Использование рекомбинантных комаров Densovirus как вектор доставки генов для функционального анализа генов в личинки комаров
Summary
Мы сообщать, с использованием искусственного intronic малых РНК выражение стратегию для разработки не дефектных рекомбинантной Aedes aegypti densovirus (AaeDV) в естественных условиях системы доставки. Описывается подробная процедура для строительства, упаковки и количественный анализ векторов rAaeDV, а также что касается личиночной инфекции.
Abstract
В естественных условиях микроинъекции является метод передачи наиболее часто используемых гена для анализа функции гена в отдельных комаров. Однако этот метод требует более технически сложные операции и включает в себя сложные процедуры, особенно когда используется в личинок из-за их малого размера, относительно тонкой и хрупкой кутикулы и высокой смертности, которые ограничивают его применение. В отличие от вирусных векторов для доставки генов были разработаны для преодоления внеклеточные и внутриклеточных барьеров. Эти системы имеют преимущества простой манипуляции, высокая гена электромеханической эффективности, долгосрочное техническое обслуживание экспрессии генов и способность производить постоянные эффекты в естественных условиях. Комар densoviruses (MDVs) являются комаров конкретных, небольшие одноцепочечной ДНК вирусов, которые могут эффективно поставлять иностранных нуклеиновых кислот в клетки комаров; Однако замены или вставки чужеродных генов для создания рекомбинантных вирусы обычно приводит к потере упаковки или репликации способностей, которая является препятствием для развития этих вирусов в качестве векторов доставки.
Здесь мы сообщаем, использование искусственных intronic малых РНК выражение стратегии для разработки не дефектных рекомбинантной Aedes aegypti densovirus (AaeDV) в естественных условиях системы доставки. Описаны подробные процедуры для строительства, упаковки и количественный анализ векторов rAaeDV и личинок инфекции.
Это исследование показывает, в первый раз, целесообразность разработки не дефектных рекомбинантных MDV микро РНК (miRNA) выражение системы и таким образом обеспечивая мощный инструмент для функционального анализа генов в комаров и создания основы для использование вирусного paratransgenesis для контроля заболеваний, переносимых комарами. Мы продемонстрировали, что instar личинки Aedes albopictus 1st могут быть легко и эффективно заражены путем внедрения вируса в тело воды личинки, разведение сайт и что развитые rAaeDVs может использоваться для overexpress или постучать вниз экспрессия гена конкретных целевых в личинки, обеспечивая инструмент для функционального анализа комаров генов.
Introduction
Москиты таких заболеваний, как малярия, лихорадка денге, лихорадка Зика и желтой лихорадки, являются проблемы международного общественного здравоохранения, которые по-прежнему приходится значительная часть глобального инфекционных заболеваний бремя1,2. Обычных инсектицидов, которые были использованы в ответ на векторы, являются одним из основных компонентов стратегии устойчивого комплексного Москито управления для профилактики болезней, переносимых комарами. Однако такие стратегии оказались относительно неэффективными или нежелательным из-за связанного негативного экологического воздействия, а также эволюция сопротивления в Москито населения3,4. По этим причинам существует настоятельная необходимость в альтернативных методов комаров, управления и использования трансгенных методов для производства стерильных мужской комаров и выпуска устойчивостью возбудителя комаров возникли как перспективных новых стратегий управления. Для разработки эффективных новых управления методы, такие, как безопасные и эффективные подходы в vivo гена доставки, всесторонний анализ функции гена комаров не требуется.
Прямые микроинъекции плазмидной ДНК, двойной мель РНК (dsRNA) или малые интерферирующие РНК (siRNA) является наиболее часто используемым в vivo гена метод доставки в комаров. В самом деле производства трансгенных штаммов комаров по-прежнему полагаются на процесс эмбриона микроинъекции5,6,7. Однако микроинъекции имеет ряд ограничений. Во-первых этот метод является технически сложным и включает в себя сложные процедуры. Во-вторых инъекций вызывает физическое оскорбление эмбриона, личинок, куколок и взрослых, который непосредственно влияет на жизнеспособность организма целевой. В-третьих это трудно иммобилизации личинок комаров для микроинъекции потому, что большинство живут в водной среде обитания и обладают характерной извиваясь движения. В-четвертых размер 1st-2nd instar личинки 10 – 20 раз меньше, чем 4го возраста и старше личинок и смазывают бывшего более тонкие. Эти особенности делают трудно манипулировать 1st-2nd instar личинки по сравнению с теми в старых этапов. Вместе, эти факторы способствуют сокращению впрыск выживаемости для личинок (около 5%), по сравнению с8взрослых. Систем на базе вирусный были разработаны для преодоления барьеров, связанных внеклеточные и внутриклеточных. Эти системы имеют преимущества простой манипуляции, высокая электромеханической эффективности, долгосрочные и надежные уровней экспрессии и способность производить постоянные эффекты в естественных условиях. Таким образом Джин, систем доставки, используя ретровирусы, lentiviruses и аденовирусы были широко используется модель видов и inmammalian клеточных линий. Система вирусного выражение синдбис были ранее использованы для анализа функции гена в взрослых комаров; Помимо проблем биобезопасности однако, инъекции-прежнему необходимый процесс для вирусной инфекции9. Несмотря на то, как метод возможности доставки перорального путем замачивания личинок в решении двуцепочечной ДНК уже сообщалось ранее, она непригодна для малых РНК функция анализа10. Таким образом методы эффективные вирусный доставки по-прежнему должны быть разработаны для комаров.
