Summary
בעבודה זו, אנו מתארים פרוטוקולים לחקור את התפקיד של שלפוחית חוץ-תאית (EVs) שפורסמו על ידי הפלזמודיום falciparum זיהום אריתרוציטים. בפרט, אנו מתמקדים האינטראקציות של EVs עם תאי אנדותל.
Abstract
מלריה היא מחלה מסכנת חיים הנגרמת על ידי טפילים הפלזמודיום , עם falciparum פ להיות הכי נפוצים ביבשת אפריקה, רוב מקרי מוות הקשורים מלריה ברחבי העולם. מספר גורמים, לרבות טפיל פחמיות רקמות בתפקוד כלי הדם, תגובות דלקתיות להשפיע על התפתחות המחלה אצל אנשים נגועים במלריה. פ falciparum-תאי דם אדומים (iRBCs) נגוע לשחרר שלפוחית קטנה חוץ-תאית (EVs) המכילים סוגים שונים של מולקולות מטען המתווכות פתוגנזה ו סלולר תקשורת בין טפילים של המארח. EVs ביעילות שנלקחה על ידי תאים שבהם הם לווסת את תפקידם. כאן נדון אסטרטגיות כדי לטפל את התפקיד של EVs באינטראקציות טפיל-פונדקאי. ראשית, אנו מתארים שיטה פשוטה עבור תיוג ומעקב EV הפנמה על-ידי תאי אנדותל, באמצעות צבע מקשר תא ירוק. שנית, מדווחים דרך פשוטה כדי למדוד את חדירות מעבר חד שכבתי תאי אנדותל באמצעות לתוספי שכותרתו fluorescently. לבסוף, אנו מראים כיצד לחקור את התפקיד של לא קידוד RNA מולקולות קטנות בתפקוד תאי אנדותל.
Introduction
על פי ארגון הבריאות העולמי, היו 212 מיליון מקרים חדשים של מלריה ברחבי העולם בשנת 2015, כ 429,000 אנשים מתו, בעיקר ילדים מתחת לגיל חמש שנים של גיל1. המנגנונים למחלות חמורות, אשר מזוהה לעתים קרובות עם חוסר תפקוד כלי הדם, נותר מעורפל2. הפלזמודיום- iRBCs מפרישים כדורים קטנים bi-השומנים קרום המכונה שלפוחית חוץ-תאית (EVs). זה ידוע כי אלה EVs שעשוי להיות רלוונטי לתהליך זיהום וכדי התגובה החיסונית מארח לזיהום; עם זאת, מעט מאוד ידוע על הפונקציה המדויק של אלה שלפוחית קטנה במהלך מלריה זיהום3. זה אפשרי כי הם משחקים שני תפקידים חשובים: מצד אחד, הם עשויים לתרום בפתוגנזה על ידי הפעלת מקרופאגים4,5; מצד שני, הם עשויים לתווך תקשורת סלולרית בין טפילים ובין טפילים מארח6,7. למעשה, טפילים יכולים להעביר חלבונים או חומצות גרעין בין אחד לשני דרך EVs. לדוגמה, Trypanosoma brucei rhodesiense EVs יכול להעביר התקפה אלימה פקטור Serum Resistance-Associated (ההזמנות) ולאחר ניתן לייעד אריתרוציטים גם אחרים brucei טי וגם מארח8. יתר על כן, falciparum פ- iRBCs תקשורת בין אחד לשני על ידי העברת חומצות גרעין בתוך EVs. דבר זה מאפשר הטפילים למטב ולסנכרן את הצמיחה שלה. למעשה, EVs עשוי להיות הרגולטורים העיקריים של המרה gametocyte, לכן לתרום ברגולציה של שידור שלב7.
לא רק לעשות EVs לווסת הטפילים, הם גם לתווך טפיל-פונדקאי אינטראקציות. לאחרונה גילינו כי EVs מ iRBCs מכילים מארח-derived מיקרו Rna (miRNAs; מינים RNA קטנים בטווח של 21-25 נוקלאוטידים9) שנלקחו על ידי תאי אנדותל אדם. MiRNAs ב- EVs טופס אורווה מורכבים עם Ago2 (חבר של RNA-induced שתיקת מורכבים), אשר ברגע מועברת לתאי הנמען, הוא מסוגל במיוחד ביטוי גנים ואף להשפיע על מכשול מאפייני תאים10. פרוטוקולים סטנדרטיים פותחו כדי לחקור את הפונקציה של EVs. כאן, נתאר תחילה פרוטוקול המאפשר תיוג פלורסנט של EVs לחקור ספיגת שלהם על ידי תאים הנמען. בנוסף, באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי, אפשרי לעקוב אחר גורלם של EV בתוך התא. מספר צבעי פלורסנט יכול לשמש כדי לעקוב אחר EVs. לצבוע אמין-ריאקטיבי, 5-(and-6)-Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl אסתר (CFSE), Calcein-אם הופכים פלורסנט פעם אחת בתוך השלפוחיות המוגלתיות. אנחנו מעדיפים להשתמש בתווית amphiphilic, PKH, כי זה נותן אות אחיד יותר ויותר בהיר. גישה זו מספקת מידע חשוב להבין את האינטראקציות בין EVs ותאים הנמען. אמנם במקרים מסוימים EVs לאגד פני השטח של התאים, יש שלפוחית נלקחים במהירות. על תפיסה, EVs להעביר מטענים שלהם התאים, שבהם הם מפעילים את הפונקציות התקינה שלהם.
כאן, אנו מתארים את פרוטוקול כדי למדוד את הפונקציה מכשול של ה תאי אנדותל במבחנה על ידי לכימות בהעברת לתוספי פלורסנט דרך טפט הסלולר. ניתן להשתמש המשדרים יותר רגישים כגון סמני radiolabeled. עם זאת, הם דורשים זהירות מיוחדת לשימוש. מבחני אחרים קיימים כדי למדוד את הפונקציה מכשול במבחנה כגון transendothelial ההתנגדות החשמלית (TEER), אשר מודד צמוד לצומת שלמות. סוף סוף להמחיש זואי-1, חלבון צמוד לצומת, על-ידי immunofluorescence מאפשרת הערכה של שלמות צומת חזק כמו גם10. מאז EVs הם ישויות הטרוגנית ומורכבת המכיל מספר מטענים עם פוטנציאל מאפיין רגולטוריות, זה שימושי כדי overexpress של RNA ספציפיים כדי לחקור את השפעתו על התא הנמען. לכן, אנחנו גם להגדיר פרוטוקול אשר מטרתה ליצור שורות תאים יציב לבטא את miRNA של ריבית10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
RBCs האנושי התקבלו מהדם של תורמים בריא, בהתאם להנחיות של Swissethics (swissethics.ch).
הערה: תרבויות טפיל falciparum פ (3D 7) ו- EV הייצור היו שתואר קודם לכן ב- Mbagwu, et al. 11 מכיוון falciparum פ פתוגניות, להתייעץ עם התקנות מקומיות לטיפול. התרבויות יש לשמור עקר את כל הזמן.
1. זריחה תיוג של EVs
הערה: ההליך הבא מנצל הטכנולוגיה תיוג stably לשלב צבע ירוק פלואורסצנטי (PKH67) עם זנבות אליפטיות גדול באזור השומנים של קרום EV. התגובה מתבצע ב- µL 200 הסופי מכתימה את אמצעי האחסון המכיל ריכוז סופי של 20 מיקרומטר של PKH67. לבצע את כל הצעדים בטמפרטורת החדר (20-25 ° C)
- המקום 100 µg של EVs ב 1 מ"ל של PBS צינור microcentrifuge.
- Centrifuge של EVs צינור microcentrifuge במהירות המרבית (20,000 x g) במשך 7 דקות כדי גלולה.
הערה: מאחר הימוזוין נוכח EVs, גלולה חום אדום-כהה להתייחס. אם תגובת שיקוע אדמדם, ואז EVs יש lysed. - לאחר צנטריפוגה, וארוקן את תגובת שיקוע בקפידה, על מנת למנוע הסרת כל EVs.
הערה: למזער את כמות מתנה בעבר resuspending EVs בדו diluent על מנת להגדיל הפארמצבטית והיעילות של ההכתמה הנותרים מאגר. - Resuspend בגדר EV ב 100 µL של diluent C (2 X ההשעיה EV), pipet בעדינות כדי להבטיח פיזור מלאה.
- הכן צינור microcentrifuge ולהוסיף 4 µL של הפתרון צבע ethanolic PKH67 µL 100 של diluent ג מערבולת טוב לערבב. להכין 2 x צבע פתרון זה (40 מיקרומטר) מייד לפני צביעת.
