Spectrométrie de masse en tandem
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Visão Geral
En spectrométrie de masse en tandem une biomolécule d’intérêt est isolée d’un échantillon biologique et puis fragmentée en plusieurs sous-unités afin d’aider à expliquer sa composition et la séquence. Ceci est accompli en ayant des spectromètres de masse en série. Le premier spectromètre s’ionise un échantillon et filtre des ions de masse spécifique pour charger le rapport. Ions filtrées sont ensuite fragmentées et passées à un spectromètre de masse deuxième où les fragments sont analysées.
Cette vidéo présente les principes de la spectrométrie de masse, y compris les méthodes de sélection et de dissociation à-rapport de masse. Également montré est une procédure générale pour analyser un composé biochimique par spectrométrie de masse en tandem avec dissociation induite par collision. La section applications couvre réaction sélection, surveillance, détermination des modifications après traduction protéiques et la détection de concentrations de tacrolimus dans le sang.
Liens de spectrométrie de masse tandem ensemble plusieurs étapes de spectrométrie de masse d’abord isoler une biomolécule et ensuite déterminer les aspects de sa composition chimique. Biomolécules ont des structures complexes, rendant difficile de déterminer leur composition moléculaire. Spectrométrie de masse sélectionne une molécule d’intérêt qui est ensuite fragmentée en plusieurs sous-unités, ce qui peuvent aider à expliquer son identification et séquence. Cette vidéo va expliquer les notions de spectrométrie de masse, une procédure générale et certaines de ses utilisations en biochimie.
Spectrométrie de masse commence comme un instrument typique de mass spec : avec une source d’ions, qui convertit l’échantillon en ions et un analyseur de masse, qui sépare les ions basées sur leur rapport masse-à-charge. Un analyseur de masse commun, le quadripôle, permet seulement des ions avec un ratio spécifique, tandis que les autres se bloquer dans les tiges de l’appareil. Les espèces autorisées, appelé l’ion précurseur, sont la biomolécule d’intérêt. L’ion se déplace dans une cellule de collision, généralement un autre quadripôle, où l’énergie est appliquée à fragmenter l’ion dans un schéma prévisible.
Ces fragments se déplacent dans un autre analyseur de masse, comme un temps de vol, qui sépare ces ions « produits ». Les ions produits sont ensuite envoyées au détecteur, comme un instrument de MS normal. Dans le cas d’une protéine inconnue, le spectre résultant contient de nombreux fragments qui se chevauchent, ce qui rend une séquence complète définitive de la biomolécule difficile à générer. Toutefois, le modèle spectral est unique pour une protéine donnée. Logiciel d’analyse compare le spectre d’une base de données de séquences de peptides connus, élucider la protéine inconnue des fragments qui se chevauchent.
Selon l’échantillon et le degré de fragmentation, plusieurs méthodes de fragmentation sont possibles. Fragmentation modèles dépendent de la façon dont l’énergie est transférée, son montant et comment elle est distribuée par l’intermédiaire de l’ion précurseur. L’énergie peut être transférée via des particules neutres, rayonnement ou électrons. À l’aide d’atomes neutres, un processus appelé dissociation induite par collision ou CID, s’attache principalement à la liaison peptidique entre les acides aminés, idéales pour leur identification.
Maintenant que les bases de la technique ont été couverts, regardons CID spectrométrie de masse servant à étudier une composante des enveloppes de la cellule bactérienne.
Comme avec toutes les expériences de spectrométrie de masse, la première étape est d’ioniser l’échantillon. Pour les biomolécules, c’est généralement effectuée avec matrix assisté laser desorption ou ionisation par électronébulisation. Le signal d’ion précurseur est alors optimisé par le réglage de l’optique de l’ion. Une fois cela fait, la cible est isolée et la méthode de fragmentation est choisie, comme le CID.
La force d’une tension appliquée, ce qui accélère l’ion précurseur dans la cellule de collision, affecte le degré de fragmentation. Cette tension est augmentée jusqu’à ce que le précurseur est d’environ 10 % abondance par rapport à l’ion produit plus haute. Plusieurs spectres sont acquis et en moyenne jusqu’à l’obtention d’un rapport signal-bruit suffisant. Le nombre d’analyses nécessaires dépend de l’intensité du signal de l’ion précurseur original et peut varier de 3 à 300.
L’analyte dans cet exemple, le lipide A d’Escherichia coli K-12, eu 19 fragments principaux après CID. Structure générale de lipide de A est bien connue, ce qui permet de logiciel reconstituer la composition spécifique de l’échantillon.
Maintenant que nous avons examiné la procédure, nous allons étudier quelques-unes des façons la spectrométrie de masse en tandem est utilisée en biochimie.
Un mode commun de balayage en spectrométrie de masse est sélectionné de surveillance, ou SRM. En SRM, les deux analyseurs de massives ont été fixés à un ratio de masse de charge sélectionné, en se concentrant sur les ions précurseurs et produits spécifiques. En raison du degré de sensibilité élevée de SRM, les spectres des normes de peptide de concentration connue peuvent être utilisées et par rapport à celle des échantillons inconnus, permettant aux protéines d’intérêt à être quantifié.
