Summary
Het doel van dit protocol is om aan te tonen van een effectieve methode om decellularize en decalcify van muis cochleae voor gebruik als steigers voor weefsel waterbouwkundige toepassingen.
Abstract
In zoogdieren, mechanosensory haarcellen die hoorzitting ontbreken de capaciteit om te regenereren vergemakkelijken, heeft die behandelingen voor gehoorverlies beperkt. Huidige regeneratieve geneeskunde strategieën hebben gericht op het transplanteren van stamcellen of genetische manipulatie van de omringende cellen van de steun in het binnenoor ter bevordering van de vervanging van beschadigde stamcellen te corrigeren van gehoorverlies. Echter de extracellulaire matrix (ECM) kan spelen een vitale rol in induceren en onderhouden van de functie van haarcellen, en is niet goed onderzocht. Met behulp van het cochleair kunnen ECM als een steiger te groeien van adulte stamcellen unieke inzichten in hoe de samenstelling en architectuur van de extracellulaire omgeving helpt cellen in stand te houden hoorzitting functie. Hier presenteren we een methode voor het isoleren en decellularizing cochleae van muizen te gebruiken als steigers adulte stamcellen geperfundeerd accepteren. In het huidige protocol zijn cochleae geïsoleerd uit euthanized muizen, decellularized en vastgelegde ontkalkte. Menselijke Wharton de gelei cellen (hWJCs) die geïsoleerd uit de navelstreng werden werden daarna zorgvuldig geperfundeerd in elke slakkenhuis. De cochleae werden gebruikt als bioreactoren en cellen werden gekweekt voor 30 dagen vóór de ondergaan verwerking voor analyse. Decellularized cochleae identificeerbare extracellulaire structuren behouden, maar deed niet onthullen de aanwezigheid van cellen of merkbaar fragmenten van DNA. Cellen in het slakkenhuis geperfundeerd grootste deel van het interieur en exterieur van het slakkenhuis binnengevallen en groeide zonder incidenten over een duur van 30 dagen. Aldus, is de huidige methode kan worden gebruikt om te bestuderen hoe cochleaire ECM beïnvloedt cel ontwikkeling en gedrag.
Introduction
Het slakkenhuis is een ingewikkelde spiraalstructuur gevonden in de temporale bot. Het bestaat uit een buitenste benige labyrint en een concentrische, innerlijke membranous labyrint1. Het labyrint van de membranous bestaat uit drie vloeistof ruimtes: Scala vestibuli, Scala media en Scala pauken1. Het scala media herbergt de sensorische epitheel, die is samengesteld uit een veelheid van celtypes, maar de zintuiglijke haarcellen (HC), die transduce mechanische energie in geluidsgolven naar zenuwimpulsen2, zijn van bijzonder belang. Blootstelling aan akoestische trauma3,4,5, medicatie6,87,ziekte en veroudering9 kan al leiden tot verminderde auditieve functie via HC dood. Haarcel verlies bij zoogdieren is definitief, in tegenstelling tot aviaire HCs, die na letsel10kunnen regenereren.
Een verscheidenheid aan hedendaagse onderzoeksinspanningen hebben geprobeerd om te herstellen van verloren HCs, hoewel de specifieke experimentele benaderingen verschillen. Manipulatie van genexpressie in de sensorische epitheel en implantatie van stamcellen gedifferentieerde buiten het lichaam zijn dominante benaderingen in het veld, hoewel inductie methoden die willen onderscheiden van stamcellen in cochleaire organoids geweest 11,12,13geprobeerd. Elk van deze benaderingen is hetzij afhankelijk direct stamcellen, of de ontwikkelingstoxiciteit signalen gebruikt door stamcellen; echter een tweede gedeeld en potentieel kritisch element is de ECM van het slakkenhuis zelf14,15.
De ECM levert niet alleen fysieke ondersteuning voor cellen en weefsels, waaronder een oppervlak voor cel adhesie, proliferatie, overleving en migratie, maar speelt ook een belangrijke rol in de ontwikkeling van HCs en de spiraal ganglion15,16 ,17. Natuurlijk geeft voorkomende ECM inductieve signalen die cel fenotype vastberadenheid en/of cel adhesie, verspreiding en overleving18 begeleiden kunnen. Bijgevolg is het gebruik van decellularized slakkenhuis in combinatie met gekweekte hWJCs bieden een unieke kans om te verkennen van de rol van de ECM en HC regeneratie. HWJCs zijn een gemakkelijk beschikbaar, niet-controversiële celtype van menselijke umbilical koorden die zich als mesenchymale stamcellen19 gedragengeïsoleerd. HWJCs hebben de mogelijkheid om te differentiëren naar beneden hormoonfuncties cel lineages20,21aangetoond. Dus, het huidige protocol detailleert de isolatie, decellularization en perfusie van cochleae van C57BL muis karkassen met hWJCs voor weefselengineering binnenoor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures, met inbegrip van dierlijke euthanasie, werden uitgevoerd volgens het goedgekeurde institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) protocol (beker #2014-2234) aan de University of Kansas Medical Center (KUMC).
Opmerking: HWJCs werden geïsoleerd uit menselijke umbilical koorden die werden geschonken door patiënten die geïnformeerde toestemming en exemplaren werden gebruikt overeenkomstig de protocollen die zijn goedgekeurd door de Universiteit van Kansas menselijke onderwerpen Commissie (KU-IRB #15402).
1. temporale bot oogst en slakkenhuis isolatie
- Decapitate een adequaat euthanized, 15-week-oude muis door te snijden tussen de schedel en de eerste cervicale wervel met een scherpe schaar chirurgisch, dan spuiten beneden het hoofd met 70% ethanol desinfecteren (figuur 1A).
- Bisect de schedel in een mid-Sagittaal vlak met behulp van dezelfde scherpe paar chirurgische schaar (figuur 1B-C, onderbroken lijnen).
- Verwijder het hersenweefsel van de schedel met behulp van een pincet (Figuur 1 d, pijlpunt).
- Het identificeren van de temporale bot door de aanwezigheid van de auditieve en de nervus vestibularis wortels (figuur 1E-F, pijlpunten) op de binnenkant van de schedel en de gehoorgang van de buitenkant (figuur 1F, pijl). Zorgvuldig door de schedel te isoleren van de temporale-bone van de rest van de schedel (figuur 1G) snijden.
Opmerking: In sommige gevallen, het mogelijk te delicaat wrikken van de omliggende botten van de schedel uit de buurt van het bot van de temporale zonder snijden. - Plaats de fijne pincet in de opening van de gehoorgang ongeveer 5 mm (Figuur 1 H), zodat de tips niet doen risico prikken van het slakkenhuis. Zachtjes open breken van het bot van de bulla (Figuur 1 H, bovenste rood gearceerde gedeelte) dus het fracturen (figuur 1I, rode gestippelde lijn).
Opmerking: Indien nodig, een dissectie Microscoop kan steun bij dit proces om ervoor te zorgen nauwkeurige plaatsing en manipulatie van instrumenten. - Met behulp van fijne pincet, wrikken weg de rest van de ' bulla ' van de temporale bot, bloot van het benige labyrint van het slakkenhuis (figuur 1J, rode haken).
- Plaats een groot genoeg te houden van de temporale-bone petrischaal (b.v., 30 mm of meer) onder de ontrafeling van de scope gezichtsveld en vul deze met voldoende fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) ter dekking van de temporale-bot (b.v., 0,5 tot 1 mL).
- Het onderdompelen van de temporale-bot met de ' bulla ' verwijderd in de PBS met de Vensters van het ovale en ronde van het slakkenhuis naar boven.
Opmerking: Verwijdering van het vestibulair systeem van het slakkenhuis is niet nodig, zoals het vestibulair systeem goed als een handvat fungeert voor het manipuleren van en oriënteren van de functies van het slakkenhuis (Zie afbeelding 1I en figuur 2B). - Met behulp van een ultrafijne paar pincet, verwijder de stapedial slagader, waardoor de stijgbeugel wordt doorgelaten.
- Plaats een tip van de ultra-fijne verlostang via de boog van de stijgbeugel waar de slagader gepasseerd en tactvol omhoog heffen de stijgbeugel. De disarticulated stijgbeugel moeten opheffen off van het ovale venster.
- Met behulp van een tip van de ultra-fijne Tang, doorprikken van de ovaal en rond windows.
- Met behulp van een 1 x PBS gevuld 28,5-gauge spuit met slang (binnendiameter 0,28 mm, buitendiameter 0.61 mm) aangesloten, plaatst u de buis op het ovale venster (figuur 2A -B).
Opmerking: De opening van de buis kan worden gemanipuleerd met behulp van ultra-fijne pincet helpen om ervoor te zorgen nauwkeurige plaatsing.- Gebruik een verse injectiespuit en slang voor elke slakkenhuis.
- Perfuse 2 mL 10% antibioticum-antimycotic (anti-anti) en 10% penicilline-streptomycine (pen-strep) in PBS via het slakkenhuis meer dan 5 min te verwijderen van de perilymph. Zoogdierlevercellen te snel met teveel druk beschadigt de fijne structuren binnen het slakkenhuis.
Opmerking: Handmatig rijden de injectiespuit met de hand op perfuse van de vloeistof door het slakkenhuis is effectief, hoewel een perfusie-pomp kan worden gebruikt als alternatief.- Als handmatig zoogdierlevercellen, gebruikt u een paar fijne, zelfsluitende pincet te stabiliseren van het slakkenhuis (figuur 2A) tijdens perfusie door grijpen de vestibulaire gedeelte van de temporale-bone.
Opmerking: Hoewel niet verplicht, dit laat beide handen vrij om het omgaan met instrumenten; enerzijds kan de spuit (figuur 2A) rijden, terwijl de andere kunt de positie van de buis op de juiste manier (figuur 2B). - Vanaf deze stap voorwaarts, verzorgen om te voorkomen dat bloot het slakkenhuis onnodig in de lucht. Invoering van luchtbellen in de vloeistof ruimtes vloeistof verkeer blokkeert, en verdere uitdroging beschadigt de fijne structuren binnen het slakkenhuis.
- Als handmatig zoogdierlevercellen, gebruikt u een paar fijne, zelfsluitende pincet te stabiliseren van het slakkenhuis (figuur 2A) tijdens perfusie door grijpen de vestibulaire gedeelte van de temporale-bone.
- Verwijderen en verwijderen van alle resterende spier weefsel en bot fragmenten met fijne pincet.
- Indien nodig, opslag geïsoleerde cochleae bij 4 ° C in anti-anti van 10% en 10%-oplossing van de pen-strep in PBS voor maximaal zeven dagen met regelmatige wijzigingen van antibiotische oplossing elke 48 uur.
2. cochleair Processing
- Decellularization
- Voor elke slakkenhuis, opvulling een 20-mL glazen Scintillatie ampul met een 1% natrium dodecyl sulfaat (SDS) oplossing in de geïoniseerde (DI) water, dat wordt gebruikt voor het decellularize van het slakkenhuis.
- Snijd de tip off van een kunststof 7-mL overdracht Pipetteer met behulp van een scheermesje zodat de opening groot genoeg voor een slakkenhuis is te passeren.
- Met behulp van de overdracht precisiepipet, zachtjes stellen het slakkenhuis in de pipet zodat dit gewoon de licht-donkerscheiding rand wordt doorgegeven door een paar millimeter.
- Uitzetting van het slakkenhuis naar de 1% SDS oplossing gevulde Scintillatie flacon.
- Circuleren van 2 mL van de 1% SDS in de geïoniseerde (DI) water door het slakkenhuis in de Scintillatie flacon met behulp van een precisiepipet overdracht.
- Plaats de ampul Scintillatie in een rotator, en laat de flacon Scintillatie draaien bij 10 omwentelingen per minuut gedurende 72 uur bij kamertemperatuur.
- 1% SDS oplossing elke 24 h gedurende 72 uur wijzigen Wees voorzichtig bij het wijzigen van SDS nooit het blootstellen van het slakkenhuis in de lucht.
- Het slakkenhuis driemaal voor 30 min met DI water wassen.
- Verwijder de resterende DI water uit de Scintillatie injectieflacon, verlaten net genoeg te houden van het slakkenhuis ondergedompeld.
- Om te beginnen met botontkalking, voeg 5 mL 10% ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) (0,02 M) in DI water aan de Scintillatie flacon met het slakkenhuis.
- 2 mL 10% EDTA in DI water door het slakkenhuis in de Scintillatie flacon met behulp van een precisiepipet overdracht circuleren.
- Plaats de ampul Scintillatie terug in de rotator, en laat de flacon Scintillatie draaien bij 10 omwentelingen per minuut gedurende 72 uur bij kamertemperatuur. De EDTA-oplossing van 10% elke 24 h gedurende 72 uur wijzigen Wees voorzichtig bij het wijzigen van oplossingen, zodat het slakkenhuis is niet blootgesteld aan lucht.
- Spoel het slakkenhuis 3 keer voor elke 2 h met 1 x PBS; in dit stadium is het slakkenhuis vastgelegde ontkalkte.
- Opslaan van de cochleae voor maximaal 72 uur in een 10% anti-anti, 10% pen-strep oplossing in PBS bij 4 ° C.
Opmerking: Langere opslag mogelijk met regelmatige wijzigingen van antibiotische oplossing; uitgebreide opslag van verwerkte cochleae is echter niet gevalideerd in dit protocol.
3. de verkrijging en de uitbreiding van de hWJCs
- Isoleren hWJCs volgens de eerder gepubliceerde protocollen22. Kort, segmenteren umbilical koorden in 3 cm secties.
- Zorgvuldig maken een ondiepe incisie met een scalpel in de lengte op elk segment van de navelstreng te uitrollen en bloot van de Wharton gelei van de navelstreng. Gebruik pincet te verwijderen van de bloedvaten.
- Wassen navelstreng segmenten tweemaal met genoeg PBS (b.v., 40 mL in een 60 mm petrischaal) om te dompelen van het weefsel. Fijn blad voor weefsel segmenten met een scalpel. Het verteren van weefsels in een petrischaal met 50 mL spijsvertering voedingsbodem van 100 mm (0,2% type 2 collagenase, 1% penicilline-streptomycine, in lage-glucose Dulbecco van bewerkt Eagle's Medium (DMEM)).
- Plaats weefsel in het medium op een roteerschudapparaat 50 rpm 's nachts in een 5% CO2, 37 ° C incubator verteren. De volgende dag, Verdun spijsvertering medium bij een verhouding van 1:16 in 2% antibioticum-antimycotic in PBS en pellet cellen door centrifugeren bij 500 x g bij kamertemperatuur (~ 27 ° C) voor 10 min. Discard supernatant.
- Resuspendeer pellets in de mesenchymale stamcellen groei Medium (MSCGM) en recombineren van cellen. Plaat cellen bij een dichtheid van 7 x 103 cellen/cm2 in Weefselkweek behandeld T-75 kolven. Cultuur van de HWJCs in MSCGM, en uit te breiden tot passage 5 voor experimenten.
Opmerking: HWJCs kan worden sub gekweekt in grotere T-kolven (bijvoorbeeld, T-150, T-300) als passaging te verhogen van de opbrengst van hWJCs voor experimenten.
4. infusie van hWJCs in Decellularized Cochleae
- Decellularized cochleae bereiden
- Met behulp van aseptische techniek, wassen opgeslagen cochleae in 1 x PBS drie keer voor elke 30 min.
- Cochleae overboeken naar afzonderlijke putjes van de plaat van een 24-well, en voeg vervolgens 1 mL van 37 ° C opgewarmd vooraf MSCGM.
- Incubeer cochleae in een 5% CO2, 37 ° C cel cultuur incubator voor een minimum van 1 h voor infusie van cellen.
- HWJCs van elkaar gescheiden en resuspendeer
- Wassen hWJCs met 37 ° C opgewarmd vooraf 1 x PBS tweemaal.
- Voeg genoeg 37 ° C opgewarmd vooraf trypsine met 0,5% EDTA ter dekking van het vaartuig celoppervlak.
- Incubeer hWJCs voor maximaal 5 minuten in een 5% CO2, 37 ° C cel cultuur incubator.
- Controleer of dat 90% van de cellen hebben losgekoppeld van het celoppervlak cultuur door cellen onder een omgekeerde Microscoop te bekijken.
Opmerking: Cellen die bewegen wanneer het vaartuig cultuur zachtjes onttrokken is, hebt losgekoppeld. Cellen die blijven stationaire, hebben niet losgekoppeld. - Tik zachtjes op de zijkanten van de kolf aan de gekoppelde cellen verder te verjagen.
- Controleer of dat 90% van de cellen hebben losgekoppeld van het celoppervlak cultuur door cellen onder een omgekeerde Microscoop te bekijken.
- Met behulp van aseptische techniek, hWJCs van de overdracht van het vaartuig cultuur naar een conische buis van 50 mL, met een gelijkwaardige hoeveelheid van de MSCGM naar de hoeveelheid trypsine gebruikt om zich te distantiëren van de cellen.
- De hWJCs pellet door centrifugatie bij 500 x g bij kamertemperatuur (~ 27 ° C) gedurende 5 minuten.
- Gecombineerd supernatant en resuspendeer hWJCs in MSCGM bij een concentratie van 500.000 cellen/mL.
- Perfuse cochleae
- Cochleae overbrengen in een nieuwe 24-well plaat met behulp van een precisiepipet overdracht.
- Een daling van de MSCGM toevoegen aan elke slakkenhuis om te voorkomen dat een slakkenhuis uitdrogen.
- Fijn oriënteren het slakkenhuis met behulp van ultra-fijne pincet zodat de ovale en ronde ramen zijn naar boven.
Opmerking: Nemen uiterste zorg bij de behandeling rechtstreeks elke slakkenhuis van het slakkenhuis is gemakkelijk beschadigd. - Met behulp van een steriele 28,5-gauge insuline spuit met aangesloten leidingen, opstellen van 0,2 mL geresuspendeerde hWJCs (100.000 cellen).
- Met behulp van gesteriliseerde fijne pincet, plaatst u buis op het ovale venster.
- Fijn en langzaam perfuse het slakkenhuis met 0,2 mL geresuspendeerde hWJCs met een 28,5-gauge insuline-injectiespuit verbonden met polyethyleen slang (buitendiameter: 0.61 mm, binnendiameter: 0,28 mm) over ongeveer 5 min.
- Voeg na perfusie, 0,8 mL van 37 ° C opgewarmd vooraf MSCGM naar het putje met het slakkenhuis om het totale volume in de put aan 1 mL.
- Herhaal de stappen 4.3.3-4.3.7 voor elke slak, met behulp van een verse spuit en buizen van elke keer.
- Plaats van geperfundeerd cochleae in een 5% CO2, 37 ° C cel cultuur incubator, en wijzig media drie keer per week.
5. slakkenhuis oogst en bewaring
Opmerking: Cochleae kunnen worden gekweekt en geoogst op elk punt van de tijd tot 30 dagen na perfusie.
- Om te bewaren cochleae, vast in 4% paraformaldehyde in 1 x PBS's nachts bij 4 ° C op een rockende platform.
- Na fixatie, wassen cochleae met 1 x PBS drie keer voor elke 5 min.
- Geleidelijk uitdrogen slakkenhuis met ethanol en duidelijk met een oplosmiddel alifatische koolwaterstof voordat het inbedden in paraffine.
- Monsters met een dikte van 10 µm gebruikend microtome sectie en monteren op glas Microscoop dia's.
Opmerking: Monsters zijn nu gereed voor histologisch of immunohistochemische verwerking gebruikt standaard protocollen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met behulp van de methoden die hier succesvolle decellularization van cochleae werd beoordeeld door het onderzoek van de aanwezigheid of afwezigheid van DNA door 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) kleuring. Cochleae werden beschouwd als volledig decellularized als DNA was niet geïdentificeerd binnen de decellularized slakkenhuis. Een native slakkenhuis uit een vorige experiment dat niet ondergaan decellularization of botontkalking werd gebruikt als positieve controle ter illustratie van de structuren en de cellen traditioneel gevonden in een C57BL muis slakkenhuis. Het decellularized-vastgelegde ontkalkte slakkenhuis, die niet alle hWJCs toegediend hadden, werd gebruikt als een negatieve controle. Geen kwantificeerbare DAPI gekleurd celkernen werden waargenomen in elke regio van de weefselsectie (Figuur 3). Twee cochleae werden decellularized vastgelegde ontkalkte en vervolgens doordrenkt met hWJCs voor het huidige project. De decellularized-vastgelegde ontkalkte cochleae die werden geperfundeerd met hWJCs werden waargenomen te hebben talrijke DAPI gekleurd kernen binnen het slakkenhuis en groeien op de benige shell buiten het slakkenhuis (tabel 1). Totale geraamde cel dichtheden voor de cel geïnfundeerd eerste slakkenhuis werden 113,759 cellen/slakkenhuis na 30 dagen van cultuur (Figuur 4 en Figuur 5) en voor het tweede slakkenhuis 118,732 cellen/slakkenhuis na 30 dagen van cultuur waren (Figuur 6 en Figuur 7). Deze cel dichtheid schattingen bevatten de Scala pauken, Scala media, en Scala vestibule en volumes van de structuren gevonden binnen de drie vloeistof ruimtes, maar deze schattingen uitgesloten van de resterende benige labyrint. Daarnaast monsters van elke slakkenhuis werden gekleurd met haematoxyline en eosine (H & E) om te laten zien van de aanwezigheid van cellen en anatomische eigenschappen binnen elke slak (Figuur 8). De bruto-anatomie van het cochleair microstructuren bleef overwegend onveranderd gedurende alle gekleurde secties; Er waren echter geen cellen identificeerbare in de decellularized-vastgelegde ontkalkte sectie (Figuur 8). De identificatie van celkernen was dramatisch anders tussen de inheemse slakkenhuis (figuur 8A) en de decellularized-vastgelegde ontkalkte cochleae doordrenkt met cellen (figuur 8C-D).
