Summary
Desthiobiotin etiquetado de un sintético 25-nucleótido RNA oligo, que contiene un motivo de elementos ricos en adenina (ARE), permite la unión específica de proteína citosólica son.
Abstract
El en vitro RNA-telecine se utiliza todavía en gran parte en los primeros pasos de protocolos dirigidos a identificar proteínas de unión de ARN que reconocen determinados motivos y estructuras de ARN. En este protocolo de RNA-telecine, comercialmente sintetizadas sondas de RNA están marcadas con una forma modificada de la biotina, desthiobiotin, en el 3' terminal del filamento del RNA, que se une reversiblemente a estreptavidina y permite así la elución de proteínas bajo más fisiológica condiciones. El RNA-desthiobiotin se inmoviliza mediante la interacción con estreptavidina en granos magnéticos, que se utilizan para tirar abajo proteínas que interaccionan específicamente con el RNA de interés. Proteínas no desnaturalizadas y activas de la fracción citosólica de las células del mesotelioma se utilizan como fuente de proteínas. El método aquí descrito puede aplicarse para detectar la interacción entre proteínas RNA conocidas y una sonda de RNA largo (nt) de 25 nucleótidos que contiene una secuencia de interés. Esto es útil para completar la caracterización funcional de estabilizar o desestabilizar elementos presentes en las moléculas de ARN alcanzadas usando un análisis de vectores de reportero.
Introduction
Expresión génica y el nivel final del producto del gene pueden ser reguladas fuertemente afectando la estabilidad del ARNm y ARNm traducción tarifa1. Estos mecanismos de regulación postranscripcional se ejercen a través de las interacciones de no codificante del RNA y RNA-que ata las proteínas (restrictivas) con el mRNA específicos. Generalmente es el 3' región sin traducir de mRNA (3' UTR - pertenecientes a la parte no codificante del genoma2) que contiene específico cis-elementos reguladores (CRE), que son reconocidos por trans-actúan factores como miRNA o restrictivas 3. el mejor estudio cis-elemento dentro de los 3' UTR, es el adorno de elementos ricos en adenina (son), que es reconocido por proteínas específicas AU (AUBP) y, a su vez, induce o mRNA degradación/deadenylation (mediada son decaimiento) o mRNA estabilización4.
El tamaño de los 3' UTR del calretinin mRNA (CALB2) es 573 bp largo y contiene una supuesta AUUUA pentámero, como AREsite2, una herramienta bioinformática del5. Consistente con la presencia de un supuesto motivo son, el análisis de vector-reportero de pmirGLO había demostrado un papel de estabilización de este elemento dentro de mRNA CALB26. Por último, el en vitro RNA-telecine se utilizó para identificar la AUBP que estabiliza calretinin mRNA mediante el adorno son.
Pues todo no-codificación RNAs interactúan con proteínas7, el en vitro RNA-telecine es una buena forma y análisis de primera de elección para la identificación de RNA-interactianos a ayudar a descifrar los mecanismos moleculares. En este método de RNA-telecine, comercialmente sintetizadas sondas de RNA, que fueron etiquetadas con una forma modificada de la biotina (desthiobiotin) en la terminal 3' de la hebra de RNA, fueron utilizadas. El RNA-desthiobiotin se inmoviliza mediante la interacción con estreptavidina en granos magnéticos, que se utilizan para tirar abajo proteínas que interaccionan específicamente con el limite-RNA de interés. Proteínas no desnaturalizadas y activas de la fracción citosólica de las células del mesotelioma se utilizan como fuente de proteínas. Tales proteínas RNA-bound se eluyen de las bolas magnéticas, a través de un gel de SDS-PAGE de 12%, transferidos a una membrana y sondeado con los diferentes anticuerpos.
En el procedimiento de purificación de afinidad estándar de estreptavidina-biotina, desnaturalización dura condiciones se requieren interrumpir el vínculo fuerte biotina-estreptavidina irreversible para eluir las proteínas límite8, que podría conducir a la disociación de complejos de la proteína. A diferencia de la biotina, desthiobiotin se une a estreptavidina reversible y se desplaza competitivamente con una solución de biotina, lo que permite la elución suave de proteínas y evitar el aislamiento de naturalmente biotinilado moléculas9 lo que sugiere que la técnica es ideal para el aislamiento de complejos de proteína nativa en condiciones nativas.