הערה: כדי להימנע מכתים הטרוגנית, אל תוסיף הפתרון צבע ethanolic PKH67 ישירות בגדר EV. - במהירות, משלבים את µL 100 של 2 X EV ההשעיה (שלב 1.4) µL 100 של 2 X צבע פתרון (שלב 1.5). לאחר מכן, מערבבים את הדגימה על-ידי pipetting למעלה ולמטה 10 פעמים.
- דגירה ההשעיה EV/צבע מהשלב 1.6 עבור 5 דקות מוגן מפני האור ואת תערובת מאת vortexing 3 - 4 פעמים במהלך 5 דקות.
הערה: המקננת ההשעיה EV/צבע משכי זמן ארוכים יותר מספק אין יתרון, כי ההכתמה היא כה מהירה. - עוצרים את התגובה צביעת על-ידי הוספת אמצעי שווה (200 µL) של נסיוב, תקופת דגירה של 1 דקות לאפשר קשירה של עודף צבע.
הערה: לפני העצירה ההכתמה, לרוקן את הסרום של EVs על ידי צנטריפוגה-g x 20,000 עבור 20 דקות. - לשטוף 3 פעמים עם PBS, ספין למטה ב- g 20,000 x עבור 5 דק Resuspend של EVs ב 100 µL ל- PBS להגיע ריכוז הסופי של µg 1/µL.
2. לדמיין את ספיגת של EVs מאת מיקרוסקופיה קונפוקלית
הערה: פרוטוקול הבאים מתאר את המעקב אחר EV הפנמה על-ידי תאי אנדותל גדל על coverslips זכוכית דקה. תאי אנדותל הם תאי אנדותל מח עצם אדם למחצה immortalized כמתואר ב-12.
- עבודה בסביבה סטרילית, מעיל coverslips עם עודף של 0.01% פולי-L-ליזין 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
- האחות הפתרון פולי-L-ליזין ולאפשר את coverslips להתייבש לגמרי.
- לבצע ספירת תאי אנדותל קיימא באמצעות Trypan blue הדרה של hemocytometer.
- העברת תאי אנדותל5 עונה 1 פרק 10 ב 1 מ"ל של שלמה אנדותל תא מדיום הגידול המכיל את שילוב תוספת coverslips זכוכית אקרילית-L-ליזין-מצופה ולתת את התאים לגדול טפט.
הערה: המדיום מכיל חומרים שמאפשרים לתאים כדי ליצור טפט וכדי ליצור צמתי צר. - ברגע התאים יוצרים של טפט, בזהירות תשאף המדיום ולהוסיף 1 מ"ל בינוני טריים לשטוף את התאים. חזור על לשטוף את פעם נוספת. הוסף µg 50 של EVs התווית על-ידי PKH67, דגירה במשך 4 שעות.
הערה: כדי למצוא את נקודת-הזמן אופטימלי עבור ספיגת, זמן-קורס יכול להתבצע. - לאחר 4 שעות, תשאף המדיום, לשטוף את התאים 3 פעמים עם PBS להסיר EVs עודף והלא מאוגדים. לתקן את התאים עם 3% paraformaldehyde פתרון PBS למשך 15 דקות.
הערה: מתנול יכול לשבש אקטין במהלך תהליך קיבוע; לכן, עדיף להימנע כל מתנול המכיל כתות ומייצבים או כתות אחרות ממס מבוסס ומייצבים. מומלץ לשימוש ללא מתנול פורמלדהיד מקבע. - לשטוף את התאים 3 פעמים עם PBS. להוסיף בזהירות 250 µL של 0.1% X-100 Triton ב- PBS כדי permeabilize את התאים. דגירה-RT במשך 5 דקות.
- לשטוף 3 פעמים עם PBS. להוסיף 400 µL מאגר חסימה (BSA 5% ב- PBS) במשך 30 דקות ב- RT לחסום את הכריכה לא ספציפית.
- לשטוף את התאים פעם אחת עם PBS. הכן את הפתרון מכתימים על ידי המדללת 5 µL של הפתרון phalloidin מניות ב- BSA PBS/1% µL 200 לכל שובר כל כיסוי. Pipet 200 µL של הפתרון מכתימים על coverslip דגירה במשך 20 דקות ב- RT.
- לשטוף 3 פעמים עם PBS. Counterstain ה-DNA ל 30 s עם Hoechst 33342-ריכוז הסופי של µg/mL 2 ב- µL 200 ל- PBS.
