde procedures voor de bouw, de verpakking en de kwantitatieve analyse van de vectoren rAaeDV en larvale infectie worden beschreven.
Deze studie toont aan, voor de eerste keer, de haalbaarheid van de ontwikkeling van een niet-defecte recombinante MDV micro RNA (miRNA) expressie systeem, aldus verschaft een krachtig hulpmiddel voor de functionele analyse van genen in de mug en tot oprichting van een basis voor de toepassing van virale paratransgenesis voor het beheersen van muggen overgebrachte ziekten. Wij laten zien dat Aedes albopictus 1st instar-larven worden eenvoudig en effectief besmet kunnen door de introductie van het virus in het waterlichaam van de larven site fokken en dat de ontwikkelde rAaeDVs kan worden gebruikt om overexpress of neerhalen de expressie van een specifiek streefcijfer gen in larven, die een hulpmiddel voor de functionele analyse van muggen genen.
Introduction
Muggen overgebrachte ziekten zoals malaria, knokkelkoorts, zika koorts en gele koorts, zijn grote internationale volksgezondheidsproblemen die blijven ter verantwoording voor een belangrijke fractie van de mondiale infectieziekte last1,2. Conventionele insecticiden, die in reactie op vectoren zijn gebruikt, zijn een belangrijk onderdeel van duurzame geïntegreerde mug strategie voor toegangsbeheer voor de preventie van muggen overgebrachte ziekten. Echter, dergelijke strategieën hebben bewezen relatief inefficiënt of ongewenste als gevolg van de bijbehorende negatieve milieueffecten, alsmede de ontwikkeling van resistentie bij mug populaties3,4. Om deze redenen is er dringend behoefte aan alternatieve methoden van mug, controle, en het gebruik van transgene methoden voor de productie van steriele mannelijke muggen en de vrijlating van de pathogeen-resistente muggen hebben voorgedaan als veelbelovende nieuwe bestrijdingsstrategieën. Om controle effectieve nieuwe methoden, zoals veilige en effectieve methoden voor in vivo gene levering, de uitgebreide analyse van de genfunctie mug is vereist.
Directe microinjection van plasmide DNA, dubbele stranded RNA (dsRNA) of Klein Mengend RNA (siRNA) is de meest gebruikte in vivo gene leveringsmethode in muggen. In feite, de productie van transgene variëteiten van muggen nog steeds rekenen op een proces van embryo microinjection5,6,7. Microinjection heeft echter verschillende beperkingen. Ten eerste, deze techniek is technisch veeleisende en impliceert ingewikkelde procedures. Ten tweede veroorzaakt injectie een fysieke belediging van het embryo, larven, poppen en volwassen, die rechtstreeks van invloed op de levensvatbaarheid van het doelorganisme. Ten derde is het moeilijk om te immobiliseren muggenlarven voor microinjection, omdat de meeste in een aquatische habitats leven en bezitten een karakteristiek kronkelende beweging. Ten vierde, de grootte van 1st-2nd instar-larven is 10 – aan 20 keer kleiner dan die van 4th instar en oudere larven en de nagelriemen van de voormalige gevoeliger zijn. Deze functies maken het moeilijk om te manipuleren 1st-2nd instar-larven in vergelijking met oudere stadia. Gecombineerd, deze factoren dragen bij aan een verminderde na injectie overlevingspercentage voor larven (ongeveer 5%) in vergelijking met volwassenen8. Viral gebaseerde levering systemen zijn ontwikkeld om de bijbehorende extracellulaire en intracellulaire belemmeringen. Deze systemen hebben de voordelen van gemakkelijke manipulatie, hoge transductie efficiëntie, langdurige en robuuste niveaus van meningsuiting, en het vermogen te produceren permanente effecten in vivo. Daarom gebruikt de gene levering systemen met behulp van de retrovirussen, lentivirussen en adenovirussen wijd zijn inmammalian cellijnen en model soorten. Het Sindbis virale expressie systeem had eerder is gebruikt voor het analyseren van de genfunctie in de volwassen mug; Naast de bioveiligheid zorgen is de injectie echter nog steeds een noodzakelijk proces voor virale infectie9. Hoewel, de mondelinge levering door inweken larven in de dsRNA oplossing is eerder gemeld als een haalbaar leveringsmethode, is het niet geschikt voor kleine RNA functie-analyse10. Effectieve virale afleveringsmethoden moeten dus nog worden ontwikkeld voor muggen.