In vitro condiciones obligatorias y rigor, que están determinadas por la concentración de sales, agentes reductores y porcentaje de detergente, deben estar cerca de los presentes en el contexto celular con el fin de identificar interacciones de verdad en vivo . Las condiciones vinculantes en este documento han sido previamente demostradas según corresponda para la identificación de lo HuR como una AU-que atan la proteína10. Este enfoque podría ahorrar tiempo, ya que la optimización de las condiciones de enlace adecuada puede ser difícil y desperdiciador de tiempo. Además, este método podría utilizarse como un protocolo inicial para cualquier experimento de RNA-desplegable y puede optimizarse gradualmente cambiando la concentración de sales y detergentes, cambiando el porcentaje de glicerol y adición de otras sales. Por otra parte, hemos demostrado que incluso una corto 25-nucleótido RNA sonda albergando un pentámero son motivo podía utilizarse para demostrar la interacción con una AUBP específico.
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Protocol
1. preparación de la fracción de proteínas citosólicas y nucleares
- Placa 4 x 106 ACC-MESO-4 células en un frasco de cultivo celular T150 cultivadas en RPMI - 1640 medio suplementado con 10% FBS, 1 x penicilina/estreptomicina (100 x) y 2 mM L-glutamina (200 mM). Cuando las células alcanzan una confluencia del 80-90% (~5-5.5 x 106 células), proceder a la extracción de proteínas de la fracción nuclear y citosólica.
Nota: Línea de celular de ACC-MESO-4 se obtuvo de la RIKEN BioResource centro11. - Aspire medio, lave las células añadiendo 15 mL de PBS 1 x, incline la placa suavemente unas cuantas veces y aspirar el PBS 1 x. Añadir 3 mL de 0.25% tripsina-EDTA e Incube el frasco de cultivo a 37 ° C durante 3 minutos.
Nota: Observar las células bajo el microscopio para la separación; Si todavía toma el frasco contra la palma de la mano 3 veces. - Agregar 7 mL de Medio RPMI-1640 suplementado con 10% FBS, penicilina/estreptomicina de 1 x (100 x) y 2 mM L-glutamina (200 mM), recoger las células en un tubo de 15 mL y desactivación a 200 x g durante 5 minutos.
- Medio de aspirar y resuspender el pellet celular con 1,5 mL de 1 x PBS, luego transferir las células a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Desactivación a 500 x g y 4 ° C por 5 min, descartar el sobrenadante.
Nota: De este paso adelante, realice todos los pasos de centrifugación a 4 ° C y mantener todos los reactivos en el hielo. - Resuspender el precipitado de células con helado 1,5 mL de 1 x PBS y rotación de las células a 500 x g y 4 ° C por 3 minutos descarte el sobrenadante.
Nota: Las cantidades necesarias de CER I, II CER y NER reactivos son 10, 0.55 y 5 volúmenes de pellets Estimado celular lleno de volumen, respectivamente; el siguiente protocolo asume un volumen de 20 μl. Recomendamos preparar únicamente la cantidad necesaria de reactivo CER yo. - Añadir 200 μL de reactivo de extracción citoplásmico helada (CER I) suplementado con 2 μl de 1 x inhibidor de la proteinasa, por ejemplo, diluir 1 tableta de inhibidor de la proteasa (EDTA-libre) en 500 μl de agua para obtener 100 acciones de x. Esta cantidad de reactivo CER basta para lyse 20 μl de un volumen el sedimento celulares.
- Para estimar el volumen de pellets embalado célula, comparar el tubo que contiene el precipitado de células con un tubo de 1,5 mL con 10, 20, 50 o 100 μl de PBS 1 x.
- Resuspender el precipitado de células por Vortex vigorosamente el tubo por 15 s e incubar el tubo en hielo por 10 minutos Añadir 11 μl del reactivo de extracción citoplásmico helada II (CER II) al tubo, vortex vigorosamente durante 5 s e incubar 1 minuto en el hielo.
- Vortex vigorosamente durante 5 s y centrifugar el tubo a 16.000 x g y 4 ° C por 5 min transferir el sobrenadante a limpiado tubo previamente enfriado en hielo. El sobrenadante es la fracción citoplasmática que es más utilizado en el experimento de RNA-telecine.
