Espectrometria de Massa em Tandem
English
COMPARTILHAR
Visão Geral
Em conjunto espectrometria de massa, uma biomolécula de interesse é isolada de uma amostra biológica, e então fragmentada em múltiplas subunidades, a fim de ajudar a elucidar sua composição e sequência. Isso é feito por ter espectrômetros de massa em série. O primeiro espectrômetro ioniza uma amostra e filtrar íons de uma proporção de massa específica para carga. Os íons filtrados são então fragmentados e passados para um segundo espectrômetro de massa onde os fragmentos são analisados.
Este vídeo introduz os princípios da espectrometria de massa tandem, incluindo métodos de seleção em massa e dissociação. Também é mostrado um procedimento geral para analisar um composto bioquímico usando espectrometria de massa tandem com dissociação induzida por colisão. A seção de aplicações abrange monitoramento de reação de seleção, determinação de modificações de pós-tradução de proteínas e detecção de níveis de tacrolimus no sangue.
A espectrometria de massa tandem une múltiplos estágios de espectrometria de massa para primeiro isolar uma biomolécula e, em seguida, determinar aspectos de sua composição química. As biomoléculas possuem estruturas grandes e complexas, dificultando a determinação de sua composição molecular. A espectrometria de massa tandem seleciona uma molécula de interesse que é posteriormente fragmentada em múltiplas subunidades, o que pode ajudar a elucidar sua identificação e sequência. Este vídeo mostrará os conceitos de espectrometria de massa tandem, um procedimento geral, e alguns de seus usos na bioquímica.
A espectrometria de massa tandem começa como um instrumento típico de especificação de massa: com uma fonte de íons, que converte a amostra em íons, e um analisador de massa, que separa os íons com base em sua relação massa-carga. Um analisador de massa comum, o quadrupole, só permite íons com uma proporção específica através, enquanto os outros batem nas hastes do aparelho. A espécie permitida, chamada íon precursor, é a biomolécula de interesse. O íon se move para uma célula de colisão, tipicamente outro quadrúpole, onde a energia é aplicada para fragmentar o íon em um padrão previsível.
Esses fragmentos se movem para outro analisador em massa, como um tempo de voo, que separa esses “íons de produto”. Os íons do produto são então enviados para o detector, como em um instrumento normal de MS. No caso de uma proteína desconhecida, o espectro resultante contém numerosos fragmentos sobrepostos, tornando difícil de gerar uma sequência completa definitiva da biomolécula. No entanto, o padrão espectral é único para uma determinada proteína. O software de análise compara o espectro a um banco de dados de sequências de peptídeos conhecidos, elucidando a proteína desconhecida dos fragmentos sobrepostos.
Dependendo da amostra e do grau desejado de fragmentação, são possíveis múltiplos métodos de fragmentação. Os padrões de fragmentação dependem de como a energia é transferida, sua quantidade e como ela é distribuída através do íon precursor. A energia pode ser transferida através de partículas neutras, radiação ou elétrons. Usando átomos neutros, um processo chamado dissociação induzida por colisão ou CID, principalmente se inclina na ligação peptídeo entre os aminoácidos, ideal para sua identificação.
Agora que o básico da técnica foi coberto, vamos olhar para a espectrometria de massa de CID tandem sendo usada para estudar um componente de envelopes de células bacterianas.
Como em todos os experimentos espectrométricos de massa, o primeiro passo é ionizar a amostra. Para biomoléculas, isso é tipicamente feito com desagrecção assistida por laser matricial ou ionização eletrospray. O sinal de íon precursor é então otimizado pela sintonia da óptica de íon. Uma vez feito, o alvo é isolado e o método de fragmentação é escolhido, como CID.
A força de uma tensão aplicada, que acelera o íon precursor na célula de colisão, afeta o grau de fragmentação. Esta tensão é aumentada até que o precursor esteja aproximadamente 10% de abundância em comparação com o íon mais alto do produto. Vários espectros são adquiridos e mediados até que uma relação sinal-ruído suficiente seja alcançada. O número de varreduras necessárias depende da intensidade do sinal do íon precursor original e pode variar de 3 a 300.
O analito neste exemplo, lipídio A de Escherichia coli K-12, tinha 19 fragmentos principais após CID. A estrutura geral do Lipid A é bem conhecida, permitindo que o software reconstrua a composição específica da amostra.
Agora que olhamos o procedimento, vamos ver algumas das maneiras que a espectrometria de massa é usada na bioquímica.
Um modo de varredura comum em espectrometria de massa em conjunto é o monitoramento de reação selecionado ou SRM. No SRM, ambos os analisadores em massa são fixados a uma relação de massa-carga selecionada, com foco em íons precursores e de produtos específicos. Devido ao alto grau de sensibilidade do SRM, os espectros de padrões de peptídeos de concentração conhecida podem ser utilizados e comparados com os das amostras desconhecidas, permitindo quantificar proteínas de interesse.