- לשטוף 2 x coverslip על-ידי הוספת µL 400 ל- PBS. בזהירות לתפוס את coverslip עם מלקחיים, היפוך זה על ירידה של antifade הרכבה מדיה על משטח זכוכית. מסיר בעדינות את המדיה עודף עם רקמה, חותם בכל צד עם לק.
- לאחסן את השקופיות מוגן מפני האור ב 4 º C.
- דמיינו את התאים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי לייזר excitations 405, 488, 543 nm ו 63 X, המטרה שמן נה 1.3 עם פליטת פלורסנט-450-470 nm (כחול), 505-530 ננומטר (ירוק), 620 ננומטר.
הערה: תוצאות צביעת F טיפוסי-אקטין מוצגות באיור1.
3. חדירות תא אנדותל
הערה: תא אנדותל חדירות מוערך על ידי מדידת ההעברה של rhodamine B isothiocyanate-לתוספי (70,000 MW הממוצע) מעבר חד שכבתי תאי אנדותל. לתוספי מספק כלי מצוין ללמוד חדירות כלי דם.
- ספירת תאי אנדותל קיימא באמצעות הדרה Trypan blue 0.4% ו- hemocytometer.
- צלחת תאי אנדותל-צפיפות של 0.6 x5 10, לתאים הנהרות תרביות רקמה 24-ובכן מוסיף (0.4 µm גודל הנקבוביות) ואת השאר ללא הפרעה במשך לפחות 5 ימים ליצור monolayers הבדיל. רענן המדיום בכל יום שני.
- ברגע התאים להגיע עם טפט, לטעון את EVs (50 µg ב 1 מ"ל) על התא העליון. הוסף את rhodamine-לתוספי הבאר העליון-ריכוז סופי של 20 מ"ג/מ"ל. דגירה התאים ב 37 ° C עם 5% CO2.
- לפקח על העברת לתוספי פלורסנט לתחתית היטב על ידי מדידת פליטת קרינה פלואורסצנטית מ 40 µL aliquots בינונית. להגדיר את הקורא מרובה-תוויות microplate 544 עירור nm ו 590 פליטה nm למדידות.
הערה: מכמות לתוספי כשמאירים ניתן לכמת באמצעות עקומות כיול נוסדה עם הפתרון מניות. בנוסף, ניסויים קינטי יכולה להתבצע על-ידי הסרת דגימות קטנות של המדיום קאמרית החיצוני במהלך הזמן (איור 2). אפילו ללא כל טיפול, לתוספי מפוזרת באמצעות טפט התא.
4. לקבוע רגישות Puromycin
הערה: לפני transducing את שורות תאים עם lentivirus, חשוב לקבוע העקומה kill של תרופה שנבחרה עבור הקו לתא מסוים זה. כדי לקבוע את הכמות המינימלית של ריכוז התרופה הכרחי להרוג את כל התאים, לבצע ניסוי תגובה מינון באמצעות מינונים מצטברים של הסם הנבחר. כי כל שורה בתרבית של תאים יש רגישות שונה, לפני ניסויים, ריכוז אופטימלי של האנטיביוטיקה צריך להיקבע על ידי פיתוח להרוג עקומת טיטרציה כפי שיפורט להלן.
- לספור את התאים באמצעות את hemocytometer. Resuspend תאי אנדותל-ריכוז של עונה 1 פרק 105 תאים/מ ל מלאה אנדותל תא מדיום הגידול המכיל את התמהיל תוספת.
- צלחת עונה 1 פרק 104 תאים לתוך צלחת 96-ובכן באמצעי אחסון הסופי של 100 µL של המדיום צמיחת תאי אנדותל.
- להוסיף 100 µL של המדיום המכיל את האנטיביוטיקה בריכוז של 0.1-10 µg/mL (ראה איור 3).
- לבחון את הכדאיות תא כל יומיים תחת מיקרוסקופ אור באמצעות מטרה X 20. התרבות התאים במשך 10-14 ימים ולהחליף שהמדיה המכילה puromycin כל 2-3 ימים בהתאם צמיחת תאים.
- להוסיף 10 µL/טוב MTS ריאגנט לבאר כל, מיקס, ולאחר תקופת דגירה של 4 שעות ב 37 מעלות צלזיוס בתנאים סטנדרטיים תרבות.