Комар densoviruses (MDVs) являются частью подсемейство Densovirinae Parvoviridae, и все, но один падения в род Brevidensovirus11. MDV вирионы не охватило и состоят из одноцепочечной ДНК (ssDNA) генома и икосаэдра капсид (20 Нм в диаметре). Вирусного генома находится примерно в 4 kb в размер и реплицируется внутри ядер клеток хозяина. MDVs относительно устойчивы в окружающей среде и показать узкие хозяйского диапазона с высокой точностью для комаров. Эти вирусы имеют потенциал для распространения и сохранения естественно популяции комаров и может вторгнуться почти все органы и ткани этих насекомых, в том числе средняя, Malpighian трубочки, жир тела, мускулатура, нейронов и слюнных желез12.
Нетронутыми MDV геномов может быть subcloned в векторы плазмиды производить на основе плазмида инфекционных клоны; когда эти клоны доставляются в клетки комаров, вирусного генома извлекается из вектор плазмиды, и производятся инфекционных вирусных частиц. Потому что MDV имеет небольшой ssDNA генома, инфекционные клонов легко построены и вирусного генома могут быть легко манипулировать11,13. Эти характеристики делают MDV ценным агентом для изучения биологии комаров. Однако, потому что почти все из вирусного генома имеет важное значение для вирусного распространения, создание рекомбинантных вируса путем замены или вставки чужеродных генов приводит к потере вирусный упаковки или репликации способностей, который создает барьером для развития MDVs как ген доставки векторов. Здесь мы сообщаем, что с помощью искусственных intronic малых РНК выражение стратегии для разработки не дефектных rAaeDV в vivo РНК системы доставки, которая имеет преимущества легко плазмида строительство и поддержание функциональной вирус, который может производить стабильное и долгосрочное выражение в клетки хозяина без необходимости дикого вируса. Кроме того этот метод позволяет легко трансдукции личинок.
В этом исследовании описываются протоколы для следующих шагов: 1) дизайн rAaeDVs кодирования кассета intronic выражение малых РНК, 2) производство рекомбинантных вирусных частиц с помощью упаковки ячейки C6/36 линия, 3) количественный анализ клеток бесплатно геном rAaeDV копировать номера и 4) инфекции личинок А.е. albopictus путем прямого введения в организм воды личиночной обитания вируса. В целом эта работа продемонстрировал, что конкретные малые РНК или целевых генов может оверэкспрессировали или сбил в личинки комаров с помощью разработанной системы доставки MDV.
Protocol
Representative Results
Discussion
Важно преодолеть две основные барьеры, которые ограничивают rAaeDV строительство. Во-первых, производство дефектных рекомбинантных вируса. Сообщалось, что MDV может использоваться как вектор выразить соответствующим образом размера чужеродных генов, как Скорпион насекомых специфических…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы признают финансовой поддержке национальных ключевых исследований и развития программы Китая (2016YFC1200500 Чэнь Сяо Гуан), Национальный фонд Китая естественных наук (81672054 и 81371846), команда программы исследований природных Научный фонд Гуандун (2014A030312016) и научно -технической программы Гуанчжоу (201508020263). Мы с благодарностью признаем профессор Джонатан Карлсон (Университет штата Колорадо), любезно предоставление Пука и p7NS1-GFP плазмидов и критически чтения этой рукописи.
