タンデム質量分析法
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Visão Geral
タンデム質量分析法における関心の生体分子は生体試料から分離され、その組成とシーケンスを明らかにするために複数のサブユニットに断片化されました。これは、シリーズの質量分析装置を持っていることで。最初の分光計は、特定質量比を充電するためのサンプルとフィルター イオンをイオン化します。フィルター処理されたイオンは断片化し、フラグメントの分析、2 つ目の質量分析計に渡されます。
このビデオは、質量比の選択と解離のメソッドを含むタンデム質量分析法の原則を紹介します。また生化学的化合物を分析するための一般的な手順で使用しているタンデム質量分析法による衝突誘起解離。アプリケーションでは、監視、タンパク質翻訳後修飾の定量およびタクロリムス血中濃度の検出選択反応を説明します。
タンデム質量分析のリンクが最初に質量分析の複数の段階、生体分子を分離、化学構造の側面を確認して一緒に。生体は、その分子の組成を決定し難い大規模で複雑な構造を持ちます。タンデム質量分析は、後で識別・ シーケンスを明らかに助けることができる複数のサブユニットに断片化している興味の分子を選択します。このビデオでは、生化学のタンデム質量分析法の概念、一般的な手順とその利用方法のいくつかが表示されます。
典型的な仕様質量計測器としてタンデム質量分析を開始: イオン源、イオン、および質量分析器にサンプルを変換するとイオンの質量電荷比に基づいて分離します。他は装置の棒に衝突しながら、共通の質量分析器、四重極は、特定の割合でイオンをのみ使用できます。認められれば、種前駆イオンと呼ばれる興味の生体分子であります。イオンに衝突セル、通常別の四重極、フラグメントを予測可能なパターンでイオンにエネルギーを適用する場所に移動します。
これらのフラグメントは、飛行時間型のこれら「プロダクト イオンを分けるなど、別の質量分析器に移動します。製品イオン、通常 MS の器械のように、検出器に送られます。未知の蛋白質の場合は、結果として得られるスペクトルには生体の決定的な完全なシーケンスを生成困難多数の重複フラグメントが含まれています。しかし、スペクトルのパターンは、特定の蛋白質に一意です。解析ソフトウェアは、重複フラグメントから未知の蛋白質を解明、知られているペプチド配列のデータベースへのスペクトルを比較します。
サンプルと断片化の所望の程度に応じて複数の断片化方式が可能です。断片化のパターンは、エネルギーを転送する方法、その量と前駆イオンを配布する方法に依存します。エネルギーは、中性粒子や放射線、電子を介して転送することができます。主にそれらの識別に最適なアミノ酸間のペプチド結合の切断中性原子、衝突誘起解離または CID と呼ばれるプロセスを使用しています。
今では技術の基礎をカバーしている、細菌の細胞の封筒のコンポーネントを研究に使用されている CID タンデム質量分析法を見てみましょう。
すべての質量分析実験と同様、最初の手順は、サンプルをイオン化するためです。生体分子、マトリックス支援レーザー脱離エレクトロ スプレー イオン化とこれは通常です。前駆物質イオン信号は、イオン光学系のチューニングによって、最適化されます。ターゲットが分離されれば、および断片化メソッドを選択すると、CID など。
衝突のセルに前駆イオンを加速する、電圧印加の強さは、断片化の程度を影響します。前駆体がほぼ最高製品イオンと比較して 10% 豊富になるまで、この電圧が増加します。複数スペクトルが取得され、十分な信号対雑音比を達成するまでの平均します。必要スキャン数は元の前駆イオンの信号強度に依存して、3 から 300 までの範囲をすることができます。
この例では、エシェリヒア属大腸菌 K-12 から脂質 A の検体は、CID 後 19 主なフラグメントを持っていた。リピド A の構造はよく知られている、サンプルから特定の構成を再構築するためのソフトウェアを許可します。
今では手順を見てきた、いくつかの生化学のタンデム質量分析法を使用する方法を見てみましょう。
タンデム質量分析法における一般的なスキャン モードは選択した反応の監視、または SRM です。SRM では、両方の質量分析装置は、前駆体および製品、特定のイオンに焦点を当て、選択した質量電荷比に固定されます。SRM の感度の高いのためペプチド濃度既知の標準スペクトルを利用し、定量化する興味の蛋白質をできるように、未知のサンプルを比較できます。、
タンパク質一般官能基のメチル基、リン酸基、糖鎖と呼ばれる糖などの添加により通常翻訳後変更されます。これらは細胞シグナリング プロセス、細胞が互いに通信する方法の解明に重要です。タンデム質量分析法より小さいコンポーネントに蛋白質をフラグメント化、ため特定のフラグメントまたはアミノ酸も PTM の位置を特定することが可能です。アセチル化とトリメチルなどのいくつかの変更は、クロマト グラフ分離は、質量分析の前に行われるだけで、質量を区別することは困難。
患者の血液で多くの検体は、典型的な質量分析法の検出限界以下の濃度で発見されます。SRM の別の利点は、すべてが 1 つの製品のイオン、感度、検出下限値を最大 100 倍に強化を破棄です。この例では、タクロリムス、免疫抑制薬は、1 ng/mL のレベルで検出できます。
タンデム質量分析法でゼウスのビデオを見てきただけ。このビデオ計測器の理論を説明した、一般的な手順行き、手法が現在使用されている方法のいくつかを説明しました。見てくれてありがとう!