- לנער את הצלחת בקצרה על מטרף ולמדוד את ספיגת תאים טיפול ללא טיפול שימוש בקורא צלחת 490 nm (איור 3).
5. התמרה חושית של תאי אנדותל עם וקטור Lentiviral
- צלחת עונה 1 פרק 10 תאי אנדותל5 ב 1 מ"ל של מדיום מלאה ביום שלפני התמרה חושית. לבצע התמרה חושית כאשר התאים הגיעו 50-80% confluency.
- להפשיר את lentivirus על הקרח, ולעשות aliquots של המניות ויראלי להימנע מחזורים ההקפאה-הפשרה. ספין למטה החומר ב 200 x g עבור 30 s, צינורות לפני פתיחת להימנע לשפוך מעל.
- להוסיף hexadimethrine ברומיד התאים-ריכוז סופי של 8 µg/mL.
הערה: Hexadimethrine ברומיד מסייע את היעילות התמרה חושית, אולם במקרים מסוימים זה יכול להיות רעיל לתאים. לכן, ריכוז אופטימלי צריך להיקבע על-ידי ביצוע עיקול הרג לפני התמרה חושית. - מערבולת את הצלחת בעדינות כדי לערבב. להוסיף את הכמות המתאימה של נגיפים (בין 0.5-2 x 106 חלקיקים)-ריבוי מתאים לזיהום (MOI) ו מערבולת את הצלחת בעדינות ב-30 s לערבב.
- Centrifuge את המיקס חלקיק תא-נגיפים בצנטריפוגה ב RT למשך 45 דקות ב- g 300 x כדי להגביר את היעילות התמרה חושית. דגירה התערובת חלקיק תא-נגיפים ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
- הסר בזהירות המדיום המכיל חלקיקים נגיפיים וזורקים כראוי. להחליף אותו טרי, מראש ומחוממת בינוני תרבות שלמה.
- להפעיל את הבחירה עם puromycin ביום השני: להסיר את המדיום ולהחליפו בינוני טריים המכילים את הריכוז הנכון של puromycin כפי שנקבע בעבר בסעיף 4 (איור 3).
- קציר תאים לאחר הבחירה puromycin, לבודד RNA באמצעות של RNA לבודד ערכת ההוראות של היצרן.
- לבצע סינתזה cDNA עם הנבחר miRNAs באמצעות תיעוד הפוכה קיט (ראה את הטבלה של חומרים).
- להגדיר את התגובה qPCR לפי פרוטוקול מצוטט13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כאן, אנו מתארים את הפרוטוקולים לחקור את האינטראקציות של EVs עם התאים המארחים. ספיגת של EVs fluorescently שכותרתו נמצא בפיקוח מיקרוסקופיה קונפוקלית (איור 1). תאי אנדותל תופסים ביעילות EVs, אולם ניתן למטב את זמן הדגירה עם EVs כדי לעקוב אחר תפיסה. עבור לוקליזציה טוב יותר של EVs בתוך התאים, כתם אקטין עם phalloidin. בשלב הבא, אנו משתמשים קרום מסנן ובנוסף צומח טפט של תאי אנדותל. Rhodamine B isothiocyanate-לתוספי מוחל על התא העליון של קרום מסנן, ואז החדירות של טפט אנדותל נמדד על ידי ניטור העברת לתוספי פלורסנט אל החדר התחתון (איור 2 א). בדרך כלל, החדירות של תאי אנדותל מושפע על דגירה עם כמות הולכת וגדלה של EVs (איור 2B). חשוב לגדל את התאים במשך מספר ימים לוודא שהם ייצרו טפט, אחרת שלצבוע במהירות טשטוש דרך הבארות. חשוב לציין כי גם ללא טיפול, לתוספי מפוזרת לאט באמצעות טפט התא.
מיקרו Rna הם רכיבי מפתח של EVs, לאחר העברת תאים הנמען, הם להסדיר ביטוי גנים. על מנת לבדוק באופן ספציפי את תפקיד miRNAs, זה מאוד שימושי כדי overexpress אותם בשורה תא הנמען. כאן נתאר כיצד מגלי miRNAs לתאי אנדותל. הצעד הראשון מורכב לקביעת הריכוז של puromycin זה הורג תאי אנדותל כדי לבחור את התאים stably transduced (איור 4A). לבסוף רמת הביטוי של miRNAs יכול להיות נשלט, אומת על-ידי qPCR (איור 4B).