Figuur 1: muis temporale bot isolatie. Zodra de muis op de juiste wijze heeft geweest euthanized, het dier door te snijden tussen de onderkant van de schedel en de eerste cervicale wervel onthoofden en spray het hoofd met ethanol desinfecteren (A). Bisect de schedel in een sagittale vlak van sectie (B-C) met behulp van een scherpe paar chirurgische scharen, snijden door zowel de hersenweefsel en het bot. Het hoofd van de doorsneden muis (D, lagere onderkaak verwijderd voor niet-verwante experimenteel werk) moet vervolgens het hersenweefsel te onthullen van de temporale-bot verwijderd. De twee foramen waarlangs de auditieve en vestibular zenuwen pass (E, rode pijlpunten) zijn nuttige aanwijzingen voor het succesvol identificeren van de temporale-bot. Verwijder het vlees uit de schedel (F). De externe gehoorgang (F, pijl, bovenste paneel) biedt een nuttige externe cue ook. Zorgvuldig trim weg het overtollige bot, waardoor alleen het geïsoleerde temporale bot (G). De bulla (H, bovenste paneel, rood gemarkeerde gebied) moet dan fijn verwijderd met behulp van fijne pincet (H, lagere paneel). De ' bulla ' dunne bot is en kan worden gemakkelijk weg afgestoken (ik) totdat het benige labyrint van het slakkenhuis is geopenbaard (J, rode haken). Schaal bars op alle afbeeldingen zijn 1 mm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: cochleair perfusie. Zodra de temporale bot geïsoleerd is en de ' bulla ' is verwijderd, kan het slakkenhuis vervolgens worden instellen voor perfusie bij een microscoop. Wanneer zoogdierlevercellen met behulp van een handmatig aangedreven spuit met slang gekoppeld (A, gestippelde lijn) kan het nuttig zijn voor het slakkenhuis met behulp van een paar van zelfsluitend verlostang stabiliseren. Zachtjes de verlostang hechten aan het vestibulair deel van het bot van de temporale (B) en het rusten van de verlostang tegen de lip van de petrischaal (A). Dit laat beide handen vrij om het manipuleren van instrumenten tijdens de perfusie. Enerzijds kan dan het manipuleren van de spuit, controle van het debiet van de vloeistof, terwijl de andere kant kan de slang plaatst op het ovale venster met behulp van een tweede paar pincet (B). Snijden van het vrije uiteinde van de buis onder een hoek staat voor gemakkelijker positionering, waardoor de buis correct worden geplaatst zonder te blokkeren van het gezichtsveld. De bar van de schaal is 1 mm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: weefselsectie van een decellularized muis slakkenhuis. Een rechtop epi-belichting fluorescerende Microscoop werd gebruikt om het imago van de monsters bij een vergroting van 200 X (10 X oculair en 20 X doelstelling). Beelden waren elkaar gestikt tot ongeveer een 4 x 5 montage. DAPI nucleaire kleuring weergegeven: gebrek aan cellen wordt weergegeven in deelvenster met een DAPI gemeenschappelijk filter set (350 nm excitatie, 470 nm emissie), en een overbelicht, afbeelding in grijswaarden van de autofluorescence met behulp van een fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) algemeen filter (490 nm excitatie, 525 nm emissie), worden waarmee het anatomische monumenten, weergegeven in Configuratiescherm B. Geautomatiseerde cellen werden uitgevoerd in drie gebieden van belang, die zijn afgebakend op beide panelen A en B. De graven van de cel totaal werden voor de gehele weefselsectie (1, ononderbroken witte lijn) en het slakkenhuis (2, stippellijn) berekend. Deze twee nummers werden gebruikt voor het berekenen van het aantal cellen in de benige structuren buiten het slakkenhuis, maar binnen de randen van het exterieur, bony van de weefselsectie (3, ruimte tussen de gestippelde lijn en stippellijn). Schaal bars op alle afbeeldingen zijn 500 µm.Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: een in de buurt van de modiolar sectie van decellularized muis slakkenhuis 1 doordrenkt met hWJCs. DAPI nucleaire kleuring wordt weergegeven in het deelvenster die a overlay op een overbelichte, grijswaarden autofluorescence uit het groene kanaal, waarmee anatomische monumenten. Cel graven werden uitgevoerd in drie gebieden van belang, die zijn afgebakend in deelvenster Ageautomatiseerd. De graven van de cel totaal werden voor de gehele weefselsectie (1, ononderbroken witte lijn) en het slakkenhuis (2, stippellijn) berekend. Deze twee nummers werden gebruikt voor het berekenen van het aantal cellen in de benige structuren buiten het slakkenhuis, maar binnen de randen van het exterieur, bony van de weefselsectie (3, ruimte tussen de gestippelde lijn en stippellijn). Geïsoleerde DAPI kleuring wordt weergegeven in het deelvenster Ben de drempel van de DAPI kleuring gebruikt tijdens geautomatiseerde kwantificering wordt weergegeven in het deelvenster C. Schaal bars op alle afbeeldingen zijn 500 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: hoge vergroting weergave van een nabij-modiolar sectie van decellularized muis slakkenhuis 1 doordrenkt met hWJCs. DAPI nucleaire kleuring wordt weergegeven in het deelvenster die a overlay op een overbelicht, afbeelding in grijswaarden van de autofluorescence van het groene kanaal, waarmee anatomische monumenten. Geïsoleerde DAPI kleuring wordt weergegeven in het deelvenster B, en het beeld van de drempel gebruikt tijdens geautomatiseerde cel tellen wordt weergegeven in het deelvenster C. De vloeistof ruimtes en fijnere microstructuren gehuisvest in het slakkenhuis zijn fraaie tijdens de decellularization en cel cultuur fasen van het experiment. Scala Vestibuli (SV), Scala pauken (SM), basilair membraan (BM), Tectorial Membrane (TM), spiraal Limbus (L), Rosenthal van Canal (RC) Modiolus (M), spiraal Ligament (SL) en Stria Vascularis (*). Membraan van Reissner was niet duidelijk gedefinieerd in weefselsecties, en dientengevolge het Scala Media is niet duidelijk gedefinieerd. Schaal bars op alle afbeeldingen zijn 250 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6: een in de buurt van de modiolar sectie van decellularized muis slakkenhuis 2 dat is doordrenkt met hWJCs. DAPI nucleaire kleuring wordt weergegeven in het deelvenster A, overlay op grijswaarden autofluorescence uit het groene kanaal, waarmee anatomische monumenten. Cel graven werden uitgevoerd in drie gebieden van belang, die zijn afgebakend in deelvenster Ageautomatiseerd. De graven van de cel totaal werden voor de gehele weefselsectie (1, ononderbroken witte lijn) en het slakkenhuis (2, stippellijn) berekend. Deze twee nummers werden gebruikt voor het berekenen van het aantal cellen in de benige structuren buiten het slakkenhuis, maar binnen de randen van het exterieur, bony van de weefselsectie (3, ruimte tussen de stippellijn en stippellijnen). Geïsoleerde DAPI kleuring wordt weergegeven in het deelvenster Ben de drempel van de DAPI kleuring gebruikt tijdens geautomatiseerde kwantificering wordt weergegeven in het deelvenster C. Schaal bars op alle afbeeldingen zijn 500 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 7: hoge vergroting weergave van een nabij-modiolar sectie van decellularized muis slakkenhuis 2 dat is doordrenkt met hWJCs. DAPI nucleaire kleuring wordt weergegeven in het deelvenster A, overlay op grijswaarden autofluorescence uit het groene kanaal, waarmee anatomische monumenten. Geïsoleerde DAPI kleuring wordt weergegeven in het deelvenster B, en het beeld van de drempel gebruikt tijdens geautomatiseerde cel tellen wordt weergegeven in het deelvenster C. De vloeistof ruimtes en fijnere microstructuren gehuisvest binnen het cochleair worden bewaard tijdens de decellularization en cel fasen van de cultuur van het experiment. Scala Vestibuli (SV), Scala pauken (SM), basilair membraan (BM), Tectorial Membrane (TM), spiraal Limbus (L), Rosenthal van Canal (RC) Modiolus (M), spiraal Ligament (SL) en Stria Vascularis (*). Membraan van Reissner was niet duidelijk gedefinieerd in weefselsecties, en dientengevolge het Scala Media is niet duidelijk gedefinieerd. Schaal bars op alle afbeeldingen zijn 250 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 8: haematoxyline en eosine-kleuring van controle en behandelde cochleae. Haematoxyline en eosine gekleurd secties weergeven van een typische slakkenhuis met inheemse cellen aanwezig wordt in deelvenster Aweergegeven. Deelvenster B bevat dezelfde structuren als paneel A, maar is van een volledig decellularized slakkenhuis, die de extracellulaire matrix achterlaat. De twee eerder is laten zien cochleae doordrenkt met hWJCs worden gezien in panelen C en D. De bruto cochleair anatomie blijft hoofdzakelijk ongewijzigd door middel van de decellularization en de cel cultuur processen, hoewel de specifieke cel populaties en de locaties zijn drastisch veranderd. Scala Vestibuli (SV), Scala pauken (SM), basilair membraan (BM), Tectorial Membrane (TM), spiraal Limbus (L), Rosenthal van Canal (RC) Modiolus (M), spiraal Ligament (SL) en Stria Vascularis (*). Schaal bars op alle afbeeldingen zijn 250 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| A1 Slakkenhuis + cellen | A2 Slakkenhuis + cellen | B2 Neg. |
Tabel 1: cel van tellingen. DAPI gekleurd cochleair secties waren thresholded en gekwantificeerde gebruik van automatische tellen tools in ImageJ in 3 niet-overlappende gebieden van belang (buiten het benige labyrint, temporale been buiten de cochleair vloeistof ruimten, en binnen het slakkenhuis). De oppervlakte van de dwarsdoorsnede cochleair werd ook gemeten in ImageJ, en deze waarde werd gebruikt om het berekenen van sectie volume in combinatie met de dikte van de sectie (10 µm). Met behulp van een raming van de totale cochleair volume geplaatst door Santi et al. 23, de relatieve cochleair omvang van een bepaalde sectie werd berekend. De celdichtheid van het hele slakkenhuis was geschat aan de hand van de relatieve cochleair omvang van een bepaalde sectie in combinatie met de gekoppelde cel tellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We hebben succesvol gebleken dat inheemse cochleair cellen van het slakkenhuis via een proces van decellularization, die het mogelijk voor het gebruik van het slakkenhuis als een ingewikkelde, drie-dimensionale weefsel steiger maakt kunnen worden verwijderd. Santi et al. 15 ontwikkelde de eerste methode om decellularizing cochleae, en de volumes van vele cochleair structuren door met behulp van licht blad microscopie23nauwkeurig hebben geschat. Dergelijke vroege werk diende als een sterke basis voor de weefselkweek en cel cultuur technieken hier gepresenteerd. Decellularized slakkenhuis kan met succes worden doordrenkt met cellen, en vervolgens gekweekt voor een langere periode van tijd. Cochleae uit een brede waaier van dieren kunnen theoretisch worden gebruikt in combinatie met een zo breed scala van cellen typen. Deze combinaties toestaan de technieken die hier gepresenteerd om te worden gebruikt in talrijke mogelijke experimentele designs, zoals weefsel technische toepassingen die zintuiglijke epitheel ontwikkeling14onderzoeken, drug testen van nieuwe geneesmiddelen het geval 24, en ontwikkeling van cochleair reparatie modellen25. Nochtans, ondanks de brede toepasbaarheid van deze technieken zijn zij niet zonder beperkingen.