- Resuspender el precipitado quedado en 100 μl de reactivo de extracción nuclear helada (NER) suplementado con 1 μl de inhibidor de la proteinasa (100 x) y vigorosamente en vortex por 15 s. Recomendamos preparar únicamente la cantidad necesaria de reactivo NER suplementado con los inhibidores de la proteasa.
- Incubar la muestra en hielo durante 40 minutos con Vortex ocasional por 15 seg (cada 10 min).
- Centrifugar el tubo a 16.000 x g durante 10 min. traslado el sobrenadante (esto es la fracción de proteína nuclear) a un tubo limpio previamente enfriado.
- Inmediatamente se procederá a medir la concentración de proteínas utilizando el método de bicinchoninic (BCA) (véase Tabla de materiales). Para el control de pureza de proteínas de cada fracción, realizar immunoblotting (figura 1) contra α-tubulina (detección positiva sólo en la fracción citosólica) y de la poli ADP-ribosa polimerasa - PARP (detección positiva sólo en la fracción nuclear). Para la visualización de proteínas, consulte la sección 4.
- Para mantener la actividad de la proteína y su estado natal, preparar 25 μl de alícuotas de extractos citosólicas y nucleares. Rápido-congele estas alícuotas colocándolos en nitrógeno líquido durante 5 s y tienda directamente a-80 ° C.
2. etiquetado de ARN con Desthiobiotin
- Sondas de RNA sintetizado comercialmente y HPLC purificada. Resuspender con agua libre de nucleasas en 10 μm.
Nota: Las secuencias sonda se enumeran en la tabla 1. - Uso 50 pmol de RNA por reacción RNA-telecine. Descongelar y mantener todos los reactivos en el hielo excepto para clavija 30%, utilizado para la etiqueta 3' terminal del RNA oligo.
- 5 μl de 10 μm RNA puntas de prueba, etiquetado como CALB2 3' UTR (son) la transferencia, CALB2 3' UTR (mtARE) y ARN-Unrelated (IRE), en 0.5 mL pared delgada microcentrífuga los tubos e incubar en una máquina PCR a 85 ° C por 5 minutos colocar los tubos inmediatamente en hielo.
Nota: Este paso es importante, ya que fomenta la relajación y la accesibilidad de la sonda de RNA para el etiquetado. - Para una sola reacción de 30 μL, añada al tubo que contiene el RNA la siguientes 10 μl mezclar: 3 μl de agua libre de nucleasa, 3 μl de 10 x Buffer de reacción RNA ligasa, 1 μl de inhibidor de la Rnasa (40 U/μL), 1 μl de Desthiobiotinylated citidina bifosfato (1 mM) y 2 μl de ligasa de T4 RNA (20 U/μL).
Nota: Para preparar mezcla principal A 3 muestras en exceso (3.2), la mezcla 9,6 μl de nucleasa agua libre, 9,6 μl de 10 x Buffer de reacción RNA ligasa, 3,2 μl de inhibidor de la Rnasa (40 U/μL), 3,2 μl de Desthiobiotinylated citidina bifosfato (1 mM) y 6.4 μL de ligasa de T4 RNA (20 U/μL). - Agregar cuidadosamente 15 μl de PEG 30% a la reacción. Use otro Consejo para mezclar la reacción. Incubar la reacción durante la noche a 16 ° C.
- Al día siguiente, preparar los siguientes: 5 M de NaCl (fresh nucleasa-libre), cloroformo: alcohol isoamílico en proporción 24:1 (por ejemplo, por reacción - 96 de μl de cloroformo y 4 μL de alcohol isoamílico), helada 100% de etanol y etanol al 70% helada.
- Añadir 70 μl de agua libre de nucleasa en los tubos de la reacción RNA-etiquetado. Añada 100 μl de cloroformo: isoamílico alcohol y agitar brevemente. La desaceleración a 13.000 x g por 3 minutos cuidadosamente quitar sólo la fase superior y la transferencia a un nuevo tubo libre de nucleasa 1.5 mL; Evite tocar la fase inferior.
- Añadir 10 μl de NaCl 5 M, 1 μl de glucógeno y 300 μL de etanol al 100% helado. Coloque el tubo a-20 ° C por 2 h.