איור 1: EVs שנלקחה על ידי תאי אנדותל- EVs מטוהרים הודבקו תוויות ירוק עם PKH67, ואת הדגירה במשך 4 שעות עם טפט תאי אנדותל. ללא טיפול תאי אנדותל משמשים פקד שלילי. אחרי כביסה נרחב כדי להסיר EVs לא מאוגד, התאים היו מוכתמים phalloidin כתם אקטין (אדום) ו Hoechst 33342 כדי להכתים את הגרעין (כחול). התאים נצפו על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. התמונות צולמו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי לייזר ומטרה שמן נה 63 x 1.3. Hoechst 33342 רוגשת ב 405 ננומטר, עם פליטת שייאסף 450-470 nm (כחול); PKH67 הוא נרגש-488 ננומטר, פליטת שייאסף 505-530 ננומטר (ירוק); ו Phalloidin-594 רוגשת-543 nm, פליטת שייאסף 620 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: השפעת EV ספיגת על המכשול אנדותל. (א) תיאור סכמטי של פעפוע של התווית על-ידי rhodamine לתוספי: תאי אנדותל הם מגדלים את הנהרות על קרום מסנן, לתוספי פלורסנט חלה על התא העליון והיא מפזרת לאורך זמן באמצעות הקרום. ההשפעה של EVs על חדירות שקובעת לאחר התוספת של EVs לתא העליון על ידי מדידת קצב פעפוע של לתוספי לתא התחתון. (B) הגדלת כמות של EVs מודגרת עם תאי אנדותל. העברת לתוספי התווית על-ידי rhodamine, על-פני קרום הטרנס-טוב לאורך זמן מאפשרת חדירות מדידות. חדירות לאורך השכבה אנדותל הוא גדל באופן משמעותי לאחר שעתיים של דגירה עם µg 50 ו- 100/mL של EVs. נתונים מייצגים אומר (± s.e.m.) מ- 3 ניסויים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: טיטור של puromycin. הפתרון מניות של puromycin (10 mg/mL) הוא מדולל ב RPMI 1640 בתוספת 10% חום-לא פעיל (56 ° C, 30 דקות) העובר עגל סרום, גלוטמין 2 מ מ, 1 מ מ נתרן פירובט, פניצילין U/mL 100/סטרפטומיצין.... סך של 15 µL מתווסף 10 מ"ל של מדיום בצינור א לאחר מכן 7.5 mL של הפתרון צינור א מעורב 2.5 מ של RPMI אל הרכבת התחתית B. לבסוף, µL 100 של הדילול יתווספו 100 µL של תאים לתת ריכוז סופי של 7.5 µL/mL, 5.62 µL/mL וכן הלאה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: דור של תאי אנדותל overexpressing miR451a. (א) קביעת העקומה הריגה של puromycin על תאי אנדותל. תאי אנדותל היו מודגרות עם puromycin בהגברת מינונים. הכדאיות נמדדה על ידי MTS assay לאחר 72 h. הנתונים מייצגים את הממוצע (± s.e.m.) ניסוי נציג אחד. (B) RNAs נגזרים מתאי אנדותל overexpressing miR451a או פקד שלילי נקטפו, בתמליל miR451a הייתה לכמת באמצעות PCR בזמן אמת. qPCR תוצאות מנורמל בשיטה 2-Ct באמצעות U6 כמו גן משק הבית, הביע אומר (± s.e.m.) (n = 3 ניסויים). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כמה טפילים, לרבות Toxoplasma, Trypanosoma, לישמניה Trichomonas לעורר על שחרורו של EVs התא המארח נגועים. בהתאם פתוגנים, EVs שפורסמו ניתן לווסת את התגובה החיסונית מארח או לתווך תקשורת סלולרית בין טפילים6. ובכל זאת, יש מעט עדויות רומז כיצד אלה שלפוחית קטנה לתרום מחלת המלריה. . הנה, שתיארנו במספר דרכים כדי לחקור את הפונקציה של EVs במהלך זיהום הפלזמודיום . למשל, תפיסה של EVs על ידי תאים הנמען ויוו ניתן לנטר ביעילות על ידי תיוג אותם עם תיוג הפלורסנט PKH67. מספר פקדים חייב להתבצע כדי להבטיח יחודיות של תיוג. חשוב לציין כי ברגע מעורבב עם diluent C, לצבוע PKH67 נוטה טופס אגרגטים, לכן זה חייב לכלול פקד עם לצבוע לבד בלי EVs כדי לקבוע ההכתמה שאינם ספציפיים. מיקרוסקופיה קונפוקלית היא השיטה של בחירה כדי להבדיל בין שלפוחית שמאוגד אל פני השטח והפנמתי באמת על ידי תאים הנמען. בנוסף, הוא מספק כלי מצוין כדי לעקוב אחר מספר שלפוחית נלקח על ידי התאים. עם זאת, עדיין לא ברור איך EVs מעובדים ב תאים הנמען14; לכן, ביצוע קורס זמן באמצעות נקודות זמן של 2, 4 ו- 8 שעות, עשוי להיות שימושי