Mosquito densoviruses (MDVs) behoren tot de onderfamilie Densovirinae van Parvoviridae, en alle maar één vallen onder het geslacht Brevidensovirus11. MDV virionen zijn niet-gehuld en bestaan uit een genoom van single-stranded DNA (ssDNA) en een icosahedrale Eiwitmantel (20 nm diameter). Het virale genoom is ongeveer 4 kb in grootte en wordt gerepliceerd binnen de kernen van cellen van de gastheer. MDVs zijn relatief stabiel in de omgeving en een smalle host bereik weergeven met hoge specificiteit voor muggen. Deze virussen hebben het potentieel om te verspreiden en blijven natuurlijk mug populaties en bijna alle organen en weefsels van deze insecten, met inbegrip van de middendarm, Malpighian tubuli vet lichamelijk, de daaraan gehechte spiermassa, neuronen en speekselklieren12kunnen binnenvallen.
Intact MDV genomen kunnen worden subcloned in plasmide vectoren te produceren plasmide gebaseerde besmettelijke klonen; Wanneer deze klonen worden afgeleverd in cellen van de mug, het virale genoom wordt gewonnen uit de plasmide vector, en besmettelijke virale deeltjes worden geproduceerd. Omdat MDV een kleine ssDNA genoom heeft, besmettelijke klonen zijn gemakkelijk gebouwd en het virale genoom kunnen gemakkelijk gemanipuleerd11,,13. Deze kenmerken maken MDV een waardevolle agent voor de behandeling van de mug biologie. Echter, omdat bijna alle van het virale genoom is essentieel voor de virale proliferatie, het scheppen van recombinante virus door vervanging of toevoeging van buitenlandse genen veroorzaakt een verlies in virale verpakking en/of replicatie capaciteiten, waardoor een belemmering voor de ontwikkeling van MDVs als gene levering vectoren. Hierin, rapporteren we met behulp van een kunstmatige intronic kleine-RNA expressie-strategie te ontwikkelen van een niet-defecte rAaeDV in vivo RNA bezorgingssysteem dat heeft de voordelen van gemakkelijke plasmide constructie en het onderhoud van een functionele virus dat kan produceren stabiele en lange termijn expressie in gastheer cellen zonder de noodzaak voor wild-type virus. Bovendien, zorgt deze methode voor het gemakkelijk transductie van larven.
De protocollen voor de volgende stappen worden beschreven in deze studie: 1) ontwerp van rAaeDVs een intronic kleine-RNA expressie cassette, 2) de productie van recombinante virusdeeltjes de cel C6/36 verpakking te gebruiken codering lijn, 3) kwantitatieve analyse van cel-vrij rAaeDV genoom kopiëren nummers, en 4) infectie van Ae. albopictus larven door directe invoering van virus in het waterlichaam van de larvale habitat. Globaal, dit werk aangetoond dat specifieke kleine RNAs doelgenen kunnen worden overexpressie of neergehaald in met behulp van het ontwikkelde MDV uitvoeringssysteem muggenlarven.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het is belangrijk om te overwinnen twee van de belangrijkste belemmeringen die de bouw van de rAaeDV beperken. De eerste is de productie van defecte recombinante virussen. Er werd gemeld dat MDV kan worden gebruikt als een vector naar behoren uitspreken buitenlandse genen, zoals scorpion insect-specifieke neurotoxins20 en het GFP-eiwit middelgrote; maar ongeacht de bouw strategie, kunnen niet zodra de ORFs van MDV worden ingevoegd of door exogene genen vervangen, virionen vormen onafhankelijk tenzij een helper plasmide i…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs erkennen financiële steun van de nationale sleutel onderzoek en ontwikkeling programma van China (2016YFC1200500 aan Xiao-Guang Chen), de nationale Natural Science Foundation van China (81672054 en 81371846), het onderzoeksprogramma van het Team van de natuurlijke Science Foundation van Guangdong (2014A030312016), en de wetenschappelijke en technologische programma van Guangzhou (201508020263). Wij erkennen dankbaar Professor Jonathan Carlson (Colorado State University) voor het vriendelijk verstrekken de pUCA en p7NS1-GFP plasmiden en voor het kritisch lezen van dit manuscript.
Materials
| Centrifuge machine | Thermo Scientific | 75004260 | |
| Centrifuge System | Beckman Coulter | 363118 | |
| GeneJET Gel Extraction Kit | Thermo Scientific | K0691 | |
| E.Z.N.A. Plasmid Midi Kit | Omega Biotech | D6904 | |
| Purified Agar | OXOID | LP0028A | |
| FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase (1 U/µL) | Thermo Scientific | EF0651 | |
| FastDigest HpaI | Thermo Scientific | FD1034 | |
| FastDigest XbaI | Thermo Scientific | FD0684 | |
| T4 DNA Ligase (5 U/µL) | Thermo Scientific | EL0011 | |
| TransStbl3 Chemically Competent Cell | Beijing Transgen Biotech | CD521-01 | |
| Ampicillin | Beijing Tiangen Biotech | RT501 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Gibco， Life Technologies | 21875109 | |
| Fetal Bovine Serum（ Australia Origin） | Gibco， Life Technologies | 10099141 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco， Life Technologies | 15070063 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen，Life Technologies | 11668019 | |
| Proteinase K | Promega | MC5008 | |
| DNase I (RNase-free) | Invitrogen，Life Technologies | AM2222 | |
| SuperReal PreMix Plus (SYBR Green) | Beijing Tiangen Biotech | FP205 |
Referências
- Tolle, M. A. Mosquito-borne diseases. Current problems in pediatric and adolescent health care. 39, 97-140 (2009).
