Summary
Bu çalışmada, enfekte Plasmodium falciparum eritrositler tarafından yayımlanan ekstraselüler veziküller (EVs) rolünü araştırmak için iletişim kurallarını açıklar. Özellikle, endotel hücreleri ile EVs etkileşimleri odaklanmak.
Abstract
Sıtma bir yaşamı tehdit eden hastalık Plasmodium parazitler tarafından neden, P. falciparum ile en yaygın Afrika kıtasında ve en sıtma ile ilgili boyunca genel olarak varlık. Doku, vasküler disfonksiyon ve inflamatuar yanıt parazit tutma gibi birçok etkene sıtma enfekte kişilerde hastalığın evrim etkilemek. P. falciparum-virüslü kırmızı kan hücreleri (iRBCs) yayın çeşitli türde Patogenez ve hücresel iletişim parazitler ve ev sahibi arasında arabuluculuk kargo molekülleri içeren küçük hücre dışı veziküller (EVs). EVs verimli bir şekilde hangi onlar işlevlerine modüle hücreleri tarafından alınır. Burada EVs rolde parazit-ana etkileşimler adrese stratejileri tartışmak. İlk olarak, biz bir yeşil hücre bağlayıcı boya kullanarak etiketleme ve endotel hücreleri tarafından EV içselleştirilmesi izlemek için basit bir yöntem açıklanmaktadır. İkinci olarak, biz geçirgenliği endotel hücre monolayer fluorescently etiketli dextran kullanarak ölçmek için basit bir yol raporu. Son olarak, biz küçük kodlamayan RNA molekülleri endotel hücre işlevindeki rolünü araştırmak nasıl göstereceğim.
Introduction
Dünya Sağlık Örgütü göre 2015 yılında dünya çapında sıtma 212 milyon yeni vaka vardı ve yaklaşık 429,000 kişi öldü, esas olarak yaş1beş yaş altı çocuklar. Genellikle vasküler disfonksiyonu ile ilişkili olan, ağır hastalıklar için önde gelen mekanizmalar kötü tanımlanmış2kalır. Plasmodium- iRBCs küçük bi-lipid membran küreler ekstraselüler veziküller (EVs) bilinen salgılar. Bu EVs potansiyel enfeksiyon enfeksiyon süreci ve konak immün yanıt ilgili bilinir; Ancak, az sıtma enfeksiyon3sırasında bu küçük veziküller özdeş işlevini hakkında bilinir. Bu iki önemli roller oynamak mümkündür: bir yandan, makrofajlar4,5; aktive ederek patogenezinde katkıda ve öte yandan, hücresel iletişim parazitler arasında parazitler ve ana bilgisayar6,7arasında arabuluculuk. Aslında, parazitler proteinler veya nükleik asitler birbirleriyle EVs üzerinden aktarabilirsiniz. Örneğin, Trypanosoma brucei rhodesiense EVs virülans faktörü Serum Resistance-Associated (SRA) aktarabilir ve diğer T. brucei ve ana bilgisayar eritrositler8hedefleyebilirsiniz. Ayrıca, P. falciparum- iRBCs arada her diğer nükleik asitler EVs içinde aktarma tarafından iletişim. Bu parazitler optimize etmek ve onun büyüme eşitlemek sağlar. Aslında, EVs, gametocyte dönüşüm büyük düzenleyici olmak ve bu nedenle iletim sahne7düzenlenmesi için katkıda bulunmak.
