Summary
I dette arbejde beskriver vi protokoller for at undersøge den rolle af ekstracellulære vesikler (EVs) udgivet af Plasmodium falciparum inficeret erytrocytter. Især fokuserer vi på samspillet mellem evt med endotelceller.
Abstract
Malaria er en livstruende sygdom forårsaget af Plasmodium parasitter, med P. falciparum er den mest fremherskende på det afrikanske kontinent og ansvarlig for de fleste malaria-relaterede dødsfald globalt. Flere faktorer, herunder parasit binding i væv, vaskulær dysfunktion og inflammatoriske reaktioner påvirke udviklingen af sygdommen i malaria-inficerede mennesker. P. falciparum-inficerede røde blodlegemer (iRBCs) frigive små ekstracellulære vesikler (EVs) indeholder forskellige former for last molekyler, der mægle patogenese og trådløse kommunikation mellem parasitter og vært. Evt er effektivt taget af celler, hvor de modulere deres funktion. Her kan vi diskutere strategier for at afhjælpe evt rolle i parasit-værtssammenspil. Først, vi beskriver en enkel metode for mærkning og sporing EV internalisering af endotelceller, ved hjælp af en grøn celle linker farvestof. Andet, rapporterer vi en enkel måde at måle permeabilitet på tværs af en endotel celle éncellelag ved hjælp af en fluorescently mærket dextran. Endelig vil vise vi hvordan du undersøge rollen, som små ikke-kodende RNA molekyler i endothelial cellefunktion.
Introduction
Ifølge World Health Organization, der var 212 millioner nye tilfælde af malaria på verdensplan i 2015 og døde ca 429,000 mennesker, især børn under fem år af alder1. De mekanismer, der fører til alvorlig sygdom, der ofte er forbundet med vaskulær dysfunktion, forbliver uklare2. Plasmodium- iRBCs udskiller lille bi-lipid membranen kugler kendt som ekstracellulære vesikler (EVs). Det er kendt at disse evt er potentielt relevant for infektion oparbejde og immunrespons vært til infektion; dog er lidt kendt om den eksakte funktion af disse små blærer under malaria infektion3. Det er muligt, at de spiller to vigtige roller: på den ene side kan de bidrage til patogenesen ved at aktivere makrofager4,5; og på den anden side de kunne mægle cellulære kommunikation mellem parasitter og parasitter og vært6,7. I virkeligheden, kan parasitter overføre proteiner eller nukleinsyrer mellem hinanden via evt. For eksempel, Trypanosoma brucei rhodesiense evt-kan overføre virulens faktor Serum Resistance-Associated (SRA), og kan målrette både andre T. brucei og vært erytrocytter8. Derudover kommunikation P. falciparum- iRBCs mellem hinanden ved at overføre nukleinsyrer inden for evt. Dette giver mulighed for parasitter at optimere og synkronisere sin vækst. Faktisk kunne evt være den store regulator af gametocyte konvertering, og derfor bidrager til reguleringen af transmission etape7.
Ikke kun gøre evt regulere parasitter, de også mægle parasit-værtssammenspil. Vi har for nylig opdaget, at elbiler fra iRBCs indeholder vært-afledte MicroRNA (miRNAs; små RNA arter i rækken af 21-25 nukleotider9), blev taget op af menneskelige endotelceller. MiRNAs i den europæiske volontørtjeneste udgør en stabil kompleks med Ago2 (medlem af RNA-induceret silencing complex), som når leveres til de modtagende celler, er i stand til at specifikt silencing genekspression og påvirker barriereegenskaber celler10. Standardprotokoller er blevet udviklet for at undersøge funktionen af evt. Her beskriver vi først en protokol, der tillader de fluorescerende mærkning af evt at undersøge deres udbredelse af modtagerens celler. Derudover ved hjælp af en Konfokal mikroskop, er det muligt at spore den EV skæbne inde i cellen. Flere fluorescerende farvestoffer kan bruges til at spore evt. Amine-reaktiv farvestof, 5-(and-6)-Carboxyfluorescein diacetat Succinimidyl Ester (CFSE) og Calcein-AM bliver fluorescerende når inde vesikler. Vi foretrækker at bruge etiketten amphiphilic, PKH, fordi det giver en lysere og mere ensartet signal. Denne tilgang giver vigtige oplysninger for at forstå samspillet mellem evt, og modtagerens celler. Mens i nogle tilfælde evt bindes til overfladen af celler, er nogle blærer hurtigt taget. Efter optagelsen levere evt deres ladninger til de celler, hvor de udøve deres lovgivningsmæssige funktioner.
Her, beskriver vi en protokol for at måle den barriere funktion i endothelial celler in vitro- af kvantificere overførsel af en fluorescerende dextran gennem en cellulære éncellelag. Mere følsomme røbestoffer kan bruges såsom radiolabeled markører. De kræver dog særlige forsigtighedsregler for brugen. Andre assays eksisterer for at måle den in vitro- barriere funktion som transendothelial elektrisk modstand (TEER), som måler tight junction integritet. Endelig visualisere ZO-1, et tight junction-protein, ved immunfluorescens tillader vurdering af stram vejkryds integritet som godt10. Da evt er kompleks og heterogen enheder indeholdende flere laster med potentielle lovgivningsmæssige egenskab, er det nyttigt at overexpress en bestemt RNA for at studere dens virkning på den modtagende celle. Derfor, vi også definere en protokol, der sigter mod at skabe stabil cellelinjer udtrykker miRNA interesse10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Humane roede blodlegemer er fremstillet af blod fra raske donorer, efter retningslinjerne i Swissethics (swissethics.ch).
Bemærk: P. falciparum parasit kulturer (3D 7) og EV produktion var tidligere beskrevet i Mbagwu, mfl. 11 fordi P. falciparum er en menneskelig patogen, konsultere de lokale regler for håndtering. Kulturer bør holdes sterilt hele tiden.
1. fluorescens mærkning af evt-
Bemærk: Følgende procedure tager fordel af den mærkning teknologi til stabilt indarbejde en grøn fluorescerende farvestof (PKH67) med store alifatiske hale i regionen lipid af EV membranen. Reaktionen er udført i en 200 µL endelige farvning diskenhed, der indeholder en 20 µM endelige koncentration af PKH67. Udfør alle trin ved stuetemperatur (20-25 ° C)
- Plads 100 µg evt i 1 mL PBS i et microcentrifuge rør.
- Der centrifugeres evt i et microcentrifuge rør ved maksimal hastighed (20.000 x g) i 7 min til pellet.
NOTE: Da hemozoin er til stede i evt, en rød-mørk brunlig pellet bør overholdes. Hvis supernatanten er rødlig, har den europæiske volontørtjeneste mængden. - Efter centrifugering, Aspirér supernatanten omhyggeligt, for at undgå at fjerne enhver evt.
Bemærk: Minimere mængden af resterende buffer til stede før resuspending evt i fortyndingsmiddel C for at øge reproducerbarhed og effektiviteten af farvning. - EV resuspenderes i 100 µL af fortyndingsmiddel C (2 X EV Suspension) og forsigtigt pipette til at forsikre komplet dispersion.
- Forberede et nyt microcentrifuge-rør og tilføje 4 µL af PKH67 ethanoliske farvestof løsning til 100 µL fortyndingsvæske C. Vortex godt at blande. Forberede denne 2 x farvestof løsning (40 µM) umiddelbart før farvningen.
Bemærk: For at undgå heterogene farvning, Tilføj ikke PKH67 ethanoliske farvestof løsning direkte til EV pellet. - Hurtigt, kombinere de 100 µL af 2 X EV Suspension (trin 1.4) med de 100 µL af 2 X farvestof løsning (trin 1,5). Proeven blandes derefter, når der afpipetteres op og ned 10 gange.
- Inkuber EV/farvestof suspension fra trin 1,6 for 5 min beskyttet mod lys og mix af vortexing 3 - 4 gange i løbet af 5 min inkubation.
Bemærk: Inkubere EV/farvestof suspension for længere tid giver ingen fordel, fordi farvning er så hurtige. - Farvning reaktionen standses ved tilføjelse af en tilsvarende mængde (200 µL) serum og inkuberes i 1 min. at give bindende af overskydende farvestof.
Bemærk: Før du stopper det farvning, nedbryder serum fra evt ved centrifugering ved 20.000 x g i 20 min. - Vask 3 gange med PBS og spin-ned på 20.000 x g i 5 min. Resuspend den europæiske volontørtjeneste i 100 µL af PBS til at nå frem til en endelig koncentration på 1 µg/µL.
2. visualisere udbredelsen af elbiler af konfokalmikroskopi
Bemærk: Følgende protokol beskriver sporing af EV internalisering af endothelceller dyrkes på glas coverslips. I endothelial celler er semi-udødeliggjort menneskelige knoglemarv Endothelial cells som beskrevet i12.
- Arbejder i et sterilt miljø, pels coverslips med et overskud af 0,01% poly-L-lysin i 10 min. ved stuetemperatur (RT).
- Opsug den poly-L-lysin løsning og tillade coverslips at tørre helt.
- Udføre en levedygtig endotel celletal benytter Trypan blå udstødelse og en hemocytometer.
- Overføre 1 x 105 endotelceller i 1 mL af komplet endotel celle vækstmedium indeholdende Supplement Mix til den poly-L-lysin-belagte coverslips og lad celler vokse til en éncellelag.
Bemærk: Medium indeholder vækstfaktorer, der tillader cellerne til at danne en éncellelag og danner stramme kryds. - Når cellerne danner en éncellelag, omhyggeligt Aspirér medium og tilsættes 1 mL frisk medium at vaske cellerne. Gentag vask en gang mere. Tilsæt 50 µg for PKH67-mærket evt og Inkuber i 4 h.
Bemærk: For at finde det optimale tidspunkt for optagelse, et tidsforløb kan udføres. - Efter 4 h, Aspirér medium, og cellerne vaskes 3 gange med PBS til at fjerne overskydende og ubundne evt. Fix cellerne med 3% PARAFORMALDEHYD løsning i PBS for 15 min.
Bemærk: Methanol kan forstyrre actin under optagelsen processen. Derfor er det bedst at undgå enhver methanol, der indeholder fikseringsmidler eller andre opløsningsmidler fikseringsmidler. Det anbefales at bruge methanol-fri formaldehyd som fiksativ. - Vaske cellerne 3 gange med PBS. Tilføj forsigtigt 250 µL af 0,1% Triton X-100 i PBS til permeabilize celler. Der inkuberes ved RT i 5 min.
- Vask 3 gange med PBS. Tilføj 400 µL blokerende buffer (5% BSA i PBS) i 30 min på RT for at blokere ikke-specifik binding.
- Vaske cellerne en gang med PBS. Forbered Farvningsopløsningen ved at fortynde 5 µL af phalloidin stamopløsning i 200 µL PBS/1% BSA pr. hver dække slip. Med pipette overfoeres 200 µL af Farvningsopløsningen på coverslip, og der inkuberes i 20 min. på RT.
- Vask 3 gange med PBS. Counterstain DNA for 30 s med Hoechst 33342 i en endelig koncentration på 2 µg/mL i 200 µL af PBS.
- Vask 2 x coverslip ved at tilføje 400 µL af PBS. Omhyggeligt fange coverslip med pincet og vend det på toppen af en dråbe antifade montering medier på et glas dias. Fjern forsigtigt den overskydende medie med en serviet og forsegle hver side med neglelak.
- Gemme diasene beskyttet mod lys ved 4 ° C.
- Visualisere celler ved hjælp af en Konfokal mikroskop på laser excitationer 405, 488 og 543 nm og en 63 X, 1,3 NA olieobjektiv med fluorescerende emissioner ved 450-470 nm (blå), 505-530 nm (grøn) og 620 nm.
Bemærk: Typisk F-actin farvning resultaterne er vist i figur 1.
3. endotel celle permeabilitet
Bemærk: Endotel celle permeabilitet vurderes ved at måle overførsel af rhodaminfilteret B isothiocyanat-dextran (gennemsnitlig MW 70.000) i endothelial celle éncellelag. Dextran giver et fremragende værktøj til at studere vaskulær permeabilitet.
- Grev levedygtige endothelial celler ved hjælp af 0,4% Trypan blå udstødelse og en hemocytometer.
- Plade endotelceller med en tæthed på 0,6 x 105 celler til sammenløbet i 24-godt vævskultur skær (0.4 µm porestørrelse) og henstår uforstyrret i mindst 5 dage til at danne differentieret monolag. Opdater medium hver anden dag.
- Når cellerne kommer til en éncellelag, indlæse den europæiske volontørtjeneste (50 µg i 1 mL) på den øverste kammer. Tilføj rodamin-dextran til den øverste fordybning i en endelig koncentration på 20 mg/mL. Inkuber celler ved 37 ° C med 5% CO2.