מאוד כדי לקבוע את התנאים אופטימליים עבור ספיגת. התוספת של סמנים תא subcellular יכול לשמש כדי לעקוב אחר של EVs בתוך התאים על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. ספיגת EV הוכח להתרחש דרך ממברנה היתוך או אנדוציטוזה15. היתוך גרעיני יכול לפקח על-ידי תיוג EVs עם octadecyl rhodamine B (R18). הפיוז'ן של EVs עם התוצאות ממברנות הסלולר בדילול R18, מה שמוביל לעלייה פלורסצנטיות16. ספיגת של EVs על ידי אנדוציטוזה ניתן יהיה ללמוד על-ידי שימוש מעכבים ספציפיים של אקטין microtubule, dynamin10.
ללמוד הפיזיולוגיה של EVs, זה אפשרי לתייג את iRBCs ישירות עם צבעים PKH, תרבות משותפת של iRBCs עם תאי אנדותל. הבעיה כאן היא כי התאים דורשים מדיה שונים, יצירות גז ואת מידת EV העברה עשוי להיות נמוך. יתר על כן, חלבונים vesicular התמזגו עם תגית פלורסנט יכול להתבטא תורם תאי במבחנה , בתוך vivo. עם זאת, עד כה זה לא נבדק עם iRBCs
RBCs נגועים הם cytoadherent כדי microvasculature המוח, בתהליך נחשב אחראי לגרום מלריה מוחין17. לכן, העברת הטפיל חומר דרך EVs היא עשויה להשפיע על תאי אנדותל, תפקוד כלי הדם ולכן18. וזמינותו במבחנה המתוארים כאן, מספק דרך קלה כדי לחקור כמה תכונות בסיסיות של תאי אנדותל, לדוגמה שלה חדירות19. בדיקות נוספות כגון TEER או immunostaining עם זואי-1 יכול לספק מידע נוסף אודות תקינות צומת חזק10.
יתר על כן, המודל במבחנה הופך להיות כלי רב עוצמה כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים מאחורי התקשורת הסלולרית בין טפילים ותאים המארח. מלבד תפיסה, תוכנית התקנה זו מאפשר החקירה של המנגנונים המולקולריים המעורבים בתהליך זה. לדוגמה, אנו יש פיקוח על העברת miR451a על התאים מקבל ע י PCR בזמן אמת פלורסנט בחיי עיר הכלאה. בנוסף, אנו מתארים כיצד ליצור שורות תאים overexpressing miRNA מסוים, לפנות ישירות את התפקיד של RNA קטנים אלה תפקוד כלי הדם10. עם זאת, מספר פקדים צריכה להתבצע לרבות בדיקות תאים שאינם transduced, מאז התמרה חושית עצמו עשוי להשפיע על הפונקציה התאית. יתר על כן, מעכבי miRNA יכול לשמש כדי לנטרל את השפעת miRNAs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
מחקר זה מבחינה כלכלית נתמך בחלקה על ידי קרן נוברטיס רפואי - ואת המחקר הביולוגי (כדי פים), של גוטפריד, יוליה Bangerter-Rhyner-Stiftung (ל MW, פים) של הבריכה מחקר של האוניברסיטה של פריבורג (כדי פים). מענקים נוספים כוללים המלגות מצוינות הממשלה השוויצרית עבור חוקרים זרים (כדי KAB ו- SM). אנו מודים איזבל Fellay, הס Kharoubi סולנג לקבלת תמיכה טכנית.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Mini Kit | Sigma-Aldrich | MINI67-1KT | |
| Diluent C | Sigma-Aldrich | G8278 | |
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| PBS | ThermoFisher - Gibco | 10010023 | |
| Phalloidin CF594 | Biotium | #00045 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher | H3570 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher | P36934 | |
| Rhodamine B isothiocyanate–Dextran | ThermoFisher | R9379-250MG | |
| Insert with PET membrane transparent Falcon for plate 24 wells | Falcon | 353095 | |
| Endothelial Cell Growth Medium MV | Promocell | C-22020 | |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma-Aldrich | P9620-10ML | |
| MTS Cell Proliferation Colorimetric Assay Kit | Biovision | K300-500 | |
| hexadimethrine bromide | Sigma-Aldrich | 107689-10G | |
| MISSION Lenti microRNA, Human hsa-miR-451a | Sigma-Aldrich | HLMIR0583 | |
| MISSION Lenti microRNA, ath-miR416, Negative Control 1 Transduction Particles | Sigma-Aldrich | NCLMIR001 | |