Sadece EVs parazitleri düzenleyen, onlar da parazit ana bilgisayar etkileşimi aracılık. Biz son zamanlarda EVs iRBCs gelen insan endotel hücreleri tarafından gerçekleştirilen ana bilgisayar kaynaklı mikroRNA (miRNAs; 21-25 nükleotit9aralığındaki küçük RNA türü) içeren keşfetti. EVs miRNAs Ago2 ile karmaşık istikrarlı bir form (RNA kaynaklı damping üye karmaşık), hangi bir kez alıcı hücrelere teslim kabil özellikle gen ifadesinin susturulması ve hücre10bariyer özelliklerini etkileyen. Standart protokolleri EVs işlevi araştırmak için geliştirilmiştir. Burada, biz ilk tarif onların alımını alıcı hücreleri tarafından araştırmaya EVs floresan etiketlemeyi sağlayan bir protokol. Buna ek olarak, confocal mikroskop kullanarak, bu EV'ın kaderi hücre içindeki izlemek mümkündür. Çeşitli floresan boyalar EVs izlemek için kullanılabilir. Amin-reaktif boya, 5-(and-6) Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) ve Calcein-AM olmak floresan bir kez veziküller içinde. Daha parlak ve daha düzgün bir sinyal verir, çünkü biz amfifilik etiket, PKH, kullanmayı tercih eder. Bu yaklaşım EVs ve alıcı hücreler arasındaki etkileşimleri anlamak için önemli bilgiler sağlar. Bazı durumlarda EVs hücreleri yüzeye bağlamak iken, bazı veziküller hızla alınır. Alımı EVs hangi onlar yasal işlevlerini uygularlar hücrelere onların yükleri teslim.
Burada, endotel hücreleri vitro bariyer fonksiyonu bir floresan dextran hücresel monolayer aracılığıyla transfer miktarının ölçmek için bir protokol açıklayın. Daha hassas tarayıcıları gibi radiolabeled işaretleri kullanılabilir. Ancak, onlar için özel güvenlik önlemleri gerektirir. Vitro bariyer fonksiyonu gibi sıkı bağlantı bütünlüğü ölçen transendothelial elektriksel direnç (AYLARININ), ölçmek için diğer deneyleri adlı biri yok. Sonunda ZO-1, sıkı kavşak protein ayirt tarafından görüntülenmesi iyi10olarak sıkı kavşak dürüst değerlendirme sağlar. EVs potansiyel düzenleyici özelliği ile birkaç yükleri içeren karmaşık ve türdeş olmayan varlıklar olduğundan, alıcı hücreye üzerindeki etkisini incelemek için belirli bir RNA overexpress yararlıdır. Bu nedenle, ayrıca faiz10miRNA ifade istikrarlı hücre satırlarını oluşturmak için amaçlayan bir iletişim kuralını tanımlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
İnsan RBCs Swissethics (swissethics.ch) yönergeleri doğrultusunda sağlıklı bağış kan elde.
Not: P. falciparum parazit kültür (3D 7) ve EV üretim daha önce Mbagwu tarif edildi ve ark. 11 P. falciparum insan bir patojen olduğundan, işleme için yerel düzenlemelere bakın. Kültürler tüm steril tutulmalıdır zaman.
1. Floresans EVs etiketleme
Not: Aşağıdaki yordam, stabil bir yeşil flüoresan boya (PKH67) dahil etmek için etiketleme teknolojisi EV membran lipid bölgesinin büyük Alifatik kuyruklu yararlanır. Reaksiyon 200 µL PKH67 20 µM son konsantrasyon içeren birim boyama son gerçekleştirilir. Tüm adımları izleyerek, ortam sıcaklığında (20-25 ° C)
- PBS 1 ml microcentrifuge tüp içinde yer 100 µg EVs.
- Cips için EVs 7 min için maksimum hızda (20.000 x g) bir microcentrifuge tüp santrifüj kapasitesi.
Not: hemozoini EVs içinde mevcut olduğu için kırmızı-koyu kahverengi Pelet dikkat edilmelidir. EVs lysed ise o zaman süpernatant kırmızımsı. - Santrifüjü sonra süpernatant dikkatli bir şekilde, herhangi bir EVs kaldırma önlemek için Aspire edin.
Not: kalan arabellek EVs Dilüent C'de tekrarlanabilirlik ve boyama verimliliği artırmak için resuspending önce mevcut miktarını en aza indirmek. - EV Pelet Dilüent C 100 µL içinde resuspend (2 X EV süspansiyon) ve yavaşça damlalıklı tam dağılım sigorta için.
- Yeni bir microcentrifuge tüp hazırlayın ve PKH67 ethanolic boya çözüm 4 µL karıştırmak için seyreltici C. girdap iyi 100 µL için ekleyin. Hemen boyama önce bu 2 x boya çözüm (40 µM) hazırlayın.
Not: heterojen boyama önlemek için PKH67 ethanolic boya çözüm doğrudan EV Pelet eklemeyin. - Hızla, 2 EV süspansiyon (Adım 1.4) X 100 µL 2 boya çözüm (Adım 1.5) X 100 µL ile birleştirir. Sonra aşağı yukarı 10 kez pipetting tarafından örnek karıştırın.
- Işık ve mix 3 - 4 kez 5 dk kuluçka sırasında vortexing tarafından korunan EV/boya süspansiyon adım 1.6 5 min için kuluçkaya.
Not: boyama çok hızlı olduğundan EV/boya süspansiyon için daha uzun süreleri kuluçka hiçbir avantaj sağlar. - Serum eşit bir hacmi (200 µL) ekleyerek boyama reaksiyonu durdurmak ve 1dk için fazla boya bağlantısına izin kuluçkaya.
Not: boyama durdurmadan önce EVs üzerinden serum Santrifüjü 20.000 x g 20 dk için de tarafından tüketmek. - 3 kez PBS ile yıkama ve 20.000 x g 5 dakika süreyle aşağı spin Resuspend EVs 1 µg/µL son bir konsantrasyon ulaşmak için PBS 100 µL içinde.
2. EVs Confocal mikroskobu tarafından alımını görselleştirmek
Not: EV içselleştirilmesi cam coverslips üzerinde yetiştirilen endotel hücreleri tarafından izlenmesine aşağıdaki protokolünü açıklar. Endotel hücreleri12' açıklandığı gibi yarı ölümsüzleştirdi insan kemik iliği endotel hücreleri vardır.
- Steril bir ortamda çalışmaya, coverslips % 0,01 Poli-L-lizin, oda sıcaklığında (RT) 10 min için bir fazlalığı ile kat.
- Poli-L-lizin çözüm Aspire edin ve coverslips tamamen kurumasını bekleyin.
- Trypan mavi dışlama ve bir hemasitometre kullanan bir uygun endotel hücre sayısı gerçekleştirin.
- Tam endotel hücre büyüme Poli-L-lizin-kaplı coverslips ek karışıma içeren ve bir monolayer büyümek hücreleri izin orta 1 mL 1 x 105 endotel hücrelerinde aktarın.
Not: Orta hücreleri bir monolayer oluşturmak için ve sıkı kavşaklar oluşturmak için izin büyüme faktörleri içerir. - Hücreleri bir monolayer formu, dikkatli bir şekilde orta Aspire edin ve hücreleri yıkamak için taze orta 1 mL ekleyin. Yıkama bir kez daha yineleyin. PKH67 etiketli EVs 50 µg ekleyin ve 4 h için kuluçkaya.
Not: alımı için en uygun zaman noktası bulmak için bir zaman ders gerçekleştirilebilir. - 4 h sonra orta Aspire edin ve aşırı ve ilişkisiz EVs kaldırmak için 3 kez PBS hücrelerle yıkayın. Hücreleri 15dk için PBS içinde % 3 paraformaldehyde çözüm ile düzeltmek.
Not: Metanol fiksasyon işlemi sırasında aktin kesintiye uğratabilir; Bu nedenle, herhangi bir metanol Fiksajlar veya diğer solvent bazlı Fiksajlar içeren kaçınmak en iyisidir. Formaldehit metanol-Alerjik bir sabitleştirici kullanılması önerilir. - Hücreleri 3 kez PBS ile yıkayın. Dikkatle 250 µL % 0.1 eklemek PBS hücreleri permeabilize Triton X-100. RT 5 min için kuluçkaya.
- 3 kez PBS ile yıkayın. RT non-spesifik bağlama engellemek için 30 dk 400 µL engelleme arabelleği (PBS %5 BSA) ekleyin.
- Hücreleri bir kez PBS ile yıkayın. Boyama çözüm sulandrarak 5 µL 200 µL PBS/1% BSA her kapak notu başına phalloidin hisse senedi çözümün hazırlayın. Damlalıklı 200 µL boyama çözüm coverslip Tarih ve 20 dk RT. az için kuluçkaya
- 3 kez PBS ile yıkayın. DNA için 30 counterstain s Höchst 33342 adlı PBS 200 µL 2 µg/mL nihai bir konsantrasyon ile.
- 2 coverslip x 400 µL PBS ekleyerek yıkayın. Dikkatle coverslip Forseps ile kapmak ve üst kısmında bir cam slayt üzerinde ortam takma antifade bir damla tersine çevirin. Yavaşça bir doku ile aşırı medyayı çıkarın ve her tarafı oje ile mühür.
- 4 ° C'de ışık korunuyorsunuz slaytları depolama
- Lazer uyarilmalar 405, 488 ve 543 nm ve 63 X, 1.3 NA petrol amacı ile floresan emisyonlarının 450-470 nm (mavi), 505-530 nm (yeşil) ve 620 confocal mikroskop kullanarak hücreleri görselleştirmek nm.
Not: Tipik F-aktin boyama sonuçları şekil 1' de gösterilmiştir.
3. endotel hücre geçirgenliği
Not: Endotel hücre geçirgenliği rodamine B isothiocyanate-dextran (ortalama MW 70.000) transferini ölçerek endotel hücre monolayer değerlendirilir. Dextran vasküler geçirgenliği eğitim için mükemmel bir araç sağlar.
- %0,4 Trypan mavi dışlama ve bir hemasitometre kullanarak uygun endotel hücreleri saymak.
- İzdiham 24-iyi doku kültürü ekler (0.4 µm gözenek boyutu) ve izin bozulmamış farklılaşmış monolayers oluşturmak en az 5 gün için 105 hücrelere x 0.6 yoğunluğu, endotel hücreleri plaka. Orta iki günde yenileyin.
- Hücreleri bir monolayer ulaştığınızda, EVs yük (1 ml 50 µg) üst odası üzerinde. Rodamine-dextran 20 mg/mL nihai bir konsantrasyon üst kuyuda ekleyin. %5 CO237 ° C'de hücreler kuluçkaya.
- Floresan dextran transfer altına de floresan emisyon 40 µL orta aliquots üzerinden ölçerek izlemek. Çok etiketli Mikroplaka okuyucu 544 nm uyarma ve 590 nm emisyon ölçümleri için ayarlayın.
Not: Dağınık dextran miktarda hisse senedi çözüm ile kurulan kalibrasyon eğrileri kullanarak sayısal. Buna ek olarak, Kinetik deney süresi boyunca (Şekil 2) dış Kamara orta küçük örnekleri kaldırarak gerçekleştirilebilir. Bile herhangi bir tedavi, dextran hücre monolayer yaygın.
4. puromisindir duyarlılık belirlemek
Not: hücre hatları ile lentivirus transducing önce o belirli hücre satır için seçili bir ilacın öldürmek eğrisi belirlemek önemlidir. İlaç konsantrasyonu bütün hücreleri öldürmek gerekli en az miktarını belirlemek için seçilen ilaç artan dozlarda kullanılarak bir doz yanıt deneme gerçekleştirin. Çünkü her memeli hücre satırı önce deneme, farklı bir duyarlılık antibiyotik en iyi konsantrasyon öldürmek eğrisi titrasyon aşağıda ayrıntılı olarak geliştirerek tespit edilmelidir.
- Hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. 1 x 105 hücre/mL tam endotel hücre büyüme ek karışımı içeren ortamda bir konsantrasyon, endotel hücreleri resuspend.
- Plaka 1 x 104 100 µL endotel hücre büyüme ortamının son hacmi bir 96-şey plaka hücrelere.
- 0.1-10 µg/mL konsantrasyonu elde etmek için antibiyotik içeren orta 100 µL ekleyin (bkz. şekil 3).
- Hücre canlılığı 2 günde 20 X amacı istimal ışık mikroskop altında incelemek. 10-14 gün için hücreleri kültür ve puromisindir bağlı olarak hücre büyümesini her 2-3 gün içeren ortamı değiştirin.
- 10 µL/iyi MTS reaktif her kuyuya, mix, eklemek ve standart kültür koşullarında 37 ° C'de 4 h için kuluçkaya.
- Plaka kısaca üzerinde bir sallayıcı ve Absorbans 490 bir plaka okuyucu kullanarak tedavi ve tedavi edilmezse hücrelerinin ölçmek nm (şekil 3).
