Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Karakteristikk av Thymus avhengig og uavhengig av Thymus immunglobulin Isotype svar i mus med enzym knyttet Immunosorbent analysen

Published: September 7, 2018 doi: 10.3791/57843
Automatic Translation
1, 1, 2,3
1Department of Cell Biology and Neuroscience and Graduate Program in Cellular and Molecular Pharmacology, Rutgers University, 2Department of Cell Biology and Neuroscience, Rutgers University, 3Rutgers Cancer Institute of New Jersey

Summary

I dette papir beskriver vi en protokoll for å karakterisere T-avhengige og T-uavhengig immunglobulin (Ig) isotype svar i mus med ELISA. Denne metoden brukes alene eller i kombinasjon med flyt cytometri vil tillate forskere å påpeke forskjeller i B-celle-mediert Ig isotype svar i mus etter T-avhengige og T-uavhengig antigen immunisering.

Abstract

Antistoffer, også kalt som immunglobuliner (Ig), skilles ut av differensiert B-lymfocytter, plasmablasts/plasma celler, i humoral immunitet gir en formidabel forsvar mot invaderende patogener via ulike mekanismer. Ett hovedmål vaksinasjon er å indusere beskyttende antigen-spesifikke antistoffer hindre livstruende infeksjoner. Både thymus-avhengige (TD) og thymus-uavhengig (TI) antigener kan framprovosere robust antigen-spesifikke IgM reaksjoner kan også indusere dannelsen av antistoffer som isotype-byttet (IgG, IgA og IgE) og generasjon minne B-celler med hjelp som antigen presentere celler (APCs). Her beskriver vi en protokoll for å karakterisere TD og TI Ig isotype svar i mus med enzym knyttet immunosorbent analysen (ELISA). I denne protokollen, er TD og TI Ig svar vakte i mus ved intraperitoneal (IP) immunisering med hapten-konjugerte modell antigener TNP-KLH (i Alun) og TNP-polysakkarid (i PBS), henholdsvis. For å indusere TD minne svar, gis en booster immunisering av TNP-KLH i Alun ved 3 uker etter første immunisering med samme antigen/adjuvant. Musen sera høstes på ulike tidspunkt før og etter immunisering. Totalt serum Ig nivåer og TNP-spesifikke antistoffer er deretter kvantifisert med Ig isotype-spesifikke Sandwich og indirekte ELISA, henholdsvis. Riktig kvantifisere serum konsentrasjonen av hver Ig isotype, må prøver fortynnes hensiktsmessig for å passe innen lineær standard kurvene. Bruker denne protokollen, har vi konsekvent fått pålitelige resultater med høy spesifisitet og følsomhet. Når brukt i kombinasjon med andre komplementære metoder som flowcytometri, i vitro kultur splenic B celler og immunohistochemical tillater flekker (IHC), denne protokollen forskere å få et konstitusjonelt forståelse av antistoff svar i en gitt eksperimentelle.

Introduction

B-lymfocytter er den viktigste spilleren i humoral immunitet og eneste celle type i pattedyr som kan produsere antistoffer, også kalt immunglobuliner (Ig)1,2. Antistoffer utskilles av B-cellene inneholder en formidabel forsvar mot invaderende patogener via ulike mekanismer, inkludert nøytralisering, opsonization og komplementaktivering, fører til beskyttende immunitet3. Utskillelsen av antistoffer av B-celler oppnås bare etter full aktivering av bestemte B celler, som normalt krever to forskjellige signaler3. Signalet 1 videresendes ved direkte binding av antigen (Ag) til B-celle reseptor (BCR) uttrykt på overflaten av bestemte naiv B celler3. Avhengig av Signal 2, kan B celle aktivering deles inn i thymus-avhengige (TD) eller thymus-uavhengig (TI)3,4. En TD antigen svar leveres Signal 2 av aktivert beslektet CD4 T hjelper (TH) celler, som uttrykker CD154, ligand for co-stimulatory reseptoren CD40 uttrykt på B celler1,2,3. En TI antigen svar, Signal 2 kommer fra enten engasjement Toll-like reseptorer (TLRs ved 1 TI Ag) eller omfattende cross-linking av BCRs (ved 2 TI Ag) på B celler3,4. Type 1 TI (TI-1) antigener er mikrobiell ligander av TLRs, inkludert bakteriell lipopolysaccharides (LPS), viral RNAs og mikrobiell CpG DNA4,5. Type 2 TI (TI-2) antigener har svært repeterende struktur og kan levere langvarig og vedvarende signalisering til B-cellen ved flere cross-linking av BCRs4,6. Typiske eksempler på TI-2 antigener er pneumokokk polysakkarider og hapten-konjugerte polysakkarid6,7. Både TD og TI antigener kan framprovosere robust antigen-spesifikke IgM reaksjoner og kan også indusere dannelsen av antistoffer som isotype-byttet (IgG, IgA og IgE) ved hjelp av antigen presentere celler (APCs) som dendrittiske celler (DCs)1 ,2,3. Videre både TD og TI antigener kan indusere minne svar ved hjelp av APCs, men TD antigener er effektiv inducing minne B celle generasjon3,8.