Een van de beperkingen van de huidige techniek is dat de perfusie variabele op basis van het individu. Ontwikkeling van een houder, zullen voor het slakkenhuis, en het gebruik van een spuitpomp uit te voeren perfusions kunnen verhogen van de nauwkeurigheid en het succes van het proces. Bovendien kon definitief blijkt succesvol decellularization potentieel worden bereikt door middel van verschillende methoden. Wij werkzaam DAPI kleuring die werd gebruikt voor het kwantificeren van de resterende celkernen, en we geen resterende kernen post-decellularization waargenomen. Bovendien standaard DNA kwantificering testen gebruiken de reagens, groene kleurstof picogram hoeveelheden DNA, vast te stellen nucleïnezuur overblijfselen, die visueel gevoeliger dan DAPI wellicht voor de identificatie van de aanwezigheid van kleine fragmenten van nucleïnezuur opsporen zuren in decellularized weefsels26. Ongeacht welke technieken worden gebruikt voor het valideren van de succesvolle decellularization, het niet mogelijk om te laten zien van de volledige decellularization van een individuele slakkenhuis voorafgaand aan gebruik te maken van het als een steiger. Toch hebben we het decellularization proces succesvol en robuuste gevonden.
De twee meest kritische stappen in het huidige protocol zijn de isolatie en de behandeling van de cochleae en de perfusie van het cochleae. Grote zorg moet worden genomen wanneer het slakkenhuis aanvankelijk geïsoleerd, is zoals het slakkenhuis delicaat en broos is. Als te veel kracht wordt toegepast tijdens het verwerken van het slakkenhuis met pincet, kon het slakkenhuis fragment. Het is dus absoluut noodzakelijk om elke slakkenhuis zachtjes voor decellularization en botontkalking. Het vestibulaire systeem, fungeert als opengebroken, als een groot handvat voor het binnenoor complexe grijpen met een tang en kunt u het slakkenhuis. Evenzo, wanneer zoogdierlevercellen het slakkenhuis met cellen, de druk achter de perfusie moet niet te groot, anders cellen kunnen niet overleven de perfusie. Zoals opgemerkt in het huidige protocol, zorgt verbonden buis aan het einde van een spuit van 1 mL insuline voor eenvoudiger behandeling van het slakkenhuis met enerzijds, en de grotere precisie in zoogdierlevercellen cellen via het slakkenhuis met de andere hand.
Als een volgende stap zou het natuurlijk om te beoordelen van de ontwikkelings- en functionele markeringen om te bepalen als het cochleair ECM is dat differentiatie van stamcellen, en als zo, welke specifieke onderdelen van het ECM in het slakkenhuis zijn inducerende veranderingen in cellen. Verschillende soorten cellen (bijvoorbeeld, stamcellen, neuroprogenitors, fibroblasten, enz.) door het slakkenhuis aan monitor celdifferentiatie en gedrag zoogdierlevercellen zou een andere fascinerende follow-up onderzoek. Daarnaast kunnen cellen die genetisch gemanipuleerde of worden blootgesteld aan een groeifactor differentiatie protocol bieden nieuwe inzichten in hoe de cochleair ECM hormoonfuncties ontwikkeling ondersteunt, en misschien zelfs functie in de hoorzitting. Dus, het huidige protocol is een belangrijke eerste stap bij het gebruik van het cochleair ECM binnenoor hormoonfuncties ontwikkeling en onderhoud, die kan een dag tot de ontwikkeling van nieuwe therapieën leiden te herstellen verlies van het gehoor te gaan studeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Het huidige project werd gefinancierd door de Universiteit van Kansas bewijs van Concept Fonds. Wij wil bedanken het verplegend personeel op KUMC (Kansas City, KS) voor ons te helpen bij het verkrijgen van menselijke umbilical snoeren, en David Jorgensen voor het assisteren met cochleae culturen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Allegra X-14R Centrifuge | Beckman-Coulter | B08861 | |
| Intramedic Semi-Rigid Tubing | Becton Dickinson | 427401 | |
| New Brunswick Innova 2000 Orbital Shaler | Eppendorf | M1190-0002 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14060-10 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11370-40 | |
| Ultra-Fine Forceps | Fine Science Tools | 18155-13 | |
| 50-mL Conical Tubes | Fisher Scientific | 12565271 | |
| Petri Dish | Fisher Scientific | FB087579B | |
| U-100 Insulin Syringe | Fisher Scientific | 14-829-1B | |
| Scintillation Vial | Fisher Scientific | 03-341-73 | |
| Rotator | Fisher Scientific | 88-861-049 | |
| Transfer Pipette | Fisher Scientific | 22-170-404 | |
| Razor Blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Fisher Scientific | 15-240-062 | |
| Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | 15-140-122 | |
| 24-Well Plate | Fisher Scientific | 07-200-84 | |
| SuperFrost PLUS Glass Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Transfer Pipette | Fisher Scientific | 22-170-404 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Fisher Scientific | P36935 | |
| Clear-Rite 3 | Fisher Scientific | 22-046341 | |
| Thermo Scientific Forma Series II 3110 Water-Jacekted CO2 Incubator | Fisher Scientific | 13-998-078 | |
| Mesenchymal Stem Cell Growth Medium | Lonza | PT-3001 | |
| Trypsin-EDTA | Lonza | CC-3232 | |
| TPP T-75 Culture Flask | MidSci | TP90076 | |
| TPP T-150 Culture Flask | MidSci | TP90151 | |
| TPP T-300 Culture Flask | MidSci | TP90301 | |
| Dissection Microscope | Nikon Instruments | SMZ800 | |
| Nikon Eclipse Ts2R-FL Inverted Microscope | Nikon Instruments | MFA51010 | |
| NuAire Class II, Type A2 Biosafety Cabinet | NuAire | NU-425-600 | |
| 1X PBS | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | |
| 1% SDS Solution | Sigma-Aldrich | 436143-100G | |
| 10% EDTA | Sigma-Aldrich | E9884-100G |
References
- Raphael, Y., Altschuler, R. A.
