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Bioengineering

Ein Protokoll für einem Maus Cochleae für das Innenohr Tissue Engineering

Published: January 1, 2018 doi: 10.3791/56523
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 3
1Department of Otolaryngology, University of Kansas Medical Center, 2Stephenson School of Biomedical Engineering, University of Oklahoma, 3Department of Plastic Surgery, University of Kansas Medical Center

Summary

Das Ziel dieses Protokolls ist eine effektive Methode, um decellularize und Entkalken Maus Cochleae zur Nutzung als Gerüste für Tissue-engineering-Anwendungen zu demonstrieren.

Abstract

Bei Säugetieren, Mechanosensory Haarzellen, die Anhörung fehlt die Fähigkeit zu regenerieren, zu erleichtern hat die Behandlungen für Hörverlust beschränkt. Aktuelle Strategien der regenerativen Medizin konzentrierten sich auf die Transplantation von Stammzellen oder genetische Manipulation der umliegenden Stützzellen im Innenohr zu ermutigen, Ersatz der beschädigten Zellen, Verlust der Hörfähigkeit zu korrigieren. Doch die extrazelluläre Matrix (ECM) kann spielen eine entscheidende Rolle bei der Induktion und Aufrechterhaltung der Funktion der Haarzellen und nicht gut untersucht. Mit dem Cochlea-können ECM als Gerüst zu adulten Stammzellen wachsen einzigartige Einblicke in wie die Zusammensetzung und die Architektur der extrazellulären Umgebung aids Zellen bei der Aufrechterhaltung des Gehörs. Hier präsentieren wir eine Methode zur Isolierung und einem Cochleae von Mäusen, als Gerüste akzeptieren perfundierten adulten Stammzellen zu verwenden. In dem aktuellen Protokoll sind Cochleae isoliert euthanasierten Mäuse, decellularized und entkalkt. Danach wurden menschliche Wharton Gelee Zellen (hWJCs), die aus der Nabelschnur isoliert wurden sorgfältig in jedem Cochlea durchblutet. Die Cochleae dienten als Bioreaktoren, und Zellen waren für 30 Tage vor einer Bearbeitung für die Analyse kultiviert. Decellularized Cochleae identifizierbare extrazelluläre Strukturen beibehalten, aber das Vorhandensein von Zellen oder spürbare Fragmente von DNA nicht offenbart. Zellen in die Cochlea durchblutet erobert die meisten von Interieur und Exterieur der Cochlea und wuchs ohne Zwischenfall über eine Dauer von 30 Tagen. So kann die aktuelle Methode verwendet werden, wie Cochlea-ECM Affekte Zellentwicklung und Verhalten zu studieren.

Introduction

Die Cochlea ist eine komplizierte Spiralstruktur in das Felsenbein gefunden. Es besteht aus einem äußeren knöchernen Labyrinth und eine konzentrische, innere Membranous Labyrinth1. Die Membranous Labyrinth besteht aus drei fließende Räume: Scala Vestibuli, Scala Media und Scala Pauke1. Die Scala Media beherbergt das sensorische Epithel, die aus einer Vielzahl von Zelltypen besteht, aber die sensorischen Haarzellen (HC), die mechanischen Energie in Schallwellen in Nervenimpulse2transduzieren, von besonderem Interesse sind. Belastung durch Knalltrauma3,4,5, Medikamente6, Krankheit7,8und Altern9 kann alle Beeinträchtigung der auditiven Funktion über HC Tod führen. Haarzelle Verlust bei Säugetieren ist dauerhaft, im Gegensatz zu Vogelgrippe HCs, die nach Verletzungen10regenerieren können.

Eine Vielzahl von zeitgenössischen Forschungsbemühungen haben versucht, Wiederherstellen von verlorenen HCs, obwohl die spezifische experimentelle Ansätze variieren. Manipulation der gen-Expression in den sensorischen Epithel und Implantation von Stammzellen differenzierte außerhalb des Körpers sind dominante Ansätze im Bereich, obwohl Induktion Methoden, die darauf abzielen, Stammzellen in Cochlea Organellen zu unterscheiden gewesen 11,12,13versucht. Jeder dieser Ansätze ist entweder direkt auf Stammzellen oder die Entwicklungsstörungen Cues verwendet durch Stammzellen; jedoch eine zweite geteilt und potenziell kritische Element ist das ECM der Cochlea selbst14,15.

ECM bietet nicht nur physische Unterstützung für Zellen und Gewebe, die eine Oberfläche für die Zelladhäsion, Proliferation, überleben und Migration, aber auch spielt entscheidende Rolle bei der Entwicklung der HCs und die Spirale Ganglion15,16 ,17. Natürlich bietet vorkommende ECM induktive Signale, die Zelle Phänotyp Entschlossenheit und/oder Zelle Adhäsion, Vermehrung und überleben18führen können. Daher die Verwendung von decellularized Cochlea in Kombination mit kultivierten hWJCs bieten eine einmalige Gelegenheit, die Rolle der ECM und HC Regeneration zu erforschen. HWJCs sind eine schnell verfügbare, unumstrittenen Zelltyp abseits der menschlichen Nabelschnur, die Verhalten sich wie mesenchymalen Stammzellen19. HWJCs haben die Fähigkeit zu differenzieren, neurosensorische Zelle Linien20,21gezeigt. So beschreibt das aktuelle Protokoll der Isolation, Decellularization und Durchblutung des Cochleae von C57BL Maus Kadaver mit hWJCs für das Innenohr Tissue Engineering.

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Protocol

Alle Verfahren, einschließlich tierischen Euthanasie wurden entsprechend dem genehmigten institutionelle Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) Protokoll (ACUP #2014-2234) an der University of Kansas Medical Center (KUMC) durchgeführt.

Hinweis: HWJCs wurden isoliert von menschlichen Nabelschnur, die von den Patienten gespendet wurden, die Einwilligung zur Verfügung gestellt und Proben dienten im Einklang mit den Protokollen von der University of Kansas menschlichen Themen Ausschuss (KU-IRB #15402) genehmigt.