I denne protokollen, er TD og TI Ig svar vakte i mus ved intraperitoneal (IP) immunisering med hapten-konjugerte modell antigener 2,4,6-trinitrophenyl-nøkkelhullet albuskjell hemocyanin (TNP-KLH) og TNP-polysakkarid (nøytral, svært forgrenet og høy masse), henholdsvis9,10,11. TD antigener brukes vanligvis med en adjuvans for å forbedre produksjonen av antistoffer12. Her i vår protokollen injiseres TNP-KLH med alum, en brukte adjuvans i immunisering studier12. Andre eksempler på adjuvants som kan brukes er fullstendig eller ufullstendig Freund's adjuvant (CFA eller IFA), monophosphoryl-lipid A / trehalose dicorynomycolate ("Ribi" adjuvant) og CpG oligodeoxynucleotides, etc.13, 14. etter immunisering, musen sera høstes på forskjellige tidspunkt og TNP-spesifikke antistoffer i sera er kvantifisert bruker Ig isotype-spesifikke enzymet knyttet immunosorbent analysen (ELISA)9,10, 11.

ELISA er en plate-baserte analysen som er mye brukt som et diagnostisk verktøy i medisin og også som en analytisk verktøy i biomedisinsk forskning15,16. Det brukes til å oppdage og kvantifisere analytter inkludert antistoffer, hormoner, cytokiner, chemokines, og ulike antigener, etc. ELISA kan utføres i flere ulike formater, inkludert direkte, indirekte, sandwich og konkurransedyktig ELISA15,16. Vanligvis innebærer immobilisering av antigen til en solid overflate, vanligvis en 96-brønnen microtiter plate, som er ruges med en primær antistoff. Etter inkubasjon er ubundet antistoffer vasket bort. I en direkte ELISA, primære antistoffer er direkte konjugert til et enzym (vanligvis pepperrotperoksidase eller alkalisk fosfatase), som kan holde seg et kromogent substrat for å gi en synlig fargeendring oppdaget av et signal-gjenkjenning instrument som en spektrofotometer15,16. I kontrast hvis et enzym knyttet sekundære antistoff binde primære antistoffer, regnes da dette som en indirekte ELISA15,16. Direkte ELISA er raskere mens indirekte ELISA er mer følsomme15,16. I en sandwich ELISA, platene er belagt med en "capture" antistoffer til nakkens antigen interesse prøvene, og deretter fanget antigen kan oppdages av en annen "oppdagelsen" antistoff i en direkte eller indirekte måte15, 16. Sandwich ELISA tilbyr høy spesifisitet siden antigen oppdages av to forskjellige antistoffer av antigen. En konkurransedyktig ELISA, konkurransen er etablert mellom eksempel antigen og plate-bundet antigen for binding til primære antistoffer og deretter antigen konsentrasjon i eksemplet er kvantifisert ved måling reduksjon i signalet fra underlaget 15 , 16. konkurransedyktige ELISA utføres med det ovennevnte formatet for direkte eller indirekte, og er nyttig for påvisning av små antigener med bare én epitope15,16.

Alternative teknikker for måling av antistoffer inkluderer radio-immunanalyse (RIA), electrochemiluminescence (ECL) analysen og overflate plasmon resonans (SPR) analysen17. RIA var den første immunanalyse utviklet som måler tilstedeværelsen av et antigen (eller antistoff) med stor detaljrikdom og følsomhet ved hjelp av radiolabeled reagenser18,19. Men på grunn av bekymringer for radioaktivt toksisitet, kasseringskostnader, holdbarhet og spesielle lisenser til å arbeide med radioaktivt materiale, ELISA er en bedre og enklere teknikk for vanlig bruker20,21. ECL er en høylig følsom analysen der chemiluminescent reaksjoner er initiert bruke elektrisitet til å generere svært reaktive arter fra stabil forløpere på overflaten av en elektrode, og kan brukes til å måle mengden av analytter (for eksempel antigener eller antistoffer)22. Men ECL krever en spesiell instrument og dermed så bredt brukes ikke som ELISA23. SPR er en direkte analyse som kan brukes til å måle binding av ligander (f.eks., antistoffer) til immobilisert molekyler (f.eks., antigener) på en sensor chip overflaten24. SPR oppdager interaksjoner i sanntid veldig spesielt og krever ikke bruk av merket reagenser som ELISA. Men SPR også krever en spesiell utstyr og har lavere følsomhet enn ELISA17. Gitt begrensninger av alternative metoder, er ELISA den mest egnet og praktisk teknikken for vår hensikt med denne protokollen. Her beskriver vi bruk av sