Spectrometría de masas de tándem
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Visão Geral
En spectrometry total en tándem biomoléculas de interés es aislada de una muestra biológica y luego se fragmentó en múltiples subunidades con el fin de ayudar a elucidar su composición y secuencia. Esto se logra con espectrómetros de masas en serie. El primer espectrómetro ioniza una muestra y el filtro de iones de una masa específica para cargar cociente. Filtrado iones entonces son fragmentados y pasa a un segundo espectrómetro de masas donde se analizan los fragmentos.
Este video presenta los principios de la espectrometría total en tándem, incluyendo métodos de selección y disociación de ratio de masa. También se muestra es un procedimiento general para el análisis de un compuesto bioquímico usando spectrometry total en tándem con la disociación colisión-inducida. La sección de aplicaciones cubre reacción selección supervisión, determinación de las modificaciones post traducción en proteína y la detección de los niveles de tacrolimus en sangre.
Enlaces de espectrometría de masas tándem juntos múltiples etapas de espectrometría de masas primero aislar una biomolécula y luego determinan los aspectos de su composición química. Biomoléculas tienen estructuras grandes y complejas, lo que hace difícil determinar su composición molecular. Espectrometría de masas tándem selecciona una molécula de interés que más tarde se fragmentó en múltiples subunidades, que pueden ayudar a elucidar su identificación y secuencia. Este video le mostrará los conceptos de la espectrometría total en tándem, un procedimiento general y algunas de sus aplicaciones en bioquímica.
Espectrometría de masas tándem comienza como un típico instrumento masa Especificaciones: con una fuente de iones, que convierte la muestra en iones y un analizador de masas, que separa los iones basados en su relación masa / carga. Un analizador de masa común, el cuadrupolo, sólo permite los iones con una relación específica, mientras que los otros crash en las barras del aparato. Las especies permitidas, llamado ion del precursor, es las biomoléculas de interés. El ion se mueve en una celda de colisión, por lo general otro quadrupole, donde energía se aplica a los iones en un patrón predecible.
Estos fragmentos se trasladan a otro analizador de la masa, como un tiempo de vuelo, que separa a estos “iones del producto”. Los iones producto son enviados al detector, como un instrumento MS normal. En el caso de una proteína desconocida, el espectro resultante contiene numerosos fragmentos solapados, haciendo difícil generar una secuencia completa definitiva de las biomoléculas. Sin embargo, el patrón espectral es único para una determinada proteína. Software de análisis compara el espectro a una base de datos de secuencias de péptidos conocidos, elucidar la proteína desconocida de los fragmentos solapados.
Dependiendo de la muestra y el grado deseado de fragmentación, varios métodos de fragmentación son posibles. Patrones de fragmentación dependen de cómo la energía se transfiere, su cantidad, y cómo se distribuye a través del ion precursor. Energía puede transferirse por medio de radiación y partículas neutras y electrones. Sobre todo utilizando átomos neutrales, un proceso llamado disociación colisión-inducida o CID, hiende en el enlace peptídico entre los aminoácidos, ideales para su identificación.
Ahora que se han cubierto los fundamentos de la técnica, echemos un vistazo a spectrometry total en tándem CID siendo utilizado para el estudio de un componente de los sobres de la célula bacteriana.
Como con todos los experimentos espectrometría de masa, el primer paso es ionizar la muestra. Para biomoléculas, esto normalmente se hace con desorción láser de matriz asistida o de ionización por electrospray. La señal de ion precursor entonces se optimiza mediante la regulación de la óptica del ion. Una vez hecho esto, el objetivo es aislado y se elige el método de fragmentación, como el CID.
La fuerza de un voltaje aplicado, que acelera el ion precursor en la celda de colisión, afecta el grado de fragmentación. Esta tensión se incrementa hasta que el precursor es aproximadamente 10% abundancia en comparación con el ion de producto más alto. Múltiples espectros son adquiridos y promedio hasta que se logra una relación señal a ruido suficiente. El número de exploraciones es necesitada depende de la intensidad de la señal del ión precursor original y puede variar de 3 a 300.
Analito en este ejemplo, el lípido A de Escherichia coli K-12, tenía 19 fragmentos principales después del CID. Estructura general de lípido s es bien conocida, que software reconstruir la composición específica de la muestra.
Ahora que hemos mirado el procedimiento, Veamos algunas de las maneras de espectrometría de masas tándem es utilizado en bioquímica.
Un modo común de la exploración en espectrometría de masas tándem es reacción seleccionada supervisión o SRM. En SRM, ambos analizadores de masas están fijados a una relación de masa de la carga seleccionada, centrándose en los iones precursores y productos específicos. Debido a alto grado de sensibilidad de SRM, los espectros de niveles de péptido de concentración conocida pueden ser utilizados y comparada con la de las muestras desconocidas, permitiendo que las proteínas de interés para ser cuantificada.
