蚊幼虫における遺伝子の機能解析の遺伝子配達ベクトルとして組換え蚊 Densovirus を使用
Summary
良品組換えネッタイシマカdensovirus (AaeDV)生体内での配信システムを開発する、人工イントロン小 RNA 発現戦略を使用して報告します。建設、パッケージング、および幼虫の感染に関しては同様に rAaeDV のベクトルの定量分析のための詳細な手順を説明します。
Abstract
体内のインジェクションは、個体の遺伝子の機能を解析するための最も一般的に使用される遺伝子転写法です。ただし、このメソッドはより操作を技術的に厳しいが必要ですし、小型、比較的薄く、壊れやすいキューティクル ・高い死亡率は、そのアプリケーションを制限するために幼虫に使用される場合は特に、複雑な手続きが含まれます。対照的に、遺伝子ウイルスベクターは、細胞外と細胞内の障壁を克服するため開発されています。これらのシステムは、簡単な操作、高い遺伝子導入効率、遺伝子発現、長期的な保守、生体内で永続的な効果を生成する能力の利点を持っています。蚊濃 (MDVs) が蚊に固有の小型の単一座礁させた DNA のウイルスを蚊細胞に外国の核酸を効率的に配信できます。ただし、交換または遺伝子組換えウイルスを通常作成する配信ベクトルとしてこれらのウイルスの開発への障壁である包装やレプリケーションの能力の損失が発生します。
症例人工イントロン小さな RNA 発現戦略を使用して良品組換えネッタイシマカdensovirus (AaeDV)生体内での配信システムを開発します。建設、包装、rAaeDV ベクトルの定量的解析と幼虫の感染症のための詳細な手順を示します。
本研究に留まらず、初めて、良品組換え MDV マイクロ RNA (miRNA) 式システムを開発、蚊の遺伝子の機能解析のための強力なツールを提供するのための基礎を確立、ウイルス paratransgenesis 蚊媒介疾患を制御するためのアプリケーションです。我々 は、ヒトスジシマカ1st幼虫が簡単かつ効果的に感染するサイト、幼虫の水体にウイルスを導入してとノザンまたは倒すため開発 rAaeDVs が実証、幼虫は、蚊の機能解析のツールを提供する遺伝子の特定のターゲット遺伝子の表現。
Introduction
マラリア、デング熱、ジカ熱、黄熱などの蚊媒介性疾患は、グローバル感染症負担1,2のかなりの割合を考慮して引き続き主要な国際的な公衆衛生の問題です。ベクトルへの応答で使用されている、従来の殺虫剤は、蚊媒介性疾患の予防のための持続可能な統合された蚊コントロール戦略の主要なコンポーネントです。しかし、このような戦略は、比較的非効果的な蚊個体群3,4の耐性の進化と同様に、関連付けられた否定的な環境影響のため望ましくないか証明しています。これらの理由から、制御及び滅菌雄蚊を生産する遺伝子組換え方法蚊の代替方法を緊急の必要性があるし、病原体耐性蚊のリリースは、有望な新しい制御戦略として生じています。効果的な新しいコントロールのメソッドなど生体内で遺伝子デリバリー、蚊の遺伝子機能の包括的な分析のための安全かつ効果的なアプローチが必要を開発します。
直接マイクロインジェクション プラスミド DNA の二重鎖 RNA (dsRNA) または小さい干渉の RNA (siRNA) は蚊の遺伝子生体内で最も一般的に使用される配送方法。実際には、蚊のトランスジェニック系統の生産は、まだ胚マイクロインジェクション5,6、7のプロセスに依存します。ただし、インジェクションには、いくつか制限があります。まず、この方法は技術的に難しく、複雑な手順が含まれます。第二に、注入は胚、幼虫、蛹、大人は、対象生物の生存に直接影響する物理的な侮辱を発生します。第三に、ほとんど水生生息地に住んでいるし、うごめく運動特性を所有しているので蚊族幼虫のマイクロインジェクションを固定化することは困難です。第四に、1st-2nd幼虫のサイズは 10 〜 20 倍より小さい 4thよりも前者のキューティクルと古い幼虫齢より繊細です。これらの機能で、1st-2nd幼虫に比べて古い段階のものを操作することが難しくなっています。組み合わせることで、これらの要因は、大人8と比較して幼虫 (約 5%) の減少の投与後生存率に貢献します。ウイルス ベースの配信システムは、関連付けられている細胞外および細胞内の障壁を克服するために開発されています。これらのシステムは、簡単操作、高伝達効率、式の長期的かつ堅牢なレベルおよび生体内で永続的な効果を生成する能力の利点を持っています。したがって、レトロ ウイルス、レンチ、およびアデノ ウイルスを利用した配信システムが広くされている遺伝子は、哺乳細胞およびモデル種を使用しました。シンドビス ウイルス発現システムは、大人の蚊; で遺伝子機能を解析する以前使用されていたしかし、バイオ セーフティの懸念のほか、注射はウイルス感染9のための必要なプロセスではまだです。DsRNA ソリューションで幼虫を浸漬による口頭配達は可能な配信方法として以前報告されていますが、小さな RNA 機能解析10に適してはないです。だから、効果的なウイルスの配信方法は、蚊のまだ開発されなければなりません。
蚊濃 (MDVs) は、 ParvoviridaeとBrevidensovirus11の属内のすべてが 1 つの秋のDensovirinae亜科の一部です。MDV ウイルス粒子はエンベロープを持たないとから成っている単一座礁させた DNA ゲノムと正二十面体のキャプシド (20 nm の直径)。ウイルスのゲノムは約 4 kb のサイズを宿主細胞の核内でレプリケートされます。MDVs 環境で比較的安定しているし、蚊の高い特異性と宿主範囲を表示します。これらのウイルスは広がり、蚊個体群の自然を保持する可能性があるし、ほとんどすべての臓器や腸、キイロショウジョウバエマルピギー細管、体脂肪、筋肉、ニューロンと唾液腺12を含むこれらの昆虫の組織に侵入することができます。