Nota: En este paso, el experimento puede continuarse al día siguiente. - Centrifugar a 13.000 x g y 4 ° C durante 15 minutos eliminar cuidadosamente el sobrenadante sin perturbar el pellet. Añadir 300 μL de helada etanol al 70% y centrifugar a 13.000 x g y 4 ° C durante 5 minutos.
- Descartar completamente el sobrenadante y secar el pellet (15 min). Resuspender el precipitado en 20 μl de agua libre de nucleasa.
Nota: Proceda con RNA-desplegable en el mismo día. - Incubar el RNA a 90 ° C por 2 min y coloque en hielo. Coloque el RNA marcado en hielo durante el siguiente paso de prelavado de las bolas magnéticas de estreptavidina.
Nota: Un tiempo de incubación más largo puede dañar la sonda de RNA.
3. ARN-proteína telecine
-
Pre-lavado de granos magnéticos de estreptavidina e incubación con desthiobiotin-RNA
- Utilizar 50 μl de granos magnéticos estreptavidina por 50 pmol de RNA. Sin embargo, esto debe ser optimizado dependiendo el experimento.
- Vórtice el tubo con granos estreptavidina-magnéticos para 15 s y rápidamente eliminar 200 μl (mezcla principal; suficiente para reacciones de 3 + 1) en un tubos safe-lock de 1,5 mL limpia usando corta puntas de pipeta. Coloque el tubo sobre un soporte magnético para que los granos de recogen en el lado del tubo y esperan 1 minuto, retire el líquido de resuspensión.
- Lavar los granos, quitar el tubo del soporte magnético, añadir 400 μL de 0,1 M NaOH 0.05 M de NaCl solución y suavemente pipeta arriba y abajo varias veces. Coloque el tubo en el soporte magnético. Esperar 1 minuto y recoger el sobrenadante. Repita este paso otra vez.
- Lavar los granos con 200 μL de 100 mM de NaCl. Eliminar el sobrenadante.
- Añadir 200 μL de 20 mM Tris (pH 7.5), suspender cuentas mediante pipeteo, coloque el tubo en el soporte magnético, espere 1 minuto y eliminar el sobrenadante. Repita el paso.
- Retire el tubo del soporte magnético, añadir 200 μL de 1 x de buffer de captura RNA y resuspender granos magnéticos estreptavidina por Vortex brevemente. Quitar 50 μl de granos magnéticos estreptavidina y añada a cada tubo marcado-RNA utilizando una pipeta de corte. Incubar los tubos durante 30 min a temperatura ambiente en un rodillo.
-
Atascamiento de la proteína al RNA
- Colocar los tubos en un soporte magnético, esperar 1 minuto y eliminar el sobrenadante.
- Añadir 50 μl de 20 mM Tris (pH 7.5) a los granos y resuspender mediante pipeteo. Colocar los tubos en un soporte magnético, esperar 1 minuto y eliminar el sobrenadante. Repita este paso.
- Añadir 100 μl de 1 x de tampón de Unión proteína-ARN a las cuentas y resuspender mediante pipeteo.
- Mientras tanto, prepare la siguiente mezcla: 10 μl de 10 x tampón de Unión proteína-RNA, 30 μl de glicerol 50%, 50 μg de proteínas citoplasmáticas y libre de nucleasas hasta 100 μl de agua.
Nota: Preparar mezcla master B de 3 muestras en exceso (3.3) como sigue: 33 μl de 10 x tampón de Unión proteína-RNA, 99 μl 50% glicerol, 165 μg de proteínas citoplásmicas y agua libre de nucleasas hasta 330 μl. Mantenga el tubo de mezcla master B en el hielo. - Colocar los tubos en soporte magnético, espere 1 minuto y recoger el sobrenadante. Añada 100 μl de la mezcla principal B, suspender transfiriendo suavemente hacia arriba y hacia abajo y no crear burbujas. Incubar los tubos de reacción de 60 minutos a 4 ° C en un rodillo.
-
Lavado y elución
- Colocar los tubos en un soporte magnético, recoger el sobrenadante (que es el flujo a través de - FT) y transferir a un tubo nuevo.
Nota: Mantener esta FT en hielo para su posterior análisis. - Pipetear 100 μl de 1 x de tampón de lavado en las cuentas, resuspender suavemente, vuelva a colocar en el soporte magnético, esperar 1 min y descarte el sobrenadante. Repetir este paso 2 veces.