As proteínas são comumente modificadas após a tradução, tipicamente pela adição de grupos funcionais como grupos de metila, grupos de fosfato ou açúcares, conhecidos como glicanos. Estes são importantes nos processos de sinalização celular, elucidando como as células se comunicam entre si. Como a espectrometria de massa tandem fragmenta as proteínas em componentes menores, é possível determinar a localização do PTM para o fragmento específico ou mesmo um aminoácido. Algumas modificações, como acetilação e trimetilação, são difíceis de diferenciar apenas por massa, por isso a separação cromatografia é realizada antes da espectrometria de massa.
Muitos analitos no sangue do paciente são encontrados em concentrações abaixo do limite de detecção para espectrometria de massa típica. Outra vantagem do SRM é que ele descarta todos, exceto um íon de produto, aumentando a sensibilidade e aumentando o limite de detecção mais baixo em até 100 vezes. Neste exemplo, a droga imunossupressor, tacrolimus, poderia ser detectada a níveis de 1ng/mL.
Você acabou de assistir o vídeo de JoVE sobre espectrometria de massa. Este vídeo descreveu a teoria do instrumento, passou por cima de um procedimento geral, e explicou algumas das maneiras que a técnica está sendo utilizada atualmente. Obrigado por assistir!
Procedimento
Declarações
Transcrição
Tandem mass spectrometry links together multiple stages of mass spectrometry to first isolate a biomolecule, and then determine aspects of its chemical makeup. Biomolecules have large, complex structures, making it difficult to determine their molecular composition. Tandem mass spectrometry selects a molecule of interest that is later fragmented into multiple subunits, which can help elucidate its identification and sequence. This video will show the concepts of tandem mass spectrometry, a general procedure, and some of its uses in biochemistry.
Tandem mass spectrometry begins as a typical mass spec instrument: with an ion source, which converts the sample into ions, and a mass analyzer, which separates the ions based on their mass-to-charge ratio. A common mass analyzer, the quadrupole, only allows ions with a specific ratio through, while the others crash into the rods of the apparatus. The species allowed through, called the precursor ion, is the biomolecule of interest. The ion moves into a collision cell, typically another quadrupole, where energy is applied to fragment the ion in a predictable pattern.
These fragments move into another mass analyzer, such as a time-of-flight, which separates these “product ions”. The product ions are then sent to the detector, as in a normal MS instrument. In the case of an unknown protein, the resulting spectrum contains numerous overlapping fragments, making a definitive complete sequence of the biomolecule difficult to generate. However, the spectral pattern is unique for a given protein. Analysis software compares the spectrum to a database of known peptide sequences, elucidating the unknown protein from the overlapping fragments.
Depending on the sample and desired degree of fragmentation, multiple fragmentation methods are possible. Fragmentation patterns depend on how the energy is transferred, its amount, and how it is distributed through the precursor ion. Energy can be transferred via neutral particles, radiation, or electrons. Using neutral atoms, a process called collision-induced dissociation or CID, primarily cleaves at the peptide bond between the amino acids, ideal for their identification.
Now that the basics of the technique have been covered, let’s look at CID tandem mass spectrometry being used to study a component of bacterial cell envelopes.
As with all mass spectrometric experiments, the first step is to ionize the sample. For biomolecules, this is typically done with matrix assisted laser desorption or electrospray ionization. The precursor ion signal is then optimized by tuning of the ion optics. Once done, the target is isolated and the fragmentation method is chosen, such as CID.
The strength of an applied voltage, which accelerates the precursor ion into the collision cell, affects the degree of fragmentation. This voltage is increased until the precursor is roughly 10% abundance compared to the highest product ion. Multiple spectra are acquired and averaged until a sufficient signal-to-noise ratio is achieved. The number of scans needed is dependent on the signal intensity of the original precursor ion and can range from 3 to 300.
The analyte in this example, lipid A from Escherichia coli K-12, had 19 major fragments after CID. Lipid A’s general structure is well known, allowing software to reconstruct the specific composition from the sample.
Now that we’ve looked the procedure, let’s look at some of the ways tandem mass spectrometry is used in biochemistry.
A common scanning mode in tandem mass spectrometry is selected reaction monitoring, or SRM. In SRM, both mass analyzers are fixed to a selected mass-to-charge ratio, focusing on specific precursor and product ions. Because of SRM’s high degree of sensitivity, the spectra of peptide standards of known concentration can be utilized and compared to that of the unknown samples, allowing proteins of interest to be quantified.
Proteins are commonly modified after translation, typically by the addition of functional groups such as methyl groups, phosphate groups, or sugars, known as glycans. These are important in cell signaling processes, elucidating how cells communicate with one another. Because tandem mass spectrometry fragments the proteins into smaller components, it is possible to determine the location of the PTM to the specific fragment or even an amino acid. Some modifications, such as acetylation and trimethylation, are difficult to differentiate by mass alone, so chromatographic separation is performed before the mass spectrometry.
Many analytes in patient’s blood are found at concentrations below the limit of detection for typical mass spectrometry. Another advantage of SRM is that it discards all but one product ion, increasing the sensitivity and enhancing the lower detection limit by up to 100 fold. In this example, the immunosuppressant drug, tacrolimus, could be detected at levels of 1 ng/mL.
You’ve just watched JoVE’s video on tandem mass spectrometry. This video described the theory of the instrument, went over a general procedure, and explained some of the ways the technique is currently being utilized. Thanks for watching!