そのまま MDV ゲノムはプラスミドを用いた感染性クローン; を生成するプラスミッドのベクトルに subcloned できます。これらのクローンは、蚊のセルに配信されると、ウイルスのゲノムはプラスミッドのベクトルから抽出され、感染性ウイルス粒子が生成されます。MDV は小さな一本鎖 Dna ゲノムがあるため感染性クローンが簡単に構築されているし、ウイルスのゲノムは、簡単操作で11,13をすることができます。これらの特性は、MDV 蚊生物を調べるため貴重なエージェントを作る。しかし、ほぼすべてのウイルスのゲノムはウイルス増殖に不可欠な外来遺伝子の挿入または交換組換えウイルス作成の損失が発生ウイルスの包装および/またはレプリケーションの能力を作成する、遺伝子配達ベクトルとして MDVs の開発のための障壁。ここで、報告するシステムを開発する良品 rAaeDV生体内RNA 配信簡単プラスミド構築の利点と作り出すことができる機能的なウイルスのメンテナンスがある人工のイントロン小さな RNA 発現戦略を使用して野生型のウイルスを必要とせずホスト細胞の長期かつ安定的発現。また、この方法は、幼虫の簡単な伝達のできます。
本研究では次の手順でプロトコルの記述: 1) rAaeDVs イントロンの小さな RNA 発現カセット、2) C6/36 パッケージング細胞を用いた組換えウイルス粒子の生産をエンコーディングのデザイン ライン、3) 細胞の定量的解析rAaeDV ゲノム コピー番号、および 4) 幼虫の生息地の水の体にウイルスの直接導入によるAe。 ヒトスジシマカ幼虫の感染症。全体的にみて、この作品は、特定の Rna または標的遺伝子過剰発現したり開発 MDV の配信システムを使用して蚊の幼虫でノックダウンを示した。
Protocol
Representative Results
Discussion
2 つの rAaeDV の建設を制限する重要な障壁を克服するために重要です。最初の欠陥組換えウイルスの生産です。MDV を適切に表現するベクトル スコーピオン昆虫固有 neurotoxins20 と GFP タンパク質などの外国の遺伝子のサイズとして使用できることが報告されています。ただし、建設方法に関係なく MDV の Orf を挿入または外因性の遺伝子を交換したらウイルス粒子を形成できません独自ヘルパー …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者がキー研究と開発中国プログラムからの財政支援を認める (暁広陳に 2016YFC1200500)、国家自然科学基金、中国の (81672054 および 81371846)、自然の研究チームのプログラム広東省 (2014A030312016) の科学財団と広州 (201508020263) の科学的および技術的なプログラム。我々 は喜んで親切提供 pUCA と p7NS1 GFP プラスミドと批判的にこの原稿を読んで教授ジョナサン ・ カールソン (コロラド州立大学) を認めます。
Materials
| Centrifuge machine | Thermo Scientific | 75004260 | |
| Centrifuge System | Beckman Coulter | 363118 | |
| GeneJET Gel Extraction Kit | Thermo Scientific | K0691 | |
| E.Z.N.A. Plasmid Midi Kit | Omega Biotech | D6904 | |
| Purified Agar | OXOID | LP0028A | |
| FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase (1 U/µL) | Thermo Scientific | EF0651 | |
| FastDigest HpaI | Thermo Scientific | FD1034 | |
| FastDigest XbaI | Thermo Scientific | FD0684 | |
| T4 DNA Ligase (5 U/µL) | Thermo Scientific | EL0011 | |
| TransStbl3 Chemically Competent Cell | Beijing Transgen Biotech | CD521-01 | |
| Ampicillin | Beijing Tiangen Biotech | RT501 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Gibco， Life Technologies | 21875109 | |
| Fetal Bovine Serum（ Australia Origin） | Gibco， Life Technologies | 10099141 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco， Life Technologies | 15070063 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen，Life Technologies | 11668019 | |
| Proteinase K | Promega | MC5008 | |
| DNase I (RNase-free) | Invitrogen，Life Technologies | AM2222 | |
| SuperReal PreMix Plus (SYBR Green) | Beijing Tiangen Biotech | FP205 |
Referências
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