- Agregar 40 μl de tampón de elución a las bolas magnéticas y mezclar mediante pipeteo arriba y abajo, incubar a 37 ° C en un agitador de tubos (950 rpm) durante 30 minutos.
- Colocar los tubos en un soporte magnético, esperar 1 min y recoger muestras eluídas (que es el eluido - E). Coloque en hielo y utilizar para posteriores análisis.
Nota: En este paso, cada prueba RNA sonda consiste en un paso (FT) y la muestra de efluente (E).
- Colocar los tubos en un soporte magnético, recoger el sobrenadante (que es el flujo a través de - FT) y transferir a un tubo nuevo.
4. poliacrilamida electroforesis y Western Blot análisis
Nota: Consulte la tabla 2 para las recetas de los buffers utilizados en esta sección. Realizar un Western blot según el método de Laemmli12.
- Handcast 12% geles de SDS-PAGE (10-pozos, separador de 1,5 mm, 66 μL). Preparar una mezcla de gel de corriente: 4 mL de solución stock de 30% acrilamida-bisacrilamida, 2,4 mL de Tris inferior del almacenador intermediario, 3,2 mL de dH2O, 9,6 μl de TEMED, 96 μl de solución de persulfato de amonio 10% (APS). Preparar la mezcla de gel de apilamiento: 3,25 mL de dH2O 0,5 mL de 30% acrilamida - bisacrilamida solución, 1,3 mL de tampón Tris superior, 10 μl de TEMED, 20 μl de 10% APS.
- Añadir a 16.6 μl de tampón de x Laemmli 6 (p. ej., 14 mL de pH 6.8 de Tris/HCl/SDS (tampón de Tris superior), 2 g de SDS, 1,86 g de la TDT, 6 mL de glicerol y 0.012% bromofenol azul; almacenar a-20 ° C) en la muestra FT y 6,6 μl de tampón de x Laemmli 6 en muestra de E. Incubar las muestras durante 5 min a 95 ° C.
- Las muestras (20 μl del FT y eluir ~ 40 μL) de la carga y correr durante 30 min a 60 V, continuando con 20 V durante la noche.
- Utiliza un sistema de electroblotting semiseco, transferencia de proteínas a una membrana PVDF para 80 min a 15 V.
Nota: La membrana PVDF debe ser activada antes de realizar la transferencia de la proteína. Incubar la membrana en metanol al 100% por 1 min, seguido de una incubación de 2 minutos en agua ultrapura. - Después de la transferencia de la proteína, incubar el gel SDS-PAGE con la solución de Coomassie para 3 h, seguido de tres pasos de lavado con agua ultrapura, cada 30 minutos.
- Al final de la transferencia de la proteína, deje que la membrana PVDF seque por 1 h. reactivar la membrana como se indica en el paso 4.5. Bloquear la membrana 1 h con 5% de BSA en 1 x TTBS.
- Incubar la membrana con el primer anticuerpo: HuR o mesothelin, tanto diluyeron 1: 1000 en 5% de BSA en 1 x TTBS de 4 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C.
- Lavar la membrana tres veces por 7 min en 1 x TTBS e incubar con la peroxidasa conejo anti-ratón (HRP)-anticuerpo secundario conjugado diluido 1: 10,000 en 5% BSA, 1 x TTBS.
- Visualizar las proteínas mediante quimioluminiscencia mejorada y un reproductor de imágenes digital.
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Representative Results
En este experimento, un fragmento largo 25-nt de calretinin 3' UTR que es motivo (CALB2 3' UTR (son) 25-nt) fue utilizado para probar si se une específicamente a la proteína del antígeno humano R (HuR), un conocido estabilizador de mRNA. Para probar la especificidad del elemento son, un RNA 25 nt sonda CALB2 3' UTR (mtARE) que contiene una mutación son Adorno, que previamente fue demostrada para suprimir el efecto de estabilización del motivo son, fue usado6. El ARN tercera sonda representa el control negativo, que es un 28-nt sin relación ARN que contiene el elemento sensible al hierro bien definido (sin relación ARN (IRE)), conocido para atar cytosolic proteína sensible al hierro13,14. HuR es predominantemente localizado en el núcleo sino que funciona como un estabilizador de mRNA en el citosol15, extracción nuclear/citosólica se realizó para obtener las proteínas activas del cytosol.
Para demostrar la pureza de las fracciones nuclear/citosólicas, proteínas se analizaron por Western blot, que demostró eso α-tubulina se detectó sólo en la fracción citosólica, mientras que la proteína PARP fue detectada sólo en la fracción nuclear, como esperado ( Figura 1). El efluente de la CALB2 3' UTR son sonda demostrado Unión de HuR mientras que HuR estuvo ausente en el efluente de la mutante sonda CALB 3' UTR (mtARE). HuR estaba también ausente en el efluente de la sonda de RNA sin relación que une a la proteína sensible al hierro (figura 2A). Para demostrar aún más la especificidad entre el CALB 3' UTR (son) y HuR, la membrana además fue sondada con el anticuerpo anti-mesothelin (MSLN), como esta proteína no interactuar con el ARN. Eluatos de todos tres muestras no demostraron la presencia de mesothelin. Tomados en conjunto, esto indica que la estabilización son motivo dentro CALB2 3' UTR puede atar específicamente la proteína HuR.
Tinción de Coomassie del gel (figura 2B) muestra que cantidades iguales de proteínas se utilizaban para incubar con las tres diferentes sondas de RNA. Debido a la baja cantidad de extracto citosólico y transferencia a la membrana, esta coloración no permitió para la detección de proteínas en el efluente carriles (E), que si no fueron detectados por análisis de Western blot.
Figura 1: Análisis de Western blot de 5 μg de fracción de proteínas citosólicas y nucleares. La proteína PARP está presente en la fracción nuclear (N) pero ausente en la fracción citosólica de (C). Α-tubulina está presente en la fracción citosólica (C) pero ausente en la fracción nuclear (N). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Western blot muestra que HuR es capturado por 25 nt CALB2 3' UTR (son). A) FT: flujo a través de después de la incubación con la sonda de RNA; E: proteínas eluyeron a incubación y puntas de prueba de unión a RNA. Sondas: CALB2 3' UTR (mtARE) - 25-nt fragmento de calretinin 3' UTR que contiene 3 nucleótidos mutados dentro del adorno son; UR RNA (IRE) - sonda de RNA 28-nt con un elemento sensible al hierro bien definido que se une a las proteínas hierro-responsivo. La membrana más fue sondada para mesothelin (MSLN), una proteína que no interactúan con el ARN. B) Coomassie tinción del gel después de la transferencia de la proteína, demostrando que cantidades iguales de proteínas se incubaron con RNA puntas de prueba. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Sonda de RNA | Secuencia de | Concentración |
| CALB2 3' UTR (son) 25nt | UCGCUGUAUGAUUUAGGCUUCUAUG | 10 ΜM |
| CALB2 3' UTR (mtARE) 25nt | UCGCUGUAUGGUCUGGGCUUCUAUG | 10 ΜM |
| Sin relación con ARN - IRE 28nt | UCCUGCUUCAACAGUGCUUGGACGGAAC | 10 ΜM |
Tabla 1 : Secuencias de RNA puntas de prueba
| Tampón de Tris inferior para correr el gel | |
| 1.5 M | Tris Base |
| 0.40% | Solución de SDS |
| addjust pH 8,8 con HCL (6 mol/L) | |
| llenar con | dH2O |
| Superior Tris para apilar gel SDS-PAGE | |
| 500 mM | Tris base |
| 0.4% | Solución de SDS |
| Ajustar el pH a 6,8 con HCL (6 mol/L) | |
| llenar con | dH2O |
| 10 x buffer de ejecución | |
| 250 mM | Tris base |
| 1.92 M | Glicina |
| Ajustar el pH a 8.3 utilizando ácido clorhídrico (6 mol/L) | |
| llenar con | dH2O |
| Filtro o autoclave y almacenar a 4° C | |
| 1 X Running buffer | |
| 100 mL | 10 x buffer de ejecución |
| 0.05% | Solución de SDS |
| Completar hasta 1 L con | dH2O |
| 10 x Buffer de transferencia | |
| 480 mM | Tris base |
| 390 mM | Glicina |
| 0,38% | Solución de SDS |