Materials
| Centrifuge machine | Thermo Scientific | 75004260 | |
| Centrifuge System | Beckman Coulter | 363118 | |
| GeneJET Gel Extraction Kit | Thermo Scientific | K0691 | |
| E.Z.N.A. Plasmid Midi Kit | Omega Biotech | D6904 | |
| Purified Agar | OXOID | LP0028A | |
| FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase (1 U/µL) | Thermo Scientific | EF0651 | |
| FastDigest HpaI | Thermo Scientific | FD1034 | |
| FastDigest XbaI | Thermo Scientific | FD0684 | |
| T4 DNA Ligase (5 U/µL) | Thermo Scientific | EL0011 | |
| TransStbl3 Chemically Competent Cell | Beijing Transgen Biotech | CD521-01 | |
| Ampicillin | Beijing Tiangen Biotech | RT501 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Gibco， Life Technologies | 21875109 | |
| Fetal Bovine Serum（ Australia Origin） | Gibco， Life Technologies | 10099141 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco， Life Technologies | 15070063 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen，Life Technologies | 11668019 | |
| Proteinase K | Promega | MC5008 | |
| DNase I (RNase-free) | Invitrogen，Life Technologies | AM2222 | |
| SuperReal PreMix Plus (SYBR Green) | Beijing Tiangen Biotech | FP205 |
Referências
- Tolle, M. A. Mosquito-borne diseases. Current problems in pediatric and adolescent health care. 39, 97-140 (2009).
- Petersen, L. R., Jamieson, D. J., Powers, A. M., Honein, M. A. Zika Virus. The New England journal of medicine. 374, 1552-1563 (2016).
- Roberts, D. R., Andre, R. G. Insecticide resistance issues in vector-borne disease control. The American journal of tropical medicine and hygiene. 50, 21-34 (1994).
- Attaran, A., Roberts, D. R., Curtis, C. F., Kilama, W. L. Balancing risks on the backs of the poor. Nature medicine. 6, 729-731 (2000).
- Volohonsky, G., et al. Transgenic Expression of the Anti-parasitic Factor TEP1 in the Malaria Mosquito Anopheles gambiae. PLoS pathogens. 13, 1006113 (2017).
- Galizi, R., et al. A synthetic sex ratio distortion system for the control of the human malaria mosquito. Nature communications. 5, 3977 (2014).
- Bourtzis, K., Lees, R. S., Hendrichs, J., Vreysen, M. J. More than one rabbit out of the hat: Radiation, transgenic and symbiont-based approaches for sustainable management of mosquito and tsetse fly populations. Acta tropica. 157, 115-130 (2016).
- Kumar, S. S., Puttaraju, H. P. Improvised microinjection technique for mosquito vectors. The Indian journal of medical research. 136, 971-978 (2012).
- Attardo, G. M., Higgs, S., Klingler, K. A., Vanlandingham, D. L., Raikhel, A. S. RNA interference-mediated knockdown of a GATA factor reveals a link to anautogeny in the mosquito Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 13374-13379 (2003).
- Singh, A. D., Wong, S., Ryan, C. P., Whyard, S. Oral delivery of double-stranded RNA in larvae of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti: implications for pest mosquito control. Journal of insect science. 13, 69 (2013).
- Ward, T. W., et al. Aedes aegypti transducing densovirus pathogenesis and expression in Aedes aegypti and Anopheles gambiae larvae. Insect molecular biology. 10, 397-405 (2001).
- Carlson, J., Suchman, E., Buchatsky, L. Densoviruses for control and genetic manipulation of mosquitoes. Advances in virus research. 68, 361-392 (2006).
- Barreau, C., Jousset, F. X., Bergoin, M. Pathogenicity of the Aedes albopictus parvovirus (AaPV), a denso-like virus, for Aedes aegypti mosquitoes. Journal of invertebrate pathology. 68, 299-309 (1996).
- Liu, P., et al. Development of non-defective recombinant densovirus vectors for microRNA delivery in the invasive vector mosquito, Aedes albopictus. Scientific reports. 6, 20979 (2016).
- Ortega, M. M., Bouamar, H. Guidelines on Designing MicroRNA Sponges: From Construction to Stable Cell Line. Methods in molecular biology. 1509, 221-233 (2017).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. Journal of visualized experiments : JoVE. , e253 (2007).
- Afanasiev, B. N., Kozlov, Y. V., Carlson, J. O., Beaty, B. J. Densovirus of Aedes aegypti as an expression vector in mosquito cells. Experimental parasitology. 79, 322-339 (1994).
- Hu, H. Y., et al. Evolution of the human-specific microRNA miR-941. Nature communications. 3, 1145 (2012).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74, 5463-5467 (1977).
- Dalby, B., et al. Advanced transfection with Lipofectamine 2000 reagent: primary neurons, siRNA, and high-throughput applications. Methods (San Diego, Calif). 33, 95-103 (2004).
- Gu, J. B., Dong, Y. Q., Peng, H. J., Chen, X. G. A recombinant AeDNA containing the insect-specific toxin, BmK IT1, displayed an increasing pathogenicity on Aedes albopictus. The American journal of tropical medicine and hygiene. 83, 614-623 (2010).
- Hou, Y., Zhang, H., Miranda, L., Lin, S. Serious overestimation in quantitative PCR by circular (supercoiled) plasmid standard: microalgal pcna as the model gene. PloS one. 5, 9545 (2010).
- Ding, J., et al. Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2016).
