Tandem-Massenspektrometrie
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Visão Geral
In Tandem-Massenspektrometrie ist ein Biomolekül Interesse von einer biologischen Probe isoliert und dann in mehrere Untereinheiten fragmentiert, um zu helfen, seine Zusammensetzung und Reihenfolge aufzuklären. Dies wird erreicht, indem er Massenspektrometer in Serie. Das erste Spektrometer ionisiert eine Probe und Filter-Ionen einer bestimmten Masse, Verhältnis zu berechnen. Gefilterte Ionen sind dann fragmentiert und an einem zweiten Massenspektrometer wo sind die Fragmente analysiert.
Dieses Video stellt die Grundsätze der Tandem-Massenspektrometrie, einschließlich Auswahl und Dissoziation Methoden Masse-Verhältnis. Auch ist ein allgemeines Verfahren für die Analyse einer biochemischen Verbindung Tandem-Massenspektrometrie mit Kollision-induzierte Dissoziation verwenden. Anwendungsabschnitt behandelt die Auswahl Reaktion Überwachung, Ermittlung des Proteins nach Übersetzung Änderungen und Erkennung von Tacrolimus-Spiegel im Blut.
Tandem-Massenspektrometrie verbindet mehrere Phasen der Massenspektrometrie zuerst ein Biomolekül zu isolieren, und ermitteln Sie Aspekte von seiner chemischen Zusammensetzung. Biomoleküle haben große, komplexe Strukturen, macht es schwierig, ihre molekulare Zusammensetzung zu bestimmen. Tandem-Massenspektrometrie wählt ein Molekül des Interesses, die später in mehrere Untereinheiten, die helfen können, seine Identifikation und Sequenz erläutern fragmentiert ist. Dieses Video zeigt die Konzepte der Tandem-Massenspektrometrie, ein allgemeines Verfahren, und einige ihrer Anwendungen in der Biochemie.
Tandem-Massenspektrometrie beginnt als ein typisches Masse Spec Instrument: mit einer Ionenquelle, der die Probe in Ionen und eine Masse Analysator umwandelt, die trennt die Ionen anhand ihrer Masse-Ladungs-Verhältnis. Eine gemeinsame Masse Analysator, Quadrupol, erlaubt nur Ionen mit einem bestimmten Verhältnis durch, während die anderen in die Stäbe des Apparates Absturz. Die Spezies durchgelassen, nennt man das Vorläufer-Ion, das Biomolekül von Interesse. Das Ion bewegt sich in eine Kollision Zelle, in der Regel ein weiteres Quadrupol, wo Energie angewendet wird, um die Ionen in einem vorhersagbaren Muster zu fragmentieren.
Diese Fragmente verschieben in eine andere Masse Analysator, wie ein Time-of-Flight, trennt diese “Produkt-Ionen”. Die Produkt-Ionen werden dann an den Detektor, wie in einem normalen MS-Instrument gesendet. Im Falle eines unbekannten Proteins enthält das resultierende Spektrum zahlreiche überlappende Fragmente, so dass eine endgültige vollständige Sequenz das Biomolekül schwer zu generieren. Allerdings ist die spektrale Muster für ein gegebenes Protein einzigartig. Analyse-Software vergleicht das Spektrum mit einer Datenbank bekannter Peptid Sequenzen, Aufklärung der unbekannten Proteins aus den sich überlappenden Fragmenten.
Je nach der Probe und dem gewünschten Grad der Fragmentierung sind mehrere Fragmentierung Methoden möglich. Fragmentierung Muster hängen davon ab, wie Energie übertragen wird, deren Höhe und Verteilung durch die Vorläufer-Ion. Energie kann über Neutralteilchen, Strahlung oder Elektronen übertragen werden. Mit neutralen Atomen, einen Prozess namens Kollision-induzierte Dissoziation oder CID, bindet sich in erster Linie auf die Peptidbindung zwischen den Aminosäuren, ideal für ihre Identifikation.