| llenar con | dH2O |
| Nota: Filtro de 0.22 um y almacenar a 4 ° C | |
| 1 X transferencia tampón (para sistema semiseco) | |
| 20 mL | 10 x Buffer de transferencia |
| 40 mL | metanol |
| completar a 200 mL | dH20 |
| 10 X TBS (solución salina tamponada con Tris) | |
| 250 mM | Tris base |
| 1.36 M | NaCl |
| 27 mM | KCl |
| Ajustar el pH a 7.4 | |
| llenar con | dH2O |
| Filtro | |
| 1 X TTBS (salino Tris-buffer con 0.1 Tween-20) | |
| 1 X | 10 X TBS |
| 0.10% | Tween-20 |
| llenar con | dH2O |
| Buffer de captura RNA (1 X) | |
| 20 mM | Tris (pH 7.5) |
| 1 M | NaCl |
| 1 mM | EDTA |
| Tampón de Unión proteína-RNA (10 x) | |
| 200 mM | Tris (pH 7.5) |
| 500 mM | NaCl |
| 20 mM | MgCl2 |
| 1% | Tween-20 |
| Tapón de lavaje (1 x) | |
| 20 mM | Tris (pH 7.5) |
| 10 mM | NaCl |
| 0.1% | Tween-20 |
| Tampón de elución | |
| 4 mM | biotina |
| 20 mM | Tris (pH 7.5) |
| 50 mM | NaCl |
| Solución de Coomassie | |
| 0.02% | Coomassie G-250 |
| 5% | Aluminiumsulfate-(14-18)-hidrato |
| 10% | EtOH |
| 2% | ácido Orto-fosfórico |
Tabla 2: Recetas
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Discussion
3' UTRs pertenecen al genoma no codificante3, y todos los RNAs no codificantes pueden interactuar con proteínas para ejercer su función7. Cuando el genoma mamífero fue encontrado para ser transcrito lo impregna y produjeron una porción significativa de larga noncoding RNAs16, nuevas evidencias demostraron que estos larga noncoding RNAs función en la regulación de expresión génica al interactuar con remodelación de cromatina complejos17. Este conocimiento fue obtenido mediante la utilización de la prueba de RNA-telecine. Así, para comenzar a descifrar los interactianos de un RNA específico, el primer paso podría ser en vitro ensayos bioquímicos tales como RNA-desplegable, ya que es fácil de realizar.
De nota, no sólo motivos de secuencia, sino también la estructura secundaria del ARN juega un papel crítico en la funcionalidad de RNA que forman dominios esenciales para interactuar con las proteínas. La estructura secundaria puede variar en fisiológicos y condiciones en vitro y RNA-telecine pueden conducir a la identificación de falsepositives. Por ejemplo, RNA-desplegable identificado EZH2, un componente de polycomb 2 complejo represivo (PRC2), como un interactiano del X inactivo transcripción específica (Xist)18, mientras que un estudio reciente que utilizó la purificación del ARN antisentido junto con masa Espectrometría (RAP-MS) identificó otros interactianos como SHARP (SMRT y HDACS asociados proteína represora), SAF-1 (factor de fijación de andamios A) y LBR (receptor de B lamin)19. Por lo tanto, si no hay otras pruebas funcionales apoyan la interacción entre un RNA y una proteína determinada, resultados deberían además complementarse con un enfoque centrado en la proteína complementario, como immunoprecipitating la proteína dada, seguida por la extracción y Caracterización del RNA encuadernado.
El adjunto protocolo presentado se ha utilizado para detectar HuR Unión al motivo son en CALB2 3' UTR, que previamente había sido funcionalmente caracterizado por pmiRGLO-luciferase ensayo6. Debido a la pequeña cantidad de proteínas, este Protocolo no es adecuado para análisis posteriores tales como espectrometría de masas donde son necesarias grandes cantidades de proteína. En cambio, el protocolo puede utilizarse para revalidar los interactianos RNA identificados por espectrometría de masas, pero con una menor cantidad de proteínas.