- Overvåge overførsel af de fluorescerende dextran til bunden godt ved at måle fluorescens emission fra 40 µL medium delprøver. Oprette multi etiket mikrotiterplade læser på 544 nm excitations- og 590 nm for målinger.
Bemærk: Mængden af diffust dextran kan kvantificeres ved hjælp af kalibreringskurver etableret med stamopløsningen. Derudover kan kinetic eksperimenter udføres ved at fjerne små prøver af det ydre kammer medium under et tidsforløb (figur 2). Selv uden nogen form for behandling, vil dextran diffuse gennem celle éncellelag.
4. Bestem Puromycin følsomhed
Bemærk: Før transducing cellelinjer med lentivirus, det er vigtigt at fastslå kill kurven af en valgte stof til at bestemt cellelinie. For at bestemme det minimumsbeløb for drug koncentration nødvendigt at dræbe alle celler, udføre en dosis svar eksperiment ved hjælp af trinvise doser af den valgte medicin. Fordi hver pattedyr cellelinie har en forskellig følsomhed, før eksperimenter, bestemmes den optimale koncentration af antibiotika ved at udvikle kill kurve titrering som beskrevet nedenfor.
- Tælle celler ved hjælp af hemocytometer. Resuspend endotelceller ved en koncentration på 1 x 105 celler/mL i komplet endotel celle vækstmedium indeholdende Supplement Mix.
- Plade 1 x 104 celler til en 96-brønd plade i en endelige mængden af 100 µL i Endothelial celle vækstmediet.
- Tilsæt 100 µL af medium indeholdende antibiotika for at opnå en koncentration på 0,1-10 µg/mL (Se figur 3).
- Undersøge cellers levedygtighed hver 2 dage under et lysmikroskop ved hjælp af en 20 X mål. Kultur cellerne i 10-14 dage og erstatte de medier, der indeholder puromycin hver 2-3 dage afhængig af cellevækst.
- Tilsæt 10 µL/brønd MTS reagens til hver brønd, mix, og Inkuber i 4 timer ved 37 ° C i standard dyrkningsbetingelserne.
- Ryste pladen kort på en shaker og måler absorbansen af behandlede og ubehandlede celler ved hjælp af en pladelæseren på 490 nm (figur 3).
5. transduktion i Endothelial celler med Lentiviral vektor
- Plade 1 x 105 endotelceller i 1 mL af komplette mellemstore dagen før transduktion. Udføre transduktion, når cellerne har nået 50-80% confluency.
- Tø lentivirus på isen, og gøre delprøver af den virale lagre til at undgå at fryse-tø cykler. Spin ned materiale på 200 x g til 30 s i rør før åbning for at undgå spild.
- Tilføje hexadimethrine methylbromid til celler i en endelig koncentration på 8 µg/mL.
Bemærk: Hexadimethrine bromid hjælper transduktion effektivitet, men i nogle tilfælde kan det være giftigt for celler. Derfor bør den optimale koncentration bestemmes ved at udføre en aflivning kurve før transduktion. - Swirl plade forsigtigt at blande. Tilføje den passende mængde af virale partikler (mellem 0,5-2 x 106 partikler) på en egnet mangfoldighed af infektion (MOI) og slyng plade forsigtigt i 30 s til at blande.
- Der centrifugeres celle-viral partikel mix i centrifuger på RT i 45 min. ved 300 x g at øge transduktion effektivitet. Inkuber celle-viral partikel blanding ved 37 ° C natten over.
- Fjern forsigtigt den virale partikel-holdige medium og kassér passende. Erstatte det med friske, pre varmede komplet næringssubstratet.
- Starte udvælgelsen med puromycin den anden dag: fjerne medium og erstatte det med friske medium, der indeholder den korrekte koncentration af puromycin som bestemt tidligere i sektion 4 (figur 3).
- Høste celler efter puromycin valg og isolere RNA bruger et RNA isolering kit efter fabrikantens anvisninger.
- Udføre cDNA syntese med den valgte miRNAs ved hjælp af en reverse transkription kit (Se Tabel af materialer).
- Opsætning af qPCR reaktion efter de citerede protokol13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her beskriver vi protokoller for at undersøge interaktioner evt med værtsceller. Optagelsen af fluorescently mærket evt overvåges af Konfokal mikroskopi (figur 1). Endotelceller tage effektivt evt, men inkubationstiden med evt kan være optimeret til at spore i optrækket. For en bedre lokalisering af evt inde i cellerne, pletten actin med phalloidin. Næste, vi bruger et filter membran på toppen som en éncellelag i endothelial celler vokser. Rodamin B isothiocyanat-dextran er anvendt på den øverste kammer i filter membran og derefter permeabilitet af i endothelial éncellelag måles ved at overvåge overførsel af de fluorescerende dextran i bunden kammer (figur 2A). Typisk, permeabilitet af i endothelial celler er påvirket ved inkubering med en stigende mængde af evt (figur 2B). Det er vigtigt at dyrke celler i flere dage for at sikre de vil danne et éncellelag, ellers farvestoffet vil hurtigt diffuse gennem brøndene. Det er vigtigt at bemærke, at selv uden behandling, dextran vil diffuse langsomt gennem celle éncellelag.
MicroRNA er centrale elementer af evt- og efter overførsel til de modtagende celler, de regulerer genekspression. For at undersøge specifikt miRNAs rolle, er det meget nyttigt at overexpress dem i den modtagende cellelinie. Her beskriver vi, hvordan du transduce miRNAs i endothelial celler. Det første trin består af bestemmelse af koncentrationen af puromycin, der dræber endotelceller for at vælge stabilt transduced celler (figur 4A). Endelig, kan niveauet for udtryk for miRNAs kontrolleret og valideret af qPCR (figur 4B).
Figur 1: evt er taget af endothelceller. Renset evt var mærket i grøn med PKH67 og inkuberes i 4 timer med en éncellelag i endothelial celler. Ubehandlet endotelceller bruges som en negativ kontrol. Efter omfattende vask for at fjerne ubundne evt, blev cellerne farves med phalloidin at plette actin (rød) og Hoechst 33342 at plette kernen (blå). Cellerne blev observeret af Konfokal mikroskopi. Billeder blev taget ved hjælp af en laser Konfokal mikroskop og en 63 x 1,3 NA olie mål. Hoechst 33342 er begejstrede ved 405 nm og med emissioner opsamles på 450-470 nm (blå); PKH67 er glade på 488 nm, emissioner opsamles på 505-530 nm (grøn); og Phalloidin-594 er glade på 543 nm, emissioner opsamles på 620 nm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: effekten af EV optagelse på endotel barriere. (A) skematisk af diffusion af rhodaminfilteret-mærket dextran: endotelceller dyrkes til sammenløbet på toppen af et filter membran, den fluorescerende dextran er anvendt til den øverste kammer og diffunderer over tid gennem membranen. Evt virkning på permeabilitet er vurderet efter tilføjelsen af elbiler til den øverste kammer ved at måle hastigheden af diffusion af dextran til bunden kammer. (B) en stigende mængde af evt-inkuberes med endotelceller. Overførsel af rhodaminfilteret-mærket dextran på tværs af en trans-godt membran over tid giver mulighed for permeabilitet målinger. Permeabilitet på tværs i endothelial lag øges betydeligt efter 2 h inkubation med 50 og 100 µg/mL af evt. Data repræsenterer middelværdien (± s.e.m.) fra 3 forsøg. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: titreringen af puromycin. Stamopløsningen af puromycin (10 mg/mL) fortyndes i RPMI 1640 suppleret med 10% varme-inaktiverede (56 ° C, 30 min) føtalt kalveserum, 2 mM glutamin, 1 mM natrium pyruvat, 100 U/mL penicillin/streptomycin. Ialt 15 µL er tilføjet til 10 mL af medie i røret A. Derefter er 7,5 mL af opløsningen fra tube A blandet til 2,5 mL af RPMI til rør B. Endelig, 100 µL af fortynding er tilføjet til 100 µL af celler til at give en endelig koncentration på 7,5 µL/mL, 5,62 µL/mL og så videre. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Generation i endothelial celler overekspression miR451a. (A) bestemmelse af drab kurven for puromycin på endotelceller. Endotelceller blev inkuberet med puromycin på stigende doser. Levedygtighed blev målt ved MTS assay efter 72 timer. Data repræsenterer middelværdien (± s.e.m.) af én repræsentativ eksperiment. (B) RNA'er afledt af endothelceller overekspression miR451a eller en negativ kontrol blev høstet og miR451a afskriften var kvantificeres ved Real-Time PCR. qPCR resultater er normaliseret af den 2-Ct metode bruger U6 som en husholderske gen og udtrykt som mener (± s.e.m.) (n = 3 forsøg). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flere parasitter, herunder Toxoplasma, Trypanosoma, Leishmania og Trichomonas udløser frigivelsen af evt af inficerede vært-cellen. Afhængigt af patogener, kan den frigivne EVs modulere immunrespons vært eller mægle cellulære kommunikation mellem parasitter6. Der er imidlertid lidt beviser tyder på, hvordan disse små blærer bidrage til malaria sygdom. Her har vi beskrevet flere måder at undersøge funktionen evt under Plasmodium infektion. For eksempel kan evt optagelse af modtagerens celler i vivo overvåges effektivt ved mærkning dem med PKH67 fluorescerende farvestof. Flere kontrolelementer skal udføres for at sikre specificiteten af mærkning. Det er vigtigt at bemærke, at når blandet med fortyndingsmiddel C, PKH67 farvestoffet tendens til at form aggregater, og det er derfor nødvendigt at medtage en kontrol med farvestof alene uden evt at bestemme uspecifik farvning. Konfokal mikroskopi er metoden til valg at skelne mellem vesikler bundet til overfladen og virkelig internaliseret af de modtagende celler. Desuden, giver det et fremragende værktøj til at spore og overvåge antallet af vesikler taget af celler. Men det er uklart hvor evt behandles i den modtagende celler14; Derfor udfører et tidsforløb bruge tidspunkter af 2, 4 og 8 h, kan være meget nyttigt for at bestemme de optimale betingelser for optagelse. Tilsætning af subcellulært rum markører kan bruges til at spore evt inde i cellerne af Konfokal mikroskopi. EV optagelse har vist sig at forekomme via membran fusion eller endocytose15. Fusion kan overvåges af mærkning evt med octadecyl rodamin B (R18). Fusion af evt med cellulære membraner resultater i fortyndingen af R18, hvilket fører til en forøgelse af fluorescens16. Optagelsen af evt ved endocytose kan studeres ved hjælp af specifikke hæmmere af actin, mikrotubulus og dynamin10.
For at studere evt fysiologi, er det muligt at mærke iRBCs direkte med PKH farvestoffer og co kultur iRBCs med endotelceller. Problemet her er, at cellerne kræver forskellige medier og gas kompositioner og mængden af EV overførsel kan være lavt. Derudover kan vesikulære proteiner sammensmeltet med en fluorescerende tag udtrykkes i donor celler in vitro- og in vivo. Men, så vidt det ikke er blevet testet med iRBCs
Inficerede røde blodlegemer er cytoadherent til microvasculature af hjernen, i en proces, der menes at være ansvarlig for at forårsage cerebral malaria17. Overførsel af parasitten materiale via evt er derfor sandsynligvis vil påvirke endotelceller og dermed vaskulære funktion18. I vitro assay beskrevet her, er en nem måde at undersøge nogle af de grundlæggende egenskaber i endothelial celler, som for eksempel dets permeabilitet19. Supplerende test som TEER eller immunfarvning med ZO-1 kan give mere information om tight junction integritet10.
Derudover viser i vitro model sig for at være et effektivt redskab til at studere de molekylære mekanismer bag den trådløse kommunikation mellem parasitter og værtsceller. Udover optagelsen, denne opsætning giver mulighed for undersøgelse af de molekylære mekanismer involveret i denne proces. For eksempel, har vi fulgt overførsel af miR451a til acceptor cellerne af Real-Time PCR og fluorescerende i situ hybridisering. Derudover beskriver vi hvordan man kan generere cellelinjer overekspression en bestemt miRNA, at direkte adresse rollen, disse små RNA i vaskulære funktion10. Der skal foretages flere kontrolelementer, herunder test ikke-transduced celler, da transduktion, selv kan påvirke den cellefunktion. MiRNA hæmmere kan desuden bruges til at neutralisere effekten af miRNAs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev økonomisk støttet delvis af Novartis grundlaget for medicinsk - og biologiske forskning (til PYMS), Gottfried og Julia Bangerter-Rhyner-Stiftung (til MW og PYMS) og forskning pulje af Fribourg Universitet (til PYMS). Yderligere tilskud omfatter den schweiziske regering Excellence stipendier til udenlandske forskere (til KAB og SM). Vi takker Isabelle Fellay og Solange Kharoubi Hess for teknisk support.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Mini Kit | Sigma-Aldrich | MINI67-1KT | |
| Diluent C | Sigma-Aldrich | G8278 | |
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| PBS | ThermoFisher - Gibco | 10010023 | |
| Phalloidin CF594 | Biotium | #00045 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher | H3570 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher | P36934 | |
| Rhodamine B isothiocyanate–Dextran | ThermoFisher | R9379-250MG | |
| Insert with PET membrane transparent Falcon for plate 24 wells | Falcon | 353095 | |
| Endothelial Cell Growth Medium MV | Promocell | C-22020 | |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma-Aldrich | P9620-10ML | |
| MTS Cell Proliferation Colorimetric Assay Kit | Biovision | K300-500 | |
| hexadimethrine bromide | Sigma-Aldrich | 107689-10G | |
| MISSION Lenti microRNA, Human hsa-miR-451a | Sigma-Aldrich | HLMIR0583 | |
| MISSION Lenti microRNA, ath-miR416, Negative Control 1 Transduction Particles | Sigma-Aldrich | NCLMIR001 | |
| MISSION Lenti microRNA, Human | Sigma-Aldrich | NCLMIR0001 | |
| Leica TCS SP5 | Leica Microsystems | ||
| miRNeasy mini Kit | Qiagen | 217004 | |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit 1000 reactions | ThermoFisher | 4366597 | |
| hsa-mir-451a RT/750 PCR rxns | ThermoFisher | 001141 | |
| U6 snRNA | ThermoFisher | 001973 | |
| TaqMan Universal Master Mix II, with UNG | ThermoFisher | 4440038 | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | ThermoFisher | 4376600 |
References
- WHO. WHO Malaria Report 2015. , (2015).
- Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. The pathogenic basis of malaria. Nature. 415 (6872), 673-679 (2002).
- Mantel, P. Y., Marti, M. The role of extracellular vesicles in Plasmodium and other protozoan parasites. Cell Microbiol. 16 (3), 344-354 (2014).
- Couper, K. N., et al. Parasite-derived plasma microparticles contribute significantly to malaria infection-induced inflammation through potent macrophage stimulation. PLoS Pathog. 6 (1), e1000744 (2010).
- Schofield, L., Grau, G. E.
- Mantel, P. Y., et al. Malaria-infected erythrocyte-derived microvesicles mediate cellular communication within the parasite population and with the host immune system. Cell Host Microbe. 13 (5), 521-534 (2013).
- Regev-Rudzki, N., et al. Cell-cell communication between malaria-infected red blood cells via exosome-like vesicles. Cell. 153 (5), 1120-1133 (2013).
- Szempruch, A. J., et al. Extracellular Vesicles from Trypanosoma brucei Mediate Virulence Factor Transfer and Cause Host Anemia. Cell. 164 (1-2), 246-257 (2016).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
- Mantel, P. Y., et al. Infected erythrocyte-derived extracellular vesicles alter vascular function via regulatory Ago2-miRNA complexes in malaria. Nat Commun. 7, 12727 (2016).
- Mbagwu, S., Walch, M., Filgueira, L., Mantel, P. Y. Production and Characterization of Extracellular Vesicles in Malaria. Methods Mol Biol. 1660, 377-388 (2017).
- Schweitzer, K. M., et al. Characterization of a newly established human bone marrow endothelial cell line: distinct adhesive properties for hematopoietic progenitors compared with human umbilical vein endothelial cells. Lab Invest. 76 (1), 25-36 (1997).
- Wong, W., Farr, R., Joglekar, M., Januszewski, A., Hardikar, A. Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs. J Vis Exp. (98), (2015).
- Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake. J Extracell Vesicles. 3, (2014).
- French, K. C., Antonyak, M. A., Cerione, R. A. Extracellular vesicle docking at the cellular port: Extracellular vesicle binding and uptake. Semin Cell Dev Biol. 67, 48-55 (2017).
- Montecalvo, A., et al. Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes. Blood. 119 (3), 756-766 (2012).
- Idro, R., Jenkins, N. E., Newton, C. R. Pathogenesis, clinical features, and neurological outcome of cerebral malaria. Lancet Neurol. 4 (12), 827-840 (2005).
- Jambou, R., et al. Plasmodium falciparum adhesion on human brain microvascular endothelial cells involves transmigration-like cup formation and induces opening of intercellular junctions. PLoS Pathog. 6 (7), e1001021 (2010).
- Zhou, W., et al. Cancer-secreted miR-105 destroys vascular endothelial barriers to promote metastasis. Cancer Cell. 25 (4), 501-515 (2014).