1. Felsenbein Ernte und Cochlea-Isolation

  1. Enthaupten Sie eine entsprechend euthanasierten, 15 Wochen alten Maus durch Schneiden zwischen dem Schädel und dem ersten Halswirbel mit einem scharfen chirurgische Schere zu, dann sprühen Sie den Kopf mit 70 % Ethanol (Abbildung 1A) zu desinfizieren.
  2. Halbieren Sie den Schädel in einer Mitte-sagittale Ebene mit den gleichen scharfen chirurgische Schere (Abbildung 1 b-C, gestrichelte Linien).
  3. Entfernen Sie das Hirngewebe aus dem Schädel mit einer Zange (Abb. 1, Pfeil).
  4. Identifizieren des Schläfenbeins durch die Anwesenheit des auditorischen und Vestibular Nervenwurzeln (Abb. 1E-F, Pfeilspitzen) auf der Innenseite des Schädels und der Gehörgang von außen (Abb. 1F, Pfeil). Schneiden Sie vorsichtig durch den Schädel des Schläfenbeins vom Rest des Schädels (Abbildung 1) zu isolieren.
    Hinweis: In einigen Fällen kann es zart hebeln die umliegenden Knochen des Schädels vom Temporal Knochen ohne Schneiden möglich.
  5. Einfügen der feinen Zange in die Öffnung des Gehörgangs ca. 5 mm (Abbildung 1 H), so dass die Spitzen nicht riskieren Durchbohrung der Cochlea. Sanft aufbrechen die Knochen von Pufels (Abbildung 1 H, Top rot schraffierte Fläche) so dass es Frakturen (Abbildung 1I, rote gepunktete Linie).
    Hinweis: Bei Bedarf kann eine Dissektion Mikroskop dabei Hilfe für präzise Positionierung und Handhabung der Instrumente zu gewährleisten.
  6. Mit feinen Pinzette, Hebeln Sie entfernt den Rest der Bulla aus dem Felsenbein, Freilegung der knöchernen Labyrinths der Cochlea (Abbildung 1J, roten Klammern).
  7. Legen Sie eine Petrischale groß genug für das Felsenbein (z.B., 30 mm oder größer) unter dem sezieren Umfang Sichtfeld und füllen es mit genügend Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) zur Deckung des Schläfenbeins (z.B. 0,5 bis 1 mL).
  8. Tauchen Sie das Felsenbein mit der Bulla in PBS mit ovalen und runden Fenster der Cochlea nach oben entfernt.
    Hinweis: Entfernen des vestibulären Systems aus der Cochlea ist nicht notwendig, da das vestibuläre System auch als Griff dient für Manipulation und Funktionen der Cochlea (Abbildung 1I und Abbildung 2 b) orientieren.
  9. Mit einer ultra-feine Pinzette, entfernen Sie die stapedial Arterie, die durch den Steigbügel führt.
  10. Legen Sie eine Spitze der ultrafeinen Zange durch den Bogen von den Steigbügel, wo die Arterie durchlaufen, und zart heben Sie die Steigbügel nach oben. Die Sauropoden Steigbügel sollten deaktivieren des ovalen Fensters aufheben.
  11. Mit einer Spitze der ultra-feine Zange, Punktion des Ovals und Runde Fenster.
  12. Gefüllt mit einer 1 X PBS 28,5-Gauge-Spritze mit Schlauch (Innendurchmesser 0,28 mm, Außendurchmesser 0,61 mm) befestigt, positionieren Sie den Schlauch über das ovale Fenster (Abbildung 2A -B).
    Hinweis: Die Öffnung des Röhrchens manipuliert werden kann mit ultra-feinen Pinzette helfen, die um genaue Platzierung zu gewährleisten.
    1. Verwenden Sie frische Spritze und Schläuche für jede Cochlea.
  13. Perfundieren Sie 2 mL 10 % Antibiotikum Antimykotikums (Anti-Anti) und 10 % Penicillin-Streptomycin (Stift-Strep) mit PBS-Puffer durch die Cochlea über 5 min die Perilymphe zu entfernen. Zu schnell mit zu viel Druck Vorrichtung beschädigen die feinen Strukturen in der Cochlea.
    Hinweis: Manuell fahren die Spritze von hand um die Flüssigkeit durch die Cochlea durchspülen ist wirksam, obwohl eine Perfusion Pumpe als Alternative verwendet werden könnte.
    1. Verwenden Sie manuelle Vorrichtung, ein paar feine, selbstschließende Pinzette zur Stabilisierung der Cochlea (Abbildung 2A) während der Perfusion durch das Greifen des vestibulären Teils des Schläfenbeins.
      Hinweis: Obwohl nicht erforderlich, dies lässt beide Hände frei, Instrumente zu behandeln; Einerseits kann die Spritze (Abbildung 2A) fahren, während die andere den Schlauch positionieren kann entsprechend (Abb. 2 b).
    2. Von diesem Schritt vorwärts, kümmern uns um die Cochlea unnötig an der Luft auszusetzen zu vermeiden. Einführung von Luftblasen in die fließende Räume Flüssigkeitszirkulation blockiert, und weitere Austrocknen die feinen Strukturen in der Cochlea beschädigt.
  14. Entfernen Sie und entsorgen Sie alle restlichen Muskel und Knochen Fragmente mit feinen Pinzette.
  15. Gegebenenfalls speichern Sie isolierten Cochleae bei 4 ° C in Anti-Anti 10 % und 10 % Stift-Strep Lösung mit PBS-Puffer für bis zu sieben Tage mit regelmäßigen Änderungen antibiotische Lösung alle 48 h.

(2) Cochlea-Verarbeitung

  1. Decellularization
    1. Für jede Cochlea füllen ein 20-mL-Glas funkeln Fläschchen mit einer 1 % Sodium Dodecyl Sulfat (SDS) Lösung in deionisiertes (DI) Wasser, das verwendet wird, um decellularize die Cochlea.
    2. Schneiden Sie die Spitze weg von einem Kunststoff 7 mL Transferpipette mit einer Rasierklinge, so dass die Öffnung groß genug für ein Cochlea ist passieren.
    3. Mit der Transferpipette, sanft Aufstellen der Cochlea in die Pipette also es nur die Cut-off Rand um wenige Millimeter geht.
    4. Die Cochlea in 1 % SDS-Lösung gefüllt funkeln Fläschchen zu vertreiben.
    5. Zirkulieren Sie 2 mL 1 % SDS deionisiertes (DI) Wasser durch die Cochlea im Funkeln Fläschchen mit einer Transferpipette.
    6. Legen Sie das Funkeln-Fläschchen in ein Rotator und ermöglichen Sie das Funkeln Fläschchen mit 10 u/min für 72 h bei Raumtemperatur rotieren.
      1. 1 % SDS-Lösung alle 24 h über einen Zeitraum von 72 Stunden zu ändern. Vorsicht beim SDS um der Cochlea an die Luft setzen Sie niemals ändern.
    7. Die Cochlea dreimal für jeweils 30 min. mit VE-Wasser zu waschen.
Führen Sie Waschungen in dem gleichen funkeln Vial verwendet für die SDS-Gebühren; in diesem Stadium ist die Cochlea decellularized.
  • Entkalkung
    1. Entfernen des Restwassers DI aus der Durchstechflasche funkeln, verlassen gerade genug, um die Cochlea eingetaucht.
    2. Fügen Sie Entkalkung zunächst 5 mL 10 % Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA) (0,02 M) in VE-Wasser, das Funkeln-Fläschchen mit der Cochlea.
    3. Zirkulieren Sie 2 mL 10 % EDTA DI Wasser durch die Cochlea im Funkeln Fläschchen mit einer Transferpipette.
    4. Das Funkeln Fläschchen zurück in den Rotator, und ermöglichen Sie das Funkeln Fläschchen mit 10 u/min für 72 h bei Raumtemperatur rotieren. Wechseln Sie die 10 % EDTA Lösung alle 24 h über einen Zeitraum von 72 h. Vorsicht beim Lösungen zu ändern, so dass die Schnecke nicht Luft ausgesetzt ist.
    5. Spülen Sie die Cochlea 3 Mal für jeweils 2 h mit 1 X PBS; in diesem Stadium ist die Cochlea entkalkt.
  • Lagerung
    1. Speichern der Cochleae für bis zu 72 h in einer 10 % Anti-Anti, 10 % Feder-Strep Lösung mit PBS-Puffer bei 4 ° c
      Hinweis: Längere Lagerung können mit regelmäßigen Änderungen antibiotische Lösung möglich sein; längere Lagerung von verarbeiteten Cochleae wurde jedoch nicht in diesem Protokoll validiert.

    • 3. Beschaffung und den Ausbau der hWJCs

    1. HWJCs nach zuvor veröffentlichten Protokolle22zu isolieren. Kurz, Segment Nabelschnüre in 3-cm-Abschnitte.
    2. Machen Sie sorgfältig einen flachen Schnitt mit einem Skalpell auf jedem Segment der Nabelschnur zu entrollen und setzen die Wharton Gelee von der Nabelschnur in Längsrichtung. Verwenden Sie Zange um die Blutgefäße zu entfernen.
    3. Waschen Sie Segmente der Nabelschnur zweimal mit genügend PBS (z.B. 40 mL in einem 60 mm Petrischale), um das Gewebe zu tauchen. Hacken Sie fein Gewebe Segmente mit einem Skalpell. Gewebe in einem 100 mm Petrischale mit 50 mL Verdauung Medium zu verdauen (0,2 % Typ 2 Kollagenase, 1 % Penicillin-Streptomycin, in niedrig-Glukose Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM)).
    4. Legen Sie Gewebe bei der Verdauung von Medium auf einem Orbitalschüttler bei 50 u/min über Nacht in einer 5 % CO2, 37 ° C Inkubator. Am nächsten Tag Verdauung Medium in einem Verhältnis von 01:16 in 2 % Antibiotikum Antimykotikums in PBS verdünnen und pellet-Zellen durch Zentrifugation bei 500 X g bei Raumtemperatur (~ 27 ° C) für 10 min. verwerfen überstand.
    5. Aufschwemmen Sie Pellets in mesenchymale Stammzellen Wachstum Medium (MSCGM) und rekombinieren Sie Zellen. Platte Zellen bei einer Dichte von 7 x 103 Zellen/cm2 in Gewebekultur behandelt T-75 Flaschen. Kultur HWJCs in MSCGM, und erweitern Sie auf Abschnitt 5 für Experimente.
      Hinweis: HWJCs können Sub kultiviert werden in größeren T-Fläschchen (z.B.t-150, T-300) beim Passagierung zur Erhöhung der Ausbeute an hWJCs für Experimente.

    (4) Infusion von hWJCs in Decellularized Cochleae

    1. Bereiten Sie decellularized cochleae
      1. Mit aseptischen Technik gespeicherten Cochleae in 1 X PBS dreimal für jeweils 30 min. waschen.
      2. Cochleae in separaten Vertiefungen einer 24-Well-Platte übertragen, und fügen Sie 1 mL von 37 ° C vorgewärmt MSCGM.
      3. Inkubieren Sie Cochleae in einer 5 % CO2, 37 ° C Zelle Kultur Inkubator für ein Minimum von 1 h vor der Infusion von Zellen.
    2. HWJCs distanzieren und Aufschwemmen
      1. Waschen hWJCs mit 37 ° C vorgewärmt es 1 X PBS zweimal.
      2. Fügen Sie genügend 37 ° C vorgewärmt Trypsin mit 0,5 % EDTA an die Zelloberfläche Schiff zu decken.
      3. Inkubieren Sie hWJCs für bis zu 5 min in einer 5 % CO2, 37 ° C Zelle Kultur Inkubator.
        1. Vergewissern Sie sich, dass 90 % der Zellen von der Zelloberfläche Kultur getrennt haben, indem Sie die Zellen unter einem inversen Mikroskop ansehen.
          Hinweis: Zellen, die sich bewegen, wenn das Kulturgefäß sanft getippt wird, getrennt haben. Zellen, die stationär bleiben, nicht gelöst haben.
        2. Klopfen Sie leicht die Seiten des Kolbens, weiteren angeschlossene Zellen verdrängen.
      4. Aseptischen Technik verwendet, Transfer hWJCs aus dem Kulturgefäß für eine 50mL konische Röhrchen mit gleichwertigem Umfang des MSCGM auf das Volumen des Trypsin, die Zellen zu trennen.
      5. Pellet-die hWJCs durch Zentrifugieren bei 500 X g bei Raumtemperatur (~ 27 ° C) für 5 Minuten.
      6. Aspirieren Sie überstand und aufzuwirbeln Sie hWJCs in MSCGM in einer Konzentration von 500.000 Zellen/mL.
    3. Perfundieren cochleae
      1. Übertragen Sie Cochleae auf einen neuen 24-Well-Platte mit einer Transferpipette.
      2. Einen Tropfen des MSCGM auf jede Schnecke, Cochlea Austrocknen verhindert wird.
      3. Zart orientieren Sie die Cochlea mit ultra-feine Pinzette, so dass die ovalen und runden Fenster sind nach oben.
        Hinweis: Extreme Vorsicht im Umgang mit direkt jede Schnecke da die Cochlea leicht beschädigt ist.
      4. Mit einer sterilen 28,5-Gauge-Insulin-Spritze mit angeschlossenen Schläuchen, erarbeiten von 0,2 mL Nukleinsäuretablette hWJCs (100.000 Zellen).
      5. Positionieren Sie mit sterilisierten feine Pinzette, Schlauch über das ovale Fenster.
      6. Zart und langsam durchspülen die Cochlea mit 0,2 mL resuspendierte hWJCs mit einer 28,5-Gauge Insulin Spritze verbunden mit Polyethylen-Rohre (Außendurchmesser: 0,61 mm, Innendurchmesser: 0,28 mm) über ca. 5 min.
      7. Fügen Sie nach der Perfusion, 0,8 mL von 37 ° C vorgewärmt MSCGM, die gut mit der Cochlea, das Gesamtvolumen in den Brunnen zu 1 mL zu bringen.
      8. Wiederholen Sie Schritte 4.3.3-4.3.7 für jede Schnecke, mit einer frischen Spritze und Schlauch jedes Mal.
      9. Perfundierten Cochleae in einer 5 % CO2, 37 ° C Zelle Kultur Inkubator und ändern Sie Medien dreimal pro Woche zu.

    (5) Cochlea Ernte und Konservierung

    Hinweis: Cochleae möglicherweise kultiviert und geerntet zu jedem Zeitpunkt bis zu 30 Tage nach dem Perfusion.

    1. Um Cochleae zu bewahren, in 4 % Paraformaldehyd in 1 X PBS über Nacht bei 4 ° C auf einem schaukelnden Plattform zu beheben.
    2. Waschen Sie nach der Fixierung Cochleae mit 1 X PBS drei Mal für 5 Minuten.
    3. Allmählich austrocknen Cochlea mit Ethanol und klar mit einem aliphatische Kohlenwasserstoff-Lösungsmittel vor Einbettung in Paraffin.
    4. Abschnitt-Proben bis zu einer Dicke von 10 µm, die mit einem Mikrotom und Mount auf Glas-Objektträger.
      Hinweis: Die Proben sind nun bereit für histologische oder immunhistochemische Bearbeitung mit standard-Protokolle.

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    Representative Results

    Mithilfe der hier vorgestellten Methoden, erfolgreiche Decellularization Cochleae wurden abgeschätzt, indem untersucht das Vorhandensein oder Fehlen von DNA durch 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) Färbung. Cochleae galten als voll decellularized, wenn DNA in der decellularized Cochlea nicht erkannt wurde. Ein native Cochlea aus einer früheren Experiment, die nicht Decellularization oder Entkalkung unterzogen wurde als Positivkontrolle verwendet, um die Strukturen und Zellen, die traditionell in ein C57BL Maus Cochlea veranschaulichen. Die decellularized-entkalkt Cochlea, die keiner hWJCs durchdrungen hatten, diente als Negativkontrolle. Keine quantifizierbaren DAPI gefärbt Zellkerne wurden in jeder Region des Abschnitts Gewebe (Abbildung 3) beobachtet. Zwei Cochleae wurden decellularized und entkalkt und dann mit hWJCs für das aktuelle Projekt infundiert. Der decellularized-entkalkt Cochleae, die mit hWJCs durchströmt wurden beobachtet, haben zahlreiche DAPI gefärbt Kerne innerhalb der Cochlea und wachsen auf die knöcherne Hülle außerhalb der Cochlea (Tabelle 1). Geschätzte Zelldichten für die Zelle infundiert erste Cochlea wurden 113.759 Zellen/Cochlea nach 30 Tagen der Kultur (Abbildung 4 und Abbildung 5) und für die zweite Cochlea 118.732 Zellen/Cochlea nach 30 Tagen der Kultur wurden (Abbildung 6 und ( Abbildung 7). Diese Zelle Dichte Schätzungen gehören die Scala Pauke, Scala Media, Scala Vestibül und Volumen der Strukturen innerhalb der drei fließende Räume gefunden, aber diese Schätzungen eines der verbleibenden knöchernen Labyrinth ausgeschlossen. Darüber hinaus wurden Proben aus jedem Cochlea gefärbt mit Hämatoxylin und Eosin (H & E) zeigen die Anwesenheit von Zellen und anatomischen Gegebenheiten in jedem Cochlea (Abbildung 8). Die Anatomie der Cochlea-Mikrostrukturen unverändert überwiegend alle gefärbten Abschnitten; jedoch keine Zellen, die im Abschnitt decellularized-entkalkt (Abbildung 8 b) erkennbar waren. Die Identifizierung der Zellkerne war dramatisch anders zwischen der nativen Cochlea (Abb. 8A) und die decellularized-entkalkt Cochleae Zellen (Abbildung 8–D) durchdrungen.

    Figure 1
    Abbildung 1: Maus Felsenbein Isolierung. Sobald die Maus entsprechend eingeschläfert worden, das Tier durch Schneiden zwischen der Basis des Schädels und des ersten Halswirbels zu enthaupten und Sprühkopf mit Ethanol (A) zu desinfizieren. Halbieren Sie den Schädel in einer Sagittalebene Abschnitt (B–C) mit einer scharfen chirurgische Schere, Schnitt durch das Gehirngewebe und Knochen. Die halbierten Maus-Kopf (D, unteren Unterkiefer entfernt für unabhängige experimentelle Arbeit) muss dann das Hirngewebe entfernt, um das Felsenbein offenbaren. Die zwei Foramina durch die auditive und Vestibular Nerven-Pass (E, roten Pfeilspitzen) sind nützlich Hinweise für erfolgreichen Identifizierung des Schläfenbeins. Entfernen Sie das Fleisch aus dem Schädel (F). Der äußeren Gehörgang (F, Pfeil, Oberboden) bietet einen nützlichen externe Hinweis sowie. Sorgfältig trim entfernt überschüssige Knochen, so dass nur die isolierte Felsenbein (G). Bulla (H, Abdeckung, rot markierter Bereich) muss dann mit feinen Pinzette (H, untere Leiste) vorsichtig entfernt werden. Die Bulla ist dünne Knochen und kann sein leicht angeschlagen entfernt (ich) bis das knöcherne Labyrinth der Cochlea offenbarten (J, rote Klammern) ist. Maßstabsleisten auf allen Bildern sind 1 mm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

    Figure 2
    Abbildung 2: Cochlea-Perfusion. Sobald das Felsenbein isoliert wurde und die Bulla entfernt wurde, kann die Cochlea dann Durchblutung am Mikroskop eingerichtet werden. Wenn Vorrichtung mit einer manuell betriebenen Spritze mit Schlauch (A angeschlossen, gepunktete Linie) kann es zur Stabilisierung der Cochlea mit einem Paar von selbstschließende Pinzette hilfreich sein. Sanft legen Sie die Zange auf die vestibuläre Teil des Schläfenbeins (B) und ruhen Sie die Zange gegen die Lippe der Petrischale (A). Dadurch können beide Hände frei, Instrumente während der Perfusion zu manipulieren. Einerseits kann dann bearbeiten die Spritze, steuern den Durchfluss der Flüssigkeit, während die andere Hand den Schlauch über das ovale Fenster mit einer zweiten Zange (B) positionieren kann. Schneiden das freie Ende des Schlauches in einem Winkel ermöglicht einfacher Positionierung, so dass den Schlauch richtig platziert werden, ohne das Sichtfeld zu blockieren. Maßstabsleiste beträgt 1 mm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

    Figure 3
    Abbildung 3: Gewebekapitel eine decellularized Maus Cochlea. Eine aufrechte Epi-Leuchtstoff-Mikroskop wurde verwendet, um Bild-Proben bei einer Vergrößerung von 200 X (10 X Okular und 20 X Objektiv). Bilder wurden aneinander genäht, um etwa eine 4 x 5-Montage zu erstellen. DAPI nuklearen Färbung zeigt Fehlen von Zellen wird im Panel A mit DAPI Filter einheitlicher (350 nm Anregung, 470 nm Emission) und ein überbelichtetes, Graustufenbild von der Autofluoreszenz mit einem Fluorescein erfolgt (FITC) gemeinsame Filter angezeigt. Set (490 nm Anregung, 525 nm Emission), der anatomische Landmarken vorsieht, wird im Bedienfeld " B" angezeigt. Automatisierte Zellzahlen wurden in drei Regionen von Interesse, durchgeführt, die auf beide Platten A und Babgegrenzt werden. Insgesamt Zellzahlen wurden für das gesamte Gewebe Abschnitt (1, durchgezogene weiße Linie) und der Cochlea (2, gestrichelte Linie) berechnet. Diese beiden Zahlen wurden zur Berechnung der Anzahl der Zellen in die knöchernen Strukturen außerhalb der Cochlea aber innerhalb der äußeren, knöchernen Ränder des Abschnitts Gewebe (3, Raum zwischen der gepunkteten Linie und gestrichelte Linie). Maßstabsleisten auf allen Bildern sind 500 µm.Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur.

    Figure 4
    Abbildung 4: ein in der Nähe von modiolar Abschnitt decellularized Maus Cochlea 1 infundiert mit hWJCs. DAPI nuklearen Färbung wird im Fenster angezeigt, die A auf eine überbelichtete, Graustufen Autofluoreszenz des grünen Kanals überlagert die anatomische Landmarken bietet. Automatisierte Zelle zählt wurden durchgeführt in drei Regionen von Interesse, die in zentrale Aabgegrenzt werden. Insgesamt Zellzahlen wurden für das gesamte Gewebe Abschnitt (1, durchgezogene weiße Linie) und der Cochlea (2, gestrichelte Linie) berechnet. Diese beiden Zahlen wurden zur Berechnung der Anzahl der Zellen in die knöchernen Strukturen außerhalb der Cochlea aber innerhalb der äußeren, knöchernen Ränder des Abschnitts Gewebe (3, Raum zwischen der gepunkteten Linie und gestrichelte Linie). Isolierte DAPI-Färbung wird im Bedienfeld " B" angezeigt, und die Schwelle der DAPI-Färbung verwendet, während automatisierte Quantifizierung wird im Bedienfeld " C" angezeigt. Maßstabsleisten auf allen Bildern sind 500 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

    Figure 5
    Abbildung 5: hoher Vergrößerung Blick auf einen in der Nähe von modiolar Abschnitt decellularized Maus Cochlea 1 infundiert mit hWJCs. DAPI nuklearen Färbung wird im Fenster angezeigt, die A auf eine überbelichtete, Graustufenbild Autofluoreszenz des grünen Kanals überlagert die anatomische Landmarken bietet. Isolierte DAPI-Färbung wird im Bedienfeld " B" angezeigt, und verwendete, während automatisierte Zellzählung Schwelle Bild wird im Bedienfeld " C" angezeigt. Die fließende Räume und feiner Mikrostrukturen, untergebracht in der Cochlea sind gut erhalten, während die Decellularization und Zell-Kultur Phasen des Experiments. Scala Vestibuli (SV), Scala Pauke (SM), Basilarmembran (BM), Tectorial Membrane (TM), Spirale Limbus (L), Rosenthals Canal (RC), Modiolus (M), Spirale Ligament (SL) und Stria Vascularis (*). Reissner Membran wurde in Gewebeschnitten nicht klar definiert, und infolgedessen die Scala Media war nicht klar definiert. Maßstabsleisten auf allen Bildern sind 250 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