Procedimento
Declarações
Transcrição
Tandem mass spectrometry links together multiple stages of mass spectrometry to first isolate a biomolecule, and then determine aspects of its chemical makeup. Biomolecules have large, complex structures, making it difficult to determine their molecular composition. Tandem mass spectrometry selects a molecule of interest that is later fragmented into multiple subunits, which can help elucidate its identification and sequence. This video will show the concepts of tandem mass spectrometry, a general procedure, and some of its uses in biochemistry.
Tandem mass spectrometry begins as a typical mass spec instrument: with an ion source, which converts the sample into ions, and a mass analyzer, which separates the ions based on their mass-to-charge ratio. A common mass analyzer, the quadrupole, only allows ions with a specific ratio through, while the others crash into the rods of the apparatus. The species allowed through, called the precursor ion, is the biomolecule of interest. The ion moves into a collision cell, typically another quadrupole, where energy is applied to fragment the ion in a predictable pattern.
These fragments move into another mass analyzer, such as a time-of-flight, which separates these “product ions”. The product ions are then sent to the detector, as in a normal MS instrument. In the case of an unknown protein, the resulting spectrum contains numerous overlapping fragments, making a definitive complete sequence of the biomolecule difficult to generate. However, the spectral pattern is unique for a given protein. Analysis software compares the spectrum to a database of known peptide sequences, elucidating the unknown protein from the overlapping fragments.
Depending on the sample and desired degree of fragmentation, multiple fragmentation methods are possible. Fragmentation patterns depend on how the energy is transferred, its amount, and how it is distributed through the precursor ion. Energy can be transferred via neutral particles, radiation, or electrons. Using neutral atoms, a process called collision-induced dissociation or CID, primarily cleaves at the peptide bond between the amino acids, ideal for their identification.
Now that the basics of the technique have been covered, let’s look at CID tandem mass spectrometry being used to study a component of bacterial cell envelopes.
As with all mass spectrometric experiments, the first step is to ionize the sample. For biomolecules, this is typically done with matrix assisted laser desorption or electrospray ionization. The precursor ion signal is then optimized by tuning of the ion optics. Once done, the target is isolated and the fragmentation method is chosen, such as CID.
The strength of an applied voltage, which accelerates the precursor ion into the collision cell, affects the degree of fragmentation. This voltage is increased until the precursor is roughly 10% abundance compared to the highest product ion. Multiple spectra are acquired and averaged until a sufficient signal-to-noise ratio is achieved. The number of scans needed is dependent on the signal intensity of the original precursor ion and can range from 3 to 300.
The analyte in this example, lipid A from Escherichia coli K-12, had 19 major fragments after CID. Lipid A’s general structure is well known, allowing software to reconstruct the specific composition from the sample.
Now that we’ve looked the procedure, let’s look at some of the ways tandem mass spectrometry is used in biochemistry.
A common scanning mode in tandem mass spectrometry is selected reaction monitoring, or SRM. In SRM, both mass analyzers are fixed to a selected mass-to-charge ratio, focusing on specific precursor and product ions. Because of SRM’s high degree of sensitivity, the spectra of peptide standards of known concentration can be utilized and compared to that of the unknown samples, allowing proteins of interest to be quantified.
Proteins are commonly modified after translation, typically by the addition of functional groups such as methyl groups, phosphate groups, or sugars, known as glycans. These are important in cell signaling processes, elucidating how cells communicate with one another. Because tandem mass spectrometry fragments the proteins into smaller components, it is possible to determine the location of the PTM to the specific fragment or even an amino acid. Some modifications, such as acetylation and trimethylation, are difficult to differentiate by mass alone, so chromatographic separation is performed before the mass spectrometry.
Many analytes in patient’s blood are found at concentrations below the limit of detection for typical mass spectrometry. Another advantage of SRM is that it discards all but one product ion, increasing the sensitivity and enhancing the lower detection limit by up to 100 fold. In this example, the immunosuppressant drug, tacrolimus, could be detected at levels of 1 ng/mL.
You’ve just watched JoVE’s video on tandem mass spectrometry. This video described the theory of the instrument, went over a general procedure, and explained some of the ways the technique is currently being utilized. Thanks for watching!