- Petersen, L. R., Jamieson, D. J., Powers, A. M., Honein, M. A. Zika Virus. The New England journal of medicine. 374, 1552-1563 (2016).
- Roberts, D. R., Andre, R. G. Insecticide resistance issues in vector-borne disease control. The American journal of tropical medicine and hygiene. 50, 21-34 (1994).
- Attaran, A., Roberts, D. R., Curtis, C. F., Kilama, W. L. Balancing risks on the backs of the poor. Nature medicine. 6, 729-731 (2000).
- Volohonsky, G., et al. Transgenic Expression of the Anti-parasitic Factor TEP1 in the Malaria Mosquito Anopheles gambiae. PLoS pathogens. 13, 1006113 (2017).
- Galizi, R., et al. A synthetic sex ratio distortion system for the control of the human malaria mosquito. Nature communications. 5, 3977 (2014).
- Bourtzis, K., Lees, R. S., Hendrichs, J., Vreysen, M. J. More than one rabbit out of the hat: Radiation, transgenic and symbiont-based approaches for sustainable management of mosquito and tsetse fly populations. Acta tropica. 157, 115-130 (2016).
- Kumar, S. S., Puttaraju, H. P. Improvised microinjection technique for mosquito vectors. The Indian journal of medical research. 136, 971-978 (2012).
- Attardo, G. M., Higgs, S., Klingler, K. A., Vanlandingham, D. L., Raikhel, A. S. RNA interference-mediated knockdown of a GATA factor reveals a link to anautogeny in the mosquito Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 13374-13379 (2003).
- Singh, A. D., Wong, S., Ryan, C. P., Whyard, S. Oral delivery of double-stranded RNA in larvae of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti: implications for pest mosquito control. Journal of insect science. 13, 69 (2013).
- Ward, T. W., et al. Aedes aegypti transducing densovirus pathogenesis and expression in Aedes aegypti and Anopheles gambiae larvae. Insect molecular biology. 10, 397-405 (2001).
- Carlson, J., Suchman, E., Buchatsky, L. Densoviruses for control and genetic manipulation of mosquitoes. Advances in virus research. 68, 361-392 (2006).
- Barreau, C., Jousset, F. X., Bergoin, M. Pathogenicity of the Aedes albopictus parvovirus (AaPV), a denso-like virus, for Aedes aegypti mosquitoes. Journal of invertebrate pathology. 68, 299-309 (1996).
- Liu, P., et al. Development of non-defective recombinant densovirus vectors for microRNA delivery in the invasive vector mosquito, Aedes albopictus. Scientific reports. 6, 20979 (2016).
- Ortega, M. M., Bouamar, H. Guidelines on Designing MicroRNA Sponges: From Construction to Stable Cell Line. Methods in molecular biology. 1509, 221-233 (2017).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. Journal of visualized experiments : JoVE. , e253 (2007).
- Afanasiev, B. N., Kozlov, Y. V., Carlson, J. O., Beaty, B. J. Densovirus of Aedes aegypti as an expression vector in mosquito cells. Experimental parasitology. 79, 322-339 (1994).
- Hu, H. Y., et al. Evolution of the human-specific microRNA miR-941. Nature communications. 3, 1145 (2012).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74, 5463-5467 (1977).
- Dalby, B., et al. Advanced transfection with Lipofectamine 2000 reagent: primary neurons, siRNA, and high-throughput applications. Methods (San Diego, Calif). 33, 95-103 (2004).
- Gu, J. B., Dong, Y. Q., Peng, H. J., Chen, X. G. A recombinant AeDNA containing the insect-specific toxin, BmK IT1, displayed an increasing pathogenicity on Aedes albopictus. The American journal of tropical medicine and hygiene. 83, 614-623 (2010).
- Hou, Y., Zhang, H., Miranda, L., Lin, S. Serious overestimation in quantitative PCR by circular (supercoiled) plasmid standard: microalgal pcna as the model gene. PloS one. 5, 9545 (2010).
- Ding, J., et al. Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2016).