    Figure 6
    Abbildung 6: eine in der Nähe von modiolar Abschnitt decellularized Maus Cochlea 2, die mit hWJCs infundiert wurde. DAPI nuklearen Färbung zeigt sich in Gruppe A, überlagert auf Graustufen Autofluoreszenz aus den Grün-Kanal, die anatomische Landmarken bietet. Automatisierte Zelle zählt wurden durchgeführt in drei Regionen von Interesse, die in zentrale Aabgegrenzt werden. Insgesamt Zellzahlen wurden für das gesamte Gewebe Abschnitt (1, durchgezogene weiße Linie) und der Cochlea (2, gestrichelte Linie) berechnet. Diese beiden Zahlen wurden zur Berechnung der Anzahl der Zellen in die knöchernen Strukturen außerhalb der Cochlea aber innerhalb der äußeren, knöchernen Ränder des Abschnitts Gewebe (3, Raum zwischen der gepunkteten Linie und gestrichelte Linien). Isolierte DAPI-Färbung wird im Bedienfeld " B" angezeigt, und die Schwelle der DAPI-Färbung verwendet, während automatisierte Quantifizierung wird im Bedienfeld " C" angezeigt. Maßstabsleisten auf allen Bildern sind 500 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

    Figure 7
    Abbildung 7: hoher Vergrößerung Blick auf einen in der Nähe von modiolar Abschnitt decellularized Maus Cochlea 2, die mit hWJCs infundiert wurde. DAPI nuklearen Färbung zeigt sich in Gruppe A, überlagert auf Graustufen Autofluoreszenz aus den Grün-Kanal, die anatomische Landmarken bietet. Isolierte DAPI-Färbung wird im Bedienfeld " B" angezeigt, und verwendete, während automatisierte Zellzählung Schwelle Bild wird im Bedienfeld " C" angezeigt. Die fließende Räume und feiner Mikrostrukturen innerhalb der Cochlea untergebracht werden während der Decellularization und Zelle Kultur des Experiments beibehalten. Scala Vestibuli (SV), Scala Pauke (SM), Basilarmembran (BM), Tectorial Membrane (TM), Spirale Limbus (L), Rosenthals Canal (RC), Modiolus (M), Spirale Ligament (SL) und Stria Vascularis (*). Reissner Membran wurde in Gewebeschnitten nicht klar definiert, und infolgedessen die Scala Media war nicht klar definiert. Maßstabsleisten auf allen Bildern sind 250 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

    Figure 8
    Abbildung 8: Hämatoxylin und Eosin Färbung des Steuerelements und behandelten Cochleae. Hämatoxylin und Eosin befleckt Abschnitte zeigt ein typisches Cochlea mit native Zellen vorhanden ist in zentrale Agezeigt. Abdeckung B enthält die gleichen Strukturen als zentrale A, jedoch ist von einer vollständig decellularized Cochlea, die die extrazelluläre Matrix hinterlässt. Die zwei bisher gezeigte Cochleae, angereichert mit hWJCs sind in C und D-Panels gesehen. Die grobe Cochlea-Anatomie unverändert überwiegend durch die Decellularization und Kultur Zellprozesse, obwohl die spezifische Zellpopulationen und Standorte dramatisch verändert. Scala Vestibuli (SV), Scala Pauke (SM), Basilarmembran (BM), Tectorial Membrane (TM), Spirale Limbus (L), Rosenthals Canal (RC), Modiolus (M), Spirale Ligament (SL) und Stria Vascularis (*). Maßstabsleisten auf allen Bildern sind 250 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

    A1 Cochlea + Zellen A2 Cochlea + Zellen B2 Neg.
    Kontrolle Cochlea Äußeren knöchernen Labyrinth 3.758 549 0 Knochen Cochlea Aussenräume 248 586 0 In Cochlea 518 701 0 Insgesamt Zellen 4.524 1.836 0 Schnittkörper (μl) 0.0077 0.0100 0.0147 Prozent des Volumens der Cochlea 0,46 % 0,59 % 0,87 % Zelldichte in Cochlea geschätzt 113.759 118.732 0

    Tabelle 1: Zelle zählt. DAPI gefärbt Cochlea-Abschnitte waren thresholded und quantifizierte automatische Zählung Werkzeugen in ImageJ in 3 nicht überlappende Regionen von Interesse (außerhalb der knöchernen Labyrinth, Felsenbein außerhalb der Cochlea-fließende Räume und in der Cochlea). Cochlea-Querschnittsfläche wurde auch in ImageJ gemessen, und dieser Wert wurde zur Berechnung der Schnittkörper in Kombination mit Schnittdicke (10 µm). Verwenden eine Schätzung der Cochlea-Gesamtvolumen von Santi Et Al. veröffentlicht 23, die relative Cochlea-Lautstärke eines bestimmten Abschnitts wurde berechnet. Die Zelldichte der gesamte Cochlea schätzte die relative Cochlea-Lautstärke eines bestimmten Abschnitts in Kombination mit der gekoppelten Zellzahl.

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    Discussion

    Wir haben erfolgreich gezeigt, dass native Cochlea-Zellen aus der Cochlea über einen Decellularization-Prozess entfernt werden können, ermöglicht die Verwendung der Cochlea als eine komplizierte, dreidimensionale Gewebe-Gerüst. Santi Et Al. 15 die erste Methode für einem Cochleae entwickelt und haben genau die Volumen der durch viele Cochlea-Strukturen mit Hilfe von leichten Merkblatt Mikroskopie23geschätzt. Diese frühen Arbeiten war eine starke Basis für die Gewebe-Engineering und Zelle Kultur hier vorgestellten Techniken. Decellularized Cochlea kann erfolgreich mit Zellen infundiert werden und dann für einen längeren Zeitraum hinweg kultiviert. Cochleae aus einer Vielzahl von Tieren könnte theoretisch in Kombination mit einer ebenso großen Auswahl von Zellen genutzt werden. Diese Kombinationen können die Techniken, die hier vorgestellt werden, um in zahlreichen möglich experimentellen Designs, wie Gewebe, technische Anwendungen, das sensorische Epithel Entwicklung14untersuchen, Drogen-Tests neuer pharmazeutischer Wirkstoffe genutzt werden 24, und Entwicklung von Cochlea-Reparatur Modelle25. Sie sind jedoch trotz der breiten Anwendbarkeit dieser Techniken nicht ohne Einschränkungen.