5. iletim Lentiviral vektör ile endotel hücrelerinin
- Tam orta 1 mL 1 x 105 endotel hücrelerinde iletim önceki gün plaka. Hücreleri 50-%80 confluency ulaştığında iletim gerçekleştirir.
- Lentivirus buz erime ve donma-çözülme döngüsü önlemek için viral stoklarının aliquots olun. Spin aşağı 200 x g de malzeme için 30 s, tüpler üzerinde yayılımı önlemek için açmadan önce.
- Hexadimethrine bromür 8 µg/mL nihai bir konsantrasyon hücreleri ekleyin.
Not: bazı durumlarda hücreler için zehirli olabilir ancak Hexadimethrine bromür iletim verimliliği yardımcı olur. Bu nedenle, en iyi toplama bir öldürme eğrisi iletim önce gerçekleştirerek tespit edilmelidir. - Karışımı yavaşça için plaka girdap. Enfeksiyon (MOI) uygun bir çeşitlilik viral parçacıkların (0,5-2 x 106 parçacıklar arasında) uygun miktarı ekleyin ve hafifçe 30 plaka girdap karışımı s.
- RT, santrifüj iletim verimliliği artırmak için 300 x g de 45 dakika için hücre viral parçacık karışımda santrifüj kapasitesi. 37 ° C hücre viral parçacık karisimin gecede kuluçkaya.
- Dikkatli bir şekilde viral partikül içeren orta çıkarın ve uygun şekilde atın. Eski yerine koymak o ile taze, Önceden ısıtılmış tam kültür orta.
- Başlangıç seçimi ile puromisindir ikinci gün: Orta kaldırmak ve taze orta bölüm 4 (şekil 3) önceden belirlendiği gibi puromisindir doğru konsantrasyon içeren ile değiştirin.
- Hücreleri puromisindir seçimden sonra hasat ve üreticinin yönergeleri izleyerek kiti izole bir RNA kullanarak RNA yalıtır.
- Seçili cDNA sentezini gerçekleştirmek bir ters transkripsiyon kullanarak miRNAs Kiti ( Tablo reçetesigörmek).
- QPCR tepki gösterdi protokolü13göre ayarlayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada, konak hücreleri ile EVs etkileşimleri araştırmak için iletişim kurallarını açıklar. Fluorescently etiketli EVs alımını confocal mikroskobu (şekil 1) tarafından kontrol edilmektedir. EVs kuluçka zamanla alımını izlemek için optimize edilebilir ancak endotel hücreleri verimli EVs götür. Bir daha iyi yerelleştirme EVs için hücrelere, aktin phalloidin ile leke. Sonra hangi üst kısmında bir monolayer endotel hücrelerinin büyür bir filtre membran kullanın. Rodamine B isothiocyanate-dextran filtre membran üst TMMOB uygulanır ve endotel monolayer geçirgenliği floresan dextran transfer içine alt Kamara (şekil 2A) izleyerek ölçülür. Genellikle, endotel hücreleri geçirgenliği üzerine kuluçka EVs (şekil 2B) giderek artan miktarda ile etkilenir. Onlar wells, aksi takdirde boya hızlı diffüz bir monolayer oluşturacak emin olmak birkaç gün için hücreleri büyümek önemlidir. Tedavi olmadan bile, dextran yavaş yavaş hücre monolayer diffüz unutmamak gerekir.
MikroRNA anahtar bileşenleri EVs ve alıcı hücrelere transferden sonra onlar gen ifadesinin düzenlenmesi. Özellikle miRNAs rolünü araştırmak için alıcı hücreye satırında overexpress çok yararlı olur. Burada biz miRNAs endotel hücrelere transduce anlatan. İlk adım stabil transduced hücreleri (şekil 4A) seçmek için endotel hücreleri öldürür puromisindir konsantrasyonu saptayacak yeterliliğe oluşur. Son olarak, miRNAs ifade düzeyini kontrol ve qPCR (şekil 4B) tarafından doğrulandı.