Nun, da die Grundlagen der Technik abgedeckt haben, schauen Sie sich bitte an CID Tandemmassenspektrometrie verwendet wird, um eine Komponente der Bakterienzelle Umschläge zu studieren.
Wie bei allen massenspektrometrische Experimente ist der erste Schritt die Probe zu ionisieren. Bei Biomoleküle geschieht dies in der Regel mit Matrix assisted Laser Desorption oder Elektrospray-Ionisation. Die Vorläufer Ionen-Signal wird dann durch tuning der Ionen-Optik optimiert. Ist das erledigt, das Ziel ist isoliert und die Fragmentierung Methode gewählt wird, z. B. CID.
Die Stärke einer angelegten Spannung, die der Vorläufer-Ionen in die Zelle Kollision beschleunigt, wirkt sich den Grad der Fragmentierung. Diese Spannung wird erhöht, bis der Vorläufer etwa 10 % Häufigkeit im Vergleich zu den höchsten Produkt-Ion ist. Mehrere Spektren sind erworben und im Durchschnitt, bis ein ausreichender Signal-Rausch-Verhältnis erreicht ist. Die Anzahl der Scans benötigt ist abhängig von der Signalintensität des ursprünglichen Vorläufer Ions und kann reichen von 3 bis 300.
Der Analyt in diesem Beispiel Lipid A von Escherichia coli k-12, hatte 19 große Fragmente nach CID. Lipid A allgemeine Struktur ist bekannt, dass Software, die spezifische Zusammensetzung aus der Probe zu rekonstruieren.
Nun, da wir das Verfahren geschaut haben, betrachten wir einige der Möglichkeiten, die tandem Massenspektrometrie in der Biochemie verwendet wird.
Ein gemeinsame Scanner-Modus im Tandem-Massenspektrometrie ist ausgewählten Reaktionskontrolle oder SRM. In SRM werden beide Massen-Analysatoren zu einem ausgewählten Masse-Ladungs-Verhältnis, mit Schwerpunkt auf bestimmte Vorläufer und Produkt Ionen fixiert. Wegen SRMs hohes Maß an Sensibilität können die Spektren von Peptid Standards bekannter Konzentration genutzt und im Vergleich zu der unbekannten Proben, so dass Proteine des Interesses quantifiziert werden.
Proteine werden häufig nach der Übersetzung in der Regel durch die Zugabe von funktionellen Gruppen wie Methylgruppen, Phosphatgruppen oder Zucker, bekannt als Glykane geändert. Diese sind wichtig in Zelle signalisieren Prozesse, Aufklärung, wie die Zellen miteinander kommunizieren. Da Tandem-Massenspektrometrie der Proteine in kleinere Komponenten Fragmente, ist es möglich, die Position des PTM bestimmtes Fragment oder sogar eine Aminosäure zu bestimmen. Einige Änderungen, wie z. B. Acetylierung und Trimethylation, sind schwer zu unterscheiden durch Masse allein, so dass chromatographische Trennung vor der Massenspektrometrie durchgeführt wird.
Viele Analyte im Blut des Patienten sind bei Konzentrationen unterhalb der Nachweisgrenze für typische Massenspektrometrie gefunden. Ein weiterer Vorteil des SRM ist, dass es alle außer einem Produkt Ion, die Empfindlichkeit zu erhöhen und verbessern die untere Nachweisgrenze von bis zu 100-fach verwirft. In diesem Beispiel konnte das Immunsuppressivum Drogen, Tacrolimus, in Stufen von 1 ng/mL nachgewiesen werden.
Sie haben nur Jupiters Video auf Tandem-Massenspektrometrie angesehen. Dieses Video beschrieben die Theorie des Instruments, ging über ein allgemeines Verfahren und erläutert einige der Möglichkeiten, die die Technik derzeit genutzt wird. Danke fürs Zuschauen!