    Eine Einschränkung der aktuellen Technik ist, dass die Perfusion Variable basierend auf einzelnen. Eine Halterung für die Cochlea, Entwicklung und dem Einsatz einer Spritzenpumpe Verbandwechsel durchzuführen können die Richtigkeit und den Erfolg des Prozesses erhöhen. Darüber hinaus könnte die endgültig beweisen erfolgreiche Decellularization potenziell durch verschiedene Methoden erreicht werden. Wir beschäftigt DAPI Färbung, die verwendet wurde, um die verbleibenden Zellkerne zu quantifizieren, und wir beobachteten keine verbleibenden Kerne Post-Decellularization. Darüber hinaus nutzen standard DNA Quantifizierung Assays Reagenz, grünen Farbstoff erkennen Picogram Mengen von DNA, Nukleinsäure-Überreste zu identifizieren, die optisch als DAPI möglicherweise empfindlicher für die Ermittlung der Anwesenheit von kleine Fragmente von Nukleinsäuren Säuren in decellularized Gewebe26. Unabhängig davon, welche Techniken verwendet werden, um erfolgreiche Decellularization zu validieren möglicherweise es nicht möglich, vollständige Decellularization eines einzelnen Cochlea vor nutzen es als Gerüst zu zeigen. Allerdings fanden wir den Decellularization-Prozess erfolgreich und robust.

    Die beiden wichtigsten Schritte in das aktuelle Protokoll sind die Isolation und der Umgang mit den Cochleae und die Durchblutung der Cochleae. Große Vorsicht ist geboten, wenn die Cochlea zunächst isoliert ist, wie die Cochlea zart und spröde ist. Wenn zu viel Kraft beim Umgang mit der Cochlea mit Zange angewendet wird, könnte die Cochlea fragment. Daher ist es unerlässlich, jede Schnecke vor Decellularization und Entkalkung sanft behandeln. Das vestibuläre System dient bleibt intakt, als ein großer Griff für das Innenohr Komplex mit einer Pinzette greifen und Ausrichten der Cochlea. Ebenso wenn die Cochlea mit Zellen Vorrichtung, der Druck hinter der Perfusion darf nicht zu groß sein, sonst Zellen möglicherweise nicht überleben die Perfusion. Wie in dem aktuellen Protokoll erwähnt, ermöglicht das anbringen Schlauch bis zum Ende einer 1-mL Insulin-Spritze zur einfacheren Handhabung der Cochlea mit einer Hand und höhere Präzision bei der Vorrichtung Zellen durch die Cochlea mit der anderen Hand.

    Als nächster Schritt wäre es natürlich zu beurteilen, Entwicklungs- und funktionellen Markierungen, um festzustellen, ob die Cochlea-ECM Differenzierung von Stammzellen Induktion ist, und wenn so, welche spezifische ECM-Komponenten in der Cochlea sind Veränderungen in Zellen induzieren. Perfusing verschiedene Arten von Zellen (z.B., Stammzellen, Neuroprogenitors, Fibroblasten, etc.) durch die Cochlea, Monitor-Zell-Differenzierung und Verhalten wäre eine weitere faszinierende Follow-up-Untersuchung. Darüber hinaus können Zellen, die gentechnisch verändert wurden oder ein Wachstumsfaktor Differenzierung Protokoll ausgesetzt sind erlauben neue Einblicke in wie die Cochlea-ECM neurosensorischen Entwicklung unterstützt und möglicherweise sogar Funktion in Verhandlung. Das aktuelle Protokoll ist somit ein wichtiger erster Schritt bei der Verwendung der Cochlea-ECM, um Innenohr neurosensorischen Entwicklung und Wartung, die vielleicht eines Tages zur Entwicklung neuer Therapien zum Verlust der Hörfähigkeit wiederherstellen führen zu studieren.

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    Disclosures

    Die Autoren haben nichts preisgeben.

    Acknowledgments

    Das aktuelle Projekt wurde von der University of Kansas Beweis des Konzept-Fonds finanziert. Wir möchte das Pflegepersonal an KUMC (Kansas City, KS) unterstützen uns bei der Beschaffung von menschlichen Nabelschnur und David Jorgensen mit Cochleae Kulturen zu unterstützen.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Allegra X-14R Centrifuge Beckman-Coulter B08861
    Intramedic Semi-Rigid Tubing Becton Dickinson 427401
    New Brunswick Innova 2000 Orbital Shaler Eppendorf M1190-0002
    Surgical Scissors Fine Science Tools 14060-10
    Fine Forceps Fine Science Tools 11370-40
    Ultra-Fine Forceps Fine Science Tools 18155-13
    50-mL Conical Tubes Fisher Scientific 12565271
    Petri Dish Fisher Scientific FB087579B
    U-100 Insulin Syringe Fisher Scientific 14-829-1B
    Scintillation Vial Fisher Scientific 03-341-73
    Rotator Fisher Scientific 88-861-049
    Transfer Pipette Fisher Scientific 22-170-404
    Razor Blade Fisher Scientific 12-640
    Antibiotic-Antimycotic Fisher Scientific 15-240-062
    Penicillin-Streptomycin Fisher Scientific 15-140-122
    24-Well Plate Fisher Scientific 07-200-84
    SuperFrost PLUS Glass Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
    Transfer Pipette Fisher Scientific 22-170-404
    ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI Fisher Scientific P36935
    Clear-Rite 3 Fisher Scientific 22-046341
    Thermo Scientific Forma Series II 3110 Water-Jacekted CO2 Incubator Fisher Scientific 13-998-078
    Mesenchymal Stem Cell Growth Medium Lonza PT-3001
    Trypsin-EDTA Lonza CC-3232
    TPP T-75 Culture Flask MidSci TP90076
    TPP T-150 Culture Flask MidSci TP90151
    TPP T-300 Culture Flask MidSci TP90301
    Dissection Microscope Nikon Instruments SMZ800
    Nikon Eclipse Ts2R-FL Inverted Microscope Nikon Instruments MFA51010
    NuAire Class II, Type A2 Biosafety Cabinet NuAire NU-425-600
    1X PBS Sigma-Aldrich P5368-10PAK
    1% SDS Solution Sigma-Aldrich 436143-100G
    10% EDTA Sigma-Aldrich E9884-100G