Şekil 1: EVs kapladığı endotel hücreleri tarafından. Arıtılmış EVs PKH67 ile yeşil ve endotel hücreleri monolayer ile 4 h için inkübe etiketli. Tedavi edilmemiş endotel hücreleri bir negatif kontrol kullanılır. Geniş ilişkisiz EVs kaldırmak için yıkadıktan sonra hücreleri aktin (kırmızı) leke phalloidin ve çekirdek (mavi) leke Höchst 33342 ile lekeli. Hücreleri tarafından confocal mikroskobu tespit edildi. Görüntüleri lazer confocal mikroskop ve 63 x 1.3 NA petrol amacı istimal alındı. Höchst 33342 405 IncrediMail nm ve 450-470 nm'de (mavi); toplanan emisyonları ile PKH67 488 IncrediMail nm, emisyon toplanan 505-530 nm (yeşil); ve Phalloidin-594 543 IncrediMail nm, 620 toplanan emisyon nm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: endotel bariyer üzerinde EV Alım etkisi. (A)şematik rodamine etiketli dextran Difüzyon: endotel hücreleri izdiham üst kısmında bir filtre membran için yetiştirilen, floresan dextran üst odasına uygulanır ve membran ile zaman içinde dağılır. EVs etkisi geçirgenliği alt Kamara dextran Difüzyon oranı ölçerek EVs ek üst odasına sonra değerlendirilir. EVs miktarda (bir artanB) endotel hücreleri ile inkübe. Rodamine etiketli dextran zaman içinde bir trans-şey zar arasında transferini geçirgenliği ölçülerini sağlar. Endotel tabakası arasında geçirgenliği kuluçka 2 h ile 50 ve 100 µg/mL EVs sonra önemli ölçüde artar. Verileri 3 deneylerden demek (± s.e.m.) temsil eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: puromisindir titrasyon. Puromisindir (10 mg/mL) hisse senedi çözüm RPMI takıma ısı inaktive % 10 (56 ° C, 30 min) fetal buzağı serum, 2 mM glutamin, 1 mM sodyum pyruvate, 100 U/mL penisilin/streptomisin ile 1640 yılında seyreltilmiş. 15 µL toplam 10 mL tüp A. ortamda eklenir Sonra 7.5 mL tüp A'dan çözeltisi RPMI 2.5 ml tüp B. karıştırılır Son olarak, seyreltme 100 µL 7.5 µL/mL, 5,62 µL/mL nihai bir konsantrasyon ve benzeri vermek için hücreleri 100 µL için eklenir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: üretimi endotel hücre miR451a overexpressing. Puromisindir endotel hücreleri üzerinde öldürme eğrisini(a)belirlenmesi. Endotel hücreleri artan dozlarda, puromisindir ile inkübe. Canlılığı 72 h sonra MTS tahlil tarafından ölçüldü. Verileri bir temsilcisi deney (± s.e.m.) ortalamasını temsil eder. (B) RNA'ların miR451a overexpressing endotel hücrelerden türetilmiş veya bir negatif kontrol hasat ve miR451a transkript tarafından gerçek zamanlı PCR sayılabilir. qPCR sonuçları U6 kahya gen kullanarak 2-Ct yöntemi tarafından normalleştirilmiş ve (± s.e.m.) demek gibi ifade (n = 3 deneyler). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Çeşitli parazitler, Toxoplasma, Trypanosoma, LEISHMANIA ve Trikomonas gibi EVs virüslü konak hücre sürümü tetikler. Patojenler bağlı olarak yayımlanan EVs konak immün yanıt modüle veya hücresel iletişim parazitler6arasında arabuluculuk. Henüz, bu küçük veziküller sıtma hastalığı için nasıl katkıda bulunduğunu düşündüren çok az kanıt var. Burada, EVs fonksiyonu Plasmodium enfeksiyon sırasında araştırmak için çeşitli yollar anlatmıştık. Örneğin, EVs alımını alıcı hücreler in vivo tarafından etkili bir şekilde PKH67 floresan boya ile Will tarafından izlenebilir. Birden çok denetimi etiketleme özgüllüğü sağlamak için yapılması gerekiyor. Dilüent C ile karışınca PKH67 boya formu toplamları için eğilimindedir ve bu nedenle boya EVs non-spesifik boyama belirlemek için yalnız bir denetimini eklemek gerekli olan unutmamak gerekir. Confocal mikroskobu yüzeye bağlı ve gerçekten alıcı hücreleri tarafından içselleştirilmiş veziküller birbirinden ayırmak için seçim yöntemidir. Buna ek olarak, izlemek ve hücreleri tarafından alınan veziküller sayısını izlemek için mükemmel bir araç sağlar. Ancak, EVs alıcı hücreler14' te nasıl işleneceğini belirsizdir; Bu nedenle, bir zaman ders performans zaman-puan 2, 4 ve 8 h, kullanarak alımı için en uygun koşulları belirlemek için çok yararlı olabilir. Hücre altı bölme işaretlerini ilavesi confocal mikroskobu tarafından hücrelere EVs izlemek için kullanılabilir. EV alımı membran fusion veya endositoz15gerçekleşmesi için gösterilmiştir. Füzyon octadecyl rodamine B (R18) ile etiketleme EVs tarafından izlenebilir. Floresans16bir artışa yol açar R18 seyreltme EVs füzyon hücresel membranlar ile sonuçlanır. EVs alımını endositoz tarafından aktin, Mikrotubul ve dynamin10belirli inhibitörleri kullanarak okudu olabilir.
EVs fizyolojisi çalışmaya PKH boyalar ile doğrudan iRBCs etiket ve endotel hücreleri ile iRBCs ortak kültür mümkündür. Burada hücreleri farklı bir ortam gerektirir ve gaz besteleri ve EV transfer miktarı azalmış olabilir sorun. Ayrıca, veziküler protein flüoresan etiketi ile erimiş donör hücreleri vitro ve içinde vivoifade edilebilir. Ancak, öylesine uzakta o iRBCs ile test edilmemiştir
Virüslü RBCs beyinde serebral sıtma17neden sorumlu olduğu düşünülen bir işlem microvasculature için cytoadherent vardır. Bu nedenle, parazit malzeme transferi EVs endotel hücreleri ve dolayısıyla damar işlevi18etkilemek muhtemeldir. Burada, açıklanan vitro tahlil örnek endotel hücrelerinin temel özelliklerinden bazıları onun geçirgenliği19araştırmak için kolay bir yol sağlar. Ek test AYLARININ veya immunostaining ZO-1 gibi sıkı bağlantı bütünlüğü10hakkında daha fazla bilgi sağlayabilir.
Ayrıca, vitro modeli moleküler mekanizmaları arasında parazitler ve konak hücreleri hücresel iletişim arkasında çalışmak için güçlü bir araç olduğu ortaya çıkıyor. Alımı yanı sıra, bu kurulum moleküler mekanizmaları incelenmesi bu süreçte yer verir. Örneğin, miR451a aktarmak alıcısı hücreleri gerçek zamanlı PCR ve floresan situ hibridizasyon tarafından izlenen. Ayrıca, bu küçük RNA vasküler işlev10rolü doğrudan adrese belirli bir miRNA overexpressing hücre satırlarını oluşturmak nasıl açıklar. Ancak, birden çok denetimi iletim hücresel fonksiyon etkileyebilir beri sigara transduced hücreleri, testi dahil olmak üzere yapılmalıdır. Ayrıca, miRNA inhibitörleri miRNAs etkisini nötralize etmek için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu çalışmada mali kısmen tıbbi ve biyolojik araştırma (PYM için) Gottfried ve Julia Bangerter-Rhyner-Stiftung (için MW ve PYM) ve araştırma havuzu Fribourg Üniversitesi (PYM için) Novartis Vakfı tarafından desteklenmiştir. Ek hibe İsviçre hükümetinin mükemmellik burs (için KAFİLE ve SM) yabancı bilim adamları için içerir. Isabelle Fellay ve Solange Kharoubi Hess teknik destek için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Mini Kit | Sigma-Aldrich | MINI67-1KT | |
| Diluent C | Sigma-Aldrich | G8278 | |
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| PBS | ThermoFisher - Gibco | 10010023 | |
| Phalloidin CF594 | Biotium | #00045 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher | H3570 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher | P36934 | |
| Rhodamine B isothiocyanate–Dextran | ThermoFisher | R9379-250MG | |
| Insert with PET membrane transparent Falcon for plate 24 wells | Falcon | 353095 | |
| Endothelial Cell Growth Medium MV | Promocell | C-22020 | |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma-Aldrich | P9620-10ML | |
| MTS Cell Proliferation Colorimetric Assay Kit | Biovision | K300-500 | |
| hexadimethrine bromide | Sigma-Aldrich | 107689-10G | |
| MISSION Lenti microRNA, Human hsa-miR-451a | Sigma-Aldrich | HLMIR0583 | |
| MISSION Lenti microRNA, ath-miR416, Negative Control 1 Transduction Particles | Sigma-Aldrich | NCLMIR001 | |
| MISSION Lenti microRNA, Human | Sigma-Aldrich | NCLMIR0001 | |
| Leica TCS SP5 | Leica Microsystems | ||