Procedimento
Declarações
Transcrição
Tandem mass spectrometry links together multiple stages of mass spectrometry to first isolate a biomolecule, and then determine aspects of its chemical makeup. Biomolecules have large, complex structures, making it difficult to determine their molecular composition. Tandem mass spectrometry selects a molecule of interest that is later fragmented into multiple subunits, which can help elucidate its identification and sequence. This video will show the concepts of tandem mass spectrometry, a general procedure, and some of its uses in biochemistry.
Tandem mass spectrometry begins as a typical mass spec instrument: with an ion source, which converts the sample into ions, and a mass analyzer, which separates the ions based on their mass-to-charge ratio. A common mass analyzer, the quadrupole, only allows ions with a specific ratio through, while the others crash into the rods of the apparatus. The species allowed through, called the precursor ion, is the biomolecule of interest. The ion moves into a collision cell, typically another quadrupole, where energy is applied to fragment the ion in a predictable pattern.
These fragments move into another mass analyzer, such as a time-of-flight, which separates these “product ions”. The product ions are then sent to the detector, as in a normal MS instrument. In the case of an unknown protein, the resulting spectrum contains numerous overlapping fragments, making a definitive complete sequence of the biomolecule difficult to generate. However, the spectral pattern is unique for a given protein. Analysis software compares the spectrum to a database of known peptide sequences, elucidating the unknown protein from the overlapping fragments.
Depending on the sample and desired degree of fragmentation, multiple fragmentation methods are possible. Fragmentation patterns depend on how the energy is transferred, its amount, and how it is distributed through the precursor ion. Energy can be transferred via neutral particles, radiation, or electrons. Using neutral atoms, a process called collision-induced dissociation or CID, primarily cleaves at the peptide bond between the amino acids, ideal for their identification.
Now that the basics of the technique have been covered, let’s look at CID tandem mass spectrometry being used to study a component of bacterial cell envelopes.
As with all mass spectrometric experiments, the first step is to ionize the sample. For biomolecules, this is typically done with matrix assisted laser desorption or electrospray ionization. The precursor ion signal is then optimized by tuning of the ion optics. Once done, the target is isolated and the fragmentation method is chosen, such as CID.
The strength of an applied voltage, which accelerates the precursor ion into the collision cell, affects the degree of fragmentation. This voltage is increased until the precursor is roughly 10% abundance compared to the highest product ion. Multiple spectra are acquired and averaged until a sufficient signal-to-noise ratio is achieved. The number of scans needed is dependent on the signal intensity of the original precursor ion and can range from 3 to 300.
The analyte in this example, lipid A from Escherichia coli K-12, had 19 major fragments after CID. Lipid A’s general structure is well known, allowing software to reconstruct the specific composition from the sample.
Now that we’ve looked the procedure, let’s look at some of the ways tandem mass spectrometry is used in biochemistry.
A common scanning mode in tandem mass spectrometry is selected reaction monitoring, or SRM. In SRM, both mass analyzers are fixed to a selected mass-to-charge ratio, focusing on specific precursor and product ions. Because of SRM’s high degree of sensitivity, the spectra of peptide standards of known concentration can be utilized and compared to that of the unknown samples, allowing proteins of interest to be quantified.
Proteins are commonly modified after translation, typically by the addition of functional groups such as methyl groups, phosphate groups, or sugars, known as glycans. These are important in cell signaling processes, elucidating how cells communicate with one another. Because tandem mass spectrometry fragments the proteins into smaller components, it is possible to determine the location of the PTM to the specific fragment or even an amino acid. Some modifications, such as acetylation and trimethylation, are difficult to differentiate by mass alone, so chromatographic separation is performed before the mass spectrometry.
Many analytes in patient’s blood are found at concentrations below the limit of detection for typical mass spectrometry. Another advantage of SRM is that it discards all but one product ion, increasing the sensitivity and enhancing the lower detection limit by up to 100 fold. In this example, the immunosuppressant drug, tacrolimus, could be detected at levels of 1 ng/mL.
You’ve just watched JoVE’s video on tandem mass spectrometry. This video described the theory of the instrument, went over a general procedure, and explained some of the ways the technique is currently being utilized. Thanks for watching!