- LeMasurier, M., Gillespie, P. G. Hair-Cell Mechanotransduction and Cochlear Amplification. Neuron. 48 (3), 403-415 (2005).
- Neal, C., et al. Hair cell counts in a rat model of sound damage: Effects of tissue preparation & identification of regions of hair cell loss. Hear Res. 328, 120-132 (2015).
- Ivory, R., Kane, R., Diaz, R. C. Noise-induced hearing loss: a recreational noise perspective. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 22 (5), 394-398 (2014).
- Stucken, E. Z., Hong, R. S. Noise-induced hearing loss: an occupational medicine perspective. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 22 (5), 388-393 (2014).
- Dille, M. F., et al. Tinnitus onset rates from chemotherapeutic agents and ototoxic antibiotics: results of a large prospective study. J Am Acad Audiol. 21 (6), 409-417 (2010).
- Sajjadi, H., Paparella, M. M. Meniere's disease. Lancet. 372 (9636), 406-414 (2008).
- House, J. W., Brackmann, D. E.
- Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Acceleration of age-related hearing loss by early noise exposure: evidence of a misspent youth. J Neurosci. 26 (7), 2115-2123 (2006).
- Ryals, B. M., et al. Avian species differences in susceptibility to noise exposure. Hear Res. 131 (1-2), 71-88 (1999).
- Koehler, K. R., Mikosz, A. M., Molosh, A. I., Patel, D., Hashino, E. Generation of inner ear sensory epithelia from pluripotent stem cells in 3D culture. Nature. 500 (7461), 217-221 (2013).
- Sekiya, T., et al. Cell transplantation to the auditory nerve and cochlear duct. Exp Neurol. 198 (1), 12-24 (2006).
- Shi, F., Edge, A. S. Prospects for replacement of auditory neurons by stem cells. Hear Res. 297, 106-112 (2013).
- Mellott, A. J., Shinogle, H. E., Nelson-Brantley, J. G., Detamore, M. S., Staecker, H. Exploiting decellularized cochleae as scaffolds for inner ear tissue engineering. Stem Cell Res Ther. 8, (2017).
- Santi, P. A., Johnson, S. B. Decellularized ear tissues as scaffolds for stem cell differentiation. J Assoc Res Otolaryngol. 14 (1), 3-15 (2013).
- Davies, D., Holley, M. C. Differential expression of alpha 3 and alpha 6 integrins in the developing mouse inner ear. J Comp Neurol. 445 (2), 122-132 (2002).
- Gerchman, E., Hilfer, S. R., Brown, J. W. Involvement of extracellular matrix in the formation of the inner ear. Dev Dyn. 202 (4), 421-432 (1995).
- Goodyear, R. J., Richardson, G. P. Extracellular matrices associated with the apical surfaces of sensory epithelia in the inner ear: molecular and structural diversity. J Neurobiol. 53 (2), 212-227 (2002).
- Mellott, A. J., et al. Improving Viability and Transfection Efficiency with Human Umbilical Cord Wharton's Jelly Cells Through Use of a ROCK Inhibitor. Cell Reprogram. , (2014).
- Mellott, A. J., Shinogle, H. E., Moore, D. S., Detamore, M. S. Fluorescent Photo-conversion: A second chance to label unique cells. Cell Mol Bioeng. 8 (1), 187-196 (2015).
- Mitchell, K. E., et al. Matrix cells from Wharton's jelly form neurons and glia. Stem Cells. 21 (1), 50-60 (2003).
- Mellott, A. J., et al. Nonviral Reprogramming of Human Wharton's Jelly Cells Reveals Differences Between ATOH1 Homologues. Tissue Eng Part A. 21 (11-12), 1795-1809 (2015).
- Buytaert, J. A., Johnson, S. B., Dierick, M., Salih, W. H., Santi, P. A. MicroCT versus sTSLIM 3D imaging of the mouse cochlea. J Histochem Cytochem. 61 (5), 382-395 (2013).
- Nonoyama, H., et al. Investigation of the ototoxicity of gadoteridol (ProHance) and gadodiamide (Omniscan) in mice. Acta Otolaryngol. 136 (11), 1091-1096 (2016).
- Dai, C., et al. Rhesus Cochlear and Vestibular Functions Are Preserved After Inner Ear Injection of Saline Volume Sufficient for Gene Therapy Delivery. J Assoc Res Otolaryngol. , (2017).
- Sutherland, A. J., Converse, G. L., Hopkins, R. A., Detamore, M. S. The bioactivity of cartilage extracellular matrix in articular cartilage regeneration. Adv Healthc Mater. 4 (1), 29-39 (2015).