| miRNeasy mini Kit | Qiagen | 217004 | |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit 1000 reactions | ThermoFisher | 4366597 | |
| hsa-mir-451a RT/750 PCR rxns | ThermoFisher | 001141 | |
| U6 snRNA | ThermoFisher | 001973 | |
| TaqMan Universal Master Mix II, with UNG | ThermoFisher | 4440038 | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | ThermoFisher | 4376600 |
References
- WHO. WHO Malaria Report 2015. , (2015).
- Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. The pathogenic basis of malaria. Nature. 415 (6872), 673-679 (2002).
- Mantel, P. Y., Marti, M. The role of extracellular vesicles in Plasmodium and other protozoan parasites. Cell Microbiol. 16 (3), 344-354 (2014).
- Couper, K. N., et al. Parasite-derived plasma microparticles contribute significantly to malaria infection-induced inflammation through potent macrophage stimulation. PLoS Pathog. 6 (1), e1000744 (2010).
- Schofield, L., Grau, G. E.
- Mantel, P. Y., et al. Malaria-infected erythrocyte-derived microvesicles mediate cellular communication within the parasite population and with the host immune system. Cell Host Microbe. 13 (5), 521-534 (2013).
- Regev-Rudzki, N., et al. Cell-cell communication between malaria-infected red blood cells via exosome-like vesicles. Cell. 153 (5), 1120-1133 (2013).
- Szempruch, A. J., et al. Extracellular Vesicles from Trypanosoma brucei Mediate Virulence Factor Transfer and Cause Host Anemia. Cell. 164 (1-2), 246-257 (2016).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
- Mantel, P. Y., et al. Infected erythrocyte-derived extracellular vesicles alter vascular function via regulatory Ago2-miRNA complexes in malaria. Nat Commun. 7, 12727 (2016).
- Mbagwu, S., Walch, M., Filgueira, L., Mantel, P. Y. Production and Characterization of Extracellular Vesicles in Malaria. Methods Mol Biol. 1660, 377-388 (2017).
- Schweitzer, K. M., et al. Characterization of a newly established human bone marrow endothelial cell line: distinct adhesive properties for hematopoietic progenitors compared with human umbilical vein endothelial cells. Lab Invest. 76 (1), 25-36 (1997).
- Wong, W., Farr, R., Joglekar, M., Januszewski, A., Hardikar, A. Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs. J Vis Exp. (98), (2015).
- Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake. J Extracell Vesicles. 3, (2014).
- French, K. C., Antonyak, M. A., Cerione, R. A. Extracellular vesicle docking at the cellular port: Extracellular vesicle binding and uptake. Semin Cell Dev Biol. 67, 48-55 (2017).
- Montecalvo, A., et al. Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes. Blood. 119 (3), 756-766 (2012).
- Idro, R., Jenkins, N. E., Newton, C. R. Pathogenesis, clinical features, and neurological outcome of cerebral malaria. Lancet Neurol. 4 (12), 827-840 (2005).
- Jambou, R., et al. Plasmodium falciparum adhesion on human brain microvascular endothelial cells involves transmigration-like cup formation and induces opening of intercellular junctions. PLoS Pathog. 6 (7), e1001021 (2010).
- Zhou, W., et al. Cancer-secreted miR-105 destroys vascular endothelial barriers to promote metastasis. Cancer Cell. 25 (4), 501-515 (2014).