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Raphael, Y., Altschuler, R. A. Structure and innervation of the cochlea. Brain Res Bull. 60 (5-6), 397-422 (2003).
    2. LeMasurier, M., Gillespie, P. G. Hair-Cell Mechanotransduction and Cochlear Amplification. Neuron. 48 (3), 403-415 (2005).
    3. Neal, C., et al. Hair cell counts in a rat model of sound damage: Effects of tissue preparation & identification of regions of hair cell loss. Hear Res. 328, 120-132 (2015).
    4. Ivory, R., Kane, R., Diaz, R. C. Noise-induced hearing loss: a recreational noise perspective. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 22 (5), 394-398 (2014).
    5. Stucken, E. Z., Hong, R. S. Noise-induced hearing loss: an occupational medicine perspective. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 22 (5), 388-393 (2014).
    6. Dille, M. F., et al. Tinnitus onset rates from chemotherapeutic agents and ototoxic antibiotics: results of a large prospective study. J Am Acad Audiol. 21 (6), 409-417 (2010).
    7. Sajjadi, H., Paparella, M. M. Meniere's disease. Lancet. 372 (9636), 406-414 (2008).
    8. House, J. W., Brackmann, D. E. Tinnitus: surgical treatment. Ciba Found Symp. 85, 204-216 (1981).
    9. Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Acceleration of age-related hearing loss by early noise exposure: evidence of a misspent youth. J Neurosci. 26 (7), 2115-2123 (2006).
    10. Ryals, B. M., et al. Avian species differences in susceptibility to noise exposure. Hear Res. 131 (1-2), 71-88 (1999).
    11. Koehler, K. R., Mikosz, A. M., Molosh, A. I., Patel, D., Hashino, E. Generation of inner ear sensory epithelia from pluripotent stem cells in 3D culture. Nature. 500 (7461), 217-221 (2013).
    12. Sekiya, T., et al. Cell transplantation to the auditory nerve and cochlear duct. Exp Neurol. 198 (1), 12-24 (2006).
    13. Shi, F., Edge, A. S. Prospects for replacement of auditory neurons by stem cells. Hear Res. 297, 106-112 (2013).
    14. Mellott, A. J., Shinogle, H. E., Nelson-Brantley, J. G., Detamore, M. S., Staecker, H. Exploiting decellularized cochleae as scaffolds for inner ear tissue engineering. Stem Cell Res Ther. 8, (2017).
    15. Santi, P. A., Johnson, S. B. Decellularized ear tissues as scaffolds for stem cell differentiation. J Assoc Res Otolaryngol. 14 (1), 3-15 (2013).
    16. Davies, D., Holley, M. C. Differential expression of alpha 3 and alpha 6 integrins in the developing mouse inner ear. J Comp Neurol. 445 (2), 122-132 (2002).
    17. Gerchman, E., Hilfer, S. R., Brown, J. W. Involvement of extracellular matrix in the formation of the inner ear. Dev Dyn. 202 (4), 421-432 (1995).
    18. Goodyear, R. J., Richardson, G. P. Extracellular matrices associated with the apical surfaces of sensory epithelia in the inner ear: molecular and structural diversity. J Neurobiol. 53 (2), 212-227 (2002).
    19. Mellott, A. J., et al. Improving Viability and Transfection Efficiency with Human Umbilical Cord Wharton's Jelly Cells Through Use of a ROCK Inhibitor. Cell Reprogram. , (2014).
    20. Mellott, A. J., Shinogle, H. E., Moore, D. S., Detamore, M. S. Fluorescent Photo-conversion: A second chance to label unique cells. Cell Mol Bioeng. 8 (1), 187-196 (2015).
    21. Mitchell, K. E., et al. Matrix cells from Wharton's jelly form neurons and glia. Stem Cells. 21 (1), 50-60 (2003).
    22. Mellott, A. J., et al. Nonviral Reprogramming of Human Wharton's Jelly Cells Reveals Differences Between ATOH1 Homologues. Tissue Eng Part A. 21 (11-12), 1795-1809 (2015).
    23. Buytaert, J. A., Johnson, S. B., Dierick, M., Salih, W. H., Santi, P. A. MicroCT versus sTSLIM 3D imaging of the mouse cochlea. J Histochem Cytochem. 61 (5), 382-395 (2013).
    24. Nonoyama, H., et al. Investigation of the ototoxicity of gadoteridol (ProHance) and gadodiamide (Omniscan) in mice. Acta Otolaryngol. 136 (11), 1091-1096 (2016).
    25. Dai, C., et al. Rhesus Cochlear and Vestibular Functions Are Preserved After Inner Ear Injection of Saline Volume Sufficient for Gene Therapy Delivery. J Assoc Res Otolaryngol. , (2017).
    26. Sutherland, A. J., Converse, G. L., Hopkins, R. A., Detamore, M. S. The bioactivity of cartilage extracellular matrix in articular cartilage regeneration. Adv Healthc Mater. 4 (1), 29-39 (2015).

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    Biotechnik Ausgabe 131: Cochlea Haarzelle Gerüst decellularize Wharton Gelee Zellen Gewebe-Engineering Zellkultur
    Ein Protokoll für einem Maus Cochleae für das Innenohr Tissue Engineering
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    Neal, C. A., Nelson-Brantley, J. G., … More

    Neal, C. A., Nelson-Brantley, J. G., Detamore, M. S., Staecker, H., Mellott, A. J. A Protocol for Decellularizing Mouse Cochleae for Inner Ear Tissue Engineering. J. Vis. Exp. (131), e56523, doi:10.3791/56523 (2018).

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