| MISSION Lenti microRNA, Human | Sigma-Aldrich | NCLMIR0001 | |
| Leica TCS SP5 | Leica Microsystems | ||
| miRNeasy mini Kit | Qiagen | 217004 | |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit 1000 reactions | ThermoFisher | 4366597 | |
| hsa-mir-451a RT/750 PCR rxns | ThermoFisher | 001141 | |
| U6 snRNA | ThermoFisher | 001973 | |
| TaqMan Universal Master Mix II, with UNG | ThermoFisher | 4440038 | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | ThermoFisher | 4376600 |
References
- WHO. WHO Malaria Report 2015. , (2015).
- Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. The pathogenic basis of malaria. Nature. 415 (6872), 673-679 (2002).
- Mantel, P. Y., Marti, M. The role of extracellular vesicles in Plasmodium and other protozoan parasites. Cell Microbiol. 16 (3), 344-354 (2014).
- Couper, K. N., et al. Parasite-derived plasma microparticles contribute significantly to malaria infection-induced inflammation through potent macrophage stimulation. PLoS Pathog. 6 (1), e1000744 (2010).
- Schofield, L., Grau, G. E.
- Mantel, P. Y., et al. Malaria-infected erythrocyte-derived microvesicles mediate cellular communication within the parasite population and with the host immune system. Cell Host Microbe. 13 (5), 521-534 (2013).
- Regev-Rudzki, N., et al. Cell-cell communication between malaria-infected red blood cells via exosome-like vesicles. Cell. 153 (5), 1120-1133 (2013).
- Szempruch, A. J., et al. Extracellular Vesicles from Trypanosoma brucei Mediate Virulence Factor Transfer and Cause Host Anemia. Cell. 164 (1-2), 246-257 (2016).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
- Mantel, P. Y., et al. Infected erythrocyte-derived extracellular vesicles alter vascular function via regulatory Ago2-miRNA complexes in malaria. Nat Commun. 7, 12727 (2016).
- Mbagwu, S., Walch, M., Filgueira, L., Mantel, P. Y. Production and Characterization of Extracellular Vesicles in Malaria. Methods Mol Biol. 1660, 377-388 (2017).
- Schweitzer, K. M., et al. Characterization of a newly established human bone marrow endothelial cell line: distinct adhesive properties for hematopoietic progenitors compared with human umbilical vein endothelial cells. Lab Invest. 76 (1), 25-36 (1997).
- Wong, W., Farr, R., Joglekar, M., Januszewski, A., Hardikar, A. Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs. J Vis Exp. (98), (2015).
- Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake. J Extracell Vesicles. 3, (2014).
- French, K. C., Antonyak, M. A., Cerione, R. A. Extracellular vesicle docking at the cellular port: Extracellular vesicle binding and uptake. Semin Cell Dev Biol. 67, 48-55 (2017).
- Montecalvo, A., et al. Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes. Blood. 119 (3), 756-766 (2012).
- Idro, R., Jenkins, N. E., Newton, C. R. Pathogenesis, clinical features, and neurological outcome of cerebral malaria. Lancet Neurol. 4 (12), 827-840 (2005).
- Jambou, R., et al. Plasmodium falciparum adhesion on human brain microvascular endothelial cells involves transmigration-like cup formation and induces opening of intercellular junctions. PLoS Pathog. 6 (7), e1001021 (2010).
- Zhou, W., et al. Cancer-secreted miR-105 destroys vascular endothelial barriers to promote metastasis. Cancer Cell. 25 (4), 501-515 (2014).