Protéines sont couramment modifiés après traduction, généralement par l’ajout de groupes fonctionnels tels que les groupes méthyles, groupes phosphate ou sucres, appelés glycanes. Ils sont importants dans la cellule, processus de signalisation, d’élucider comment les cellules communiquent entre eux. Parce que la spectrométrie de masse des fragments des protéines en éléments plus petits, il est possible de déterminer l’emplacement de la PTM le fragment spécifique ou même d’un acide aminé. Certaines modifications, telles que l’acétylation et triméthylation, sont difficiles à différencier en masse seul, donc séparation chromatographique est exécutée avant la spectrométrie de masse.
Plusieurs analytes dans le sang du patient se trouvent à des concentrations inférieures au seuil de détection pour la spectrométrie de masse typique. Un autre avantage des MRS est qu’il ignore tout sauf un ion de produit, augmenter la sensibilité et l’amélioration de la limite inférieure de détection jusqu’à 100 fois. Dans cet exemple, le médicament immunosuppresseur, tacrolimus, puisse être détecté à 1 ng/ml.
Vous avez juste regardé les vidéo de Jupiter à la spectrométrie de masse. Cette vidéo décrit la théorie de l’instrument, est allé sur une procédure générale et explique certaines des manières que la technique est actuellement utilisée. Merci de regarder !
Procedimento
Declarações
Transcrição
Tandem mass spectrometry links together multiple stages of mass spectrometry to first isolate a biomolecule, and then determine aspects of its chemical makeup. Biomolecules have large, complex structures, making it difficult to determine their molecular composition. Tandem mass spectrometry selects a molecule of interest that is later fragmented into multiple subunits, which can help elucidate its identification and sequence. This video will show the concepts of tandem mass spectrometry, a general procedure, and some of its uses in biochemistry.
Tandem mass spectrometry begins as a typical mass spec instrument: with an ion source, which converts the sample into ions, and a mass analyzer, which separates the ions based on their mass-to-charge ratio. A common mass analyzer, the quadrupole, only allows ions with a specific ratio through, while the others crash into the rods of the apparatus. The species allowed through, called the precursor ion, is the biomolecule of interest. The ion moves into a collision cell, typically another quadrupole, where energy is applied to fragment the ion in a predictable pattern.
These fragments move into another mass analyzer, such as a time-of-flight, which separates these “product ions”. The product ions are then sent to the detector, as in a normal MS instrument. In the case of an unknown protein, the resulting spectrum contains numerous overlapping fragments, making a definitive complete sequence of the biomolecule difficult to generate. However, the spectral pattern is unique for a given protein. Analysis software compares the spectrum to a database of known peptide sequences, elucidating the unknown protein from the overlapping fragments.
Depending on the sample and desired degree of fragmentation, multiple fragmentation methods are possible. Fragmentation patterns depend on how the energy is transferred, its amount, and how it is distributed through the precursor ion. Energy can be transferred via neutral particles, radiation, or electrons. Using neutral atoms, a process called collision-induced dissociation or CID, primarily cleaves at the peptide bond between the amino acids, ideal for their identification.
Now that the basics of the technique have been covered, let’s look at CID tandem mass spectrometry being used to study a component of bacterial cell envelopes.
As with all mass spectrometric experiments, the first step is to ionize the sample. For biomolecules, this is typically done with matrix assisted laser desorption or electrospray ionization. The precursor ion signal is then optimized by tuning of the ion optics. Once done, the target is isolated and the fragmentation method is chosen, such as CID.
The strength of an applied voltage, which accelerates the precursor ion into the collision cell, affects the degree of fragmentation. This voltage is increased until the precursor is roughly 10% abundance compared to the highest product ion. Multiple spectra are acquired and averaged until a sufficient signal-to-noise ratio is achieved. The number of scans needed is dependent on the signal intensity of the original precursor ion and can range from 3 to 300.
The analyte in this example, lipid A from Escherichia coli K-12, had 19 major fragments after CID. Lipid A’s general structure is well known, allowing software to reconstruct the specific composition from the sample.
Now that we’ve looked the procedure, let’s look at some of the ways tandem mass spectrometry is used in biochemistry.
A common scanning mode in tandem mass spectrometry is selected reaction monitoring, or SRM. In SRM, both mass analyzers are fixed to a selected mass-to-charge ratio, focusing on specific precursor and product ions. Because of SRM’s high degree of sensitivity, the spectra of peptide standards of known concentration can be utilized and compared to that of the unknown samples, allowing proteins of interest to be quantified.
Proteins are commonly modified after translation, typically by the addition of functional groups such as methyl groups, phosphate groups, or sugars, known as glycans. These are important in cell signaling processes, elucidating how cells communicate with one another. Because tandem mass spectrometry fragments the proteins into smaller components, it is possible to determine the location of the PTM to the specific fragment or even an amino acid. Some modifications, such as acetylation and trimethylation, are difficult to differentiate by mass alone, so chromatographic separation is performed before the mass spectrometry.
Many analytes in patient’s blood are found at concentrations below the limit of detection for typical mass spectrometry. Another advantage of SRM is that it discards all but one product ion, increasing the sensitivity and enhancing the lower detection limit by up to 100 fold. In this example, the immunosuppressant drug, tacrolimus, could be detected at levels of 1 ng/mL.
You’ve just watched JoVE’s video on tandem mass spectrometry. This video described the theory of the instrument, went over a general procedure, and explained some of the ways the technique is currently being utilized. Thanks for watching!