Las proteínas son modificadas comúnmente después de traducción, normalmente mediante la adición de grupos funcionales como los grupos metilo, grupos fosfato y azúcares, conocidos como glycans. Estos son importantes en procesos de señalización de células elucidar cómo las células se comunican uno con el otro. Como espectrometría de masas tándem fragmentos de las proteínas en componentes más pequeños, es posible determinar la ubicación de la PTM el fragmento específico o incluso un aminoácido. Algunas modificaciones, como la acetilación y trimetilación, son difíciles de distinguir por la masa sola, para que la separación cromatográfica se realiza antes de la espectrometría de masas.
Muchos analitos en sangre del paciente se encuentran en concentraciones por debajo del límite de detección por espectrometría de masas típico. Otra ventaja de SRM es que Descartes todos sino un ion del producto, aumentar la sensibilidad y mejorar el límite de detección inferior en hasta 100 veces. En este ejemplo, el fármaco inmunosupresor tacrolimus, pudo detectarse a nivel de 1 ng/mL.
Sólo has visto video de Zeus en spectrometry total en tándem. Este video describe la teoría del instrumento, fue un procedimiento general y explicó algunas de las maneras que la técnica está siendo utilizada actualmente. ¡Gracias por ver!
Procedimento
Declarações
Transcrição
Tandem mass spectrometry links together multiple stages of mass spectrometry to first isolate a biomolecule, and then determine aspects of its chemical makeup. Biomolecules have large, complex structures, making it difficult to determine their molecular composition. Tandem mass spectrometry selects a molecule of interest that is later fragmented into multiple subunits, which can help elucidate its identification and sequence. This video will show the concepts of tandem mass spectrometry, a general procedure, and some of its uses in biochemistry.
Tandem mass spectrometry begins as a typical mass spec instrument: with an ion source, which converts the sample into ions, and a mass analyzer, which separates the ions based on their mass-to-charge ratio. A common mass analyzer, the quadrupole, only allows ions with a specific ratio through, while the others crash into the rods of the apparatus. The species allowed through, called the precursor ion, is the biomolecule of interest. The ion moves into a collision cell, typically another quadrupole, where energy is applied to fragment the ion in a predictable pattern.
These fragments move into another mass analyzer, such as a time-of-flight, which separates these “product ions”. The product ions are then sent to the detector, as in a normal MS instrument. In the case of an unknown protein, the resulting spectrum contains numerous overlapping fragments, making a definitive complete sequence of the biomolecule difficult to generate. However, the spectral pattern is unique for a given protein. Analysis software compares the spectrum to a database of known peptide sequences, elucidating the unknown protein from the overlapping fragments.
Depending on the sample and desired degree of fragmentation, multiple fragmentation methods are possible. Fragmentation patterns depend on how the energy is transferred, its amount, and how it is distributed through the precursor ion. Energy can be transferred via neutral particles, radiation, or electrons. Using neutral atoms, a process called collision-induced dissociation or CID, primarily cleaves at the peptide bond between the amino acids, ideal for their identification.
Now that the basics of the technique have been covered, let’s look at CID tandem mass spectrometry being used to study a component of bacterial cell envelopes.
As with all mass spectrometric experiments, the first step is to ionize the sample. For biomolecules, this is typically done with matrix assisted laser desorption or electrospray ionization. The precursor ion signal is then optimized by tuning of the ion optics. Once done, the target is isolated and the fragmentation method is chosen, such as CID.
The strength of an applied voltage, which accelerates the precursor ion into the collision cell, affects the degree of fragmentation. This voltage is increased until the precursor is roughly 10% abundance compared to the highest product ion. Multiple spectra are acquired and averaged until a sufficient signal-to-noise ratio is achieved. The number of scans needed is dependent on the signal intensity of the original precursor ion and can range from 3 to 300.
The analyte in this example, lipid A from Escherichia coli K-12, had 19 major fragments after CID. Lipid A’s general structure is well known, allowing software to reconstruct the specific composition from the sample.
Now that we’ve looked the procedure, let’s look at some of the ways tandem mass spectrometry is used in biochemistry.
A common scanning mode in tandem mass spectrometry is selected reaction monitoring, or SRM. In SRM, both mass analyzers are fixed to a selected mass-to-charge ratio, focusing on specific precursor and product ions. Because of SRM’s high degree of sensitivity, the spectra of peptide standards of known concentration can be utilized and compared to that of the unknown samples, allowing proteins of interest to be quantified.
Proteins are commonly modified after translation, typically by the addition of functional groups such as methyl groups, phosphate groups, or sugars, known as glycans. These are important in cell signaling processes, elucidating how cells communicate with one another. Because tandem mass spectrometry fragments the proteins into smaller components, it is possible to determine the location of the PTM to the specific fragment or even an amino acid. Some modifications, such as acetylation and trimethylation, are difficult to differentiate by mass alone, so chromatographic separation is performed before the mass spectrometry.
Many analytes in patient’s blood are found at concentrations below the limit of detection for typical mass spectrometry. Another advantage of SRM is that it discards all but one product ion, increasing the sensitivity and enhancing the lower detection limit by up to 100 fold. In this example, the immunosuppressant drug, tacrolimus, could be detected at levels of 1 ng/mL.
You’ve just watched JoVE’s video on tandem mass spectrometry. This video described the theory of the instrument, went over a general procedure, and explained some of the ways the technique is currently being utilized. Thanks for watching!