Puesto que el método incluye el trabajo con RNA, que es susceptible a la degradación, se recomienda limpiar las superficies de trabajo con una solución descontaminante de Rnasa además de buenas prácticas de laboratorio estándar. Si es posible, realizar preparación de RNA etiquetado y purificación bajo flujo laminar. La pureza de la oligo RNA también puede afectar las condiciones de la Unión; así, las sondas comercialmente sintetizadas fueron HPLC purificada. Si modifica, más largos y extremadamente puros RNA oligos requiere, utilizar método de purificación de la página. Preparar alícuotas de proteínas nativas snap congelación, evitando así daños en proteínas por el método de congelación lenta y congelaciones y descongelaciones repetidas.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la concesión de la Sinergia de la Fundación de ciencia nacional suizo CRSII3 147697, la Stiftung für Angewandte Krebsforschung y Zürich Krebsliga.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NE-PER Nuclear and cytoplasmic extraction kit | Thermo Fisher Scientific | 78833 | |
| Pierce Protease Inhibitor Tablets, EDTA-free | Thermo Fisher Scientific | A32965 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit | Thermo Fisher Scientific | 20164 | Includes magnetic beads and therefore the kit need to be stored at 4 °C |
| Pierce RNA 3’ End Desthiobiotinylation Kit | Thermo Fisher Scientific | 20163 | The kit is a part of the "Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit", and needs to be stored at -20 °C unlike the pull-down kit (4 °C). |
| DynaMag-2, magnetic stand | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| Anti - HuR (MOUSE) monoclonal antibody | Thermo Fisher Scientific | - | The antibody is included in the Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit - 1:1000 in 5% BSA 1x TTBS - rabbit anti-mouse secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS |
| Anti - α - tubulin (MOUSE) monoclonal antibody | Santa Cruz | 8035 | 1:1000 in 5% BSA 1x TTBS - rabbit anti-mouse secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS |
| Anti - PARP (RABBIT) Polyclonal antibody | Cell Signaling | 9542 | 1:1000 in 5% BSA 1x TTBS - goat anti-rabbit secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS |
| Anti - Mesothelin (MOUSE) Monoclonal Antibody | Rockland | 200-301-A87 | |
| Secondary goat anti-rabbit antibody | Cell Signaling | 7074 | |
| Secondary rabbit anti-mouse antibody | Sigma-Aldrich | A-9044 | |
| RPMI - 1640 medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| FBS - Filtrated Bovine Serum | Pan Biotech | P40-37500 | |
| Penicillin - streptomycin (100x) | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| L-Glutamine solution (200 mM) | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Gibco by Life technologies | 25200-056 | |
| Mini-PROTEAN 3 Cell | Bio-Rad | 1653301 | |
| Mini Protean System Glass Plates | Bio-Rad | 1653308 | |
| Mini-PROTEAN Spacer Plates with 1.5 mm integrated spacer | Bio-Rad | 1653312 | |
| Mini-PROTEAN Comb, 10-well, 1.5 mm, 66 µL | Bio-Rad | 1653365 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell Casting Modules | Bio-Rad | 1658050 | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Thermo Fisher Scientific | AM9780 | |
| Rotiphorese gel 30 - aqueous 30% acrylamide and bisacrylamide stock solution at a ration of 37.5:1 | Roth | 3029 | |
| 20% SDS | PanReac AppliChem | A3942 | |
| PVDF transfer membrane | Perkin Elmer | NEF1002 | Need to be activated by incubating in pure methanol for 1 min followed by washing in water for 2 min |
| Trans-Blot SD semi-dry transfer cell | Bio-Rad | 1703940 | |
| Clarity Western ECL Substrate | Bio-Rad | 1705061 | |
| FusionFX Digital Imager | Vilber | - | |
| RNA oligo synthesis | Mycrosynth AG, Switzerland | - | the synthesis scale - 0.04 µmol - HPLC purified |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| Hydrochloric Acid (HCl) 6 M | PanReac AppliChem | 182883.1211 | |
| Ultra Pure 1 M Tris, pH 7.5 | Thermo Fisher Scientific | 15567027 | |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | 17904 | 50% sterile aliquots to be stored at -20°C |
| Pierce Streptavidin magnetic beads | Thermo Fisher Scientific | 88817 | Please note that these magnetic beads have an average diameter of 1 µm (range from 0.5 - 1.5 µm). Furthermore, Dynabeads-M280 Streptavidin, which are beads of homogenouse size 2.8 µm, are also used in RNA-pulldown but be aware that this may affect purification process. |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Coomassie G-250 | Applichem | A3480 | |
| Aluminiumsulfate-(14-18)-hydrate | Sigma-Aldrich | 368458 | |
| ortho-phosphoric acid | Applichem | A0637 |
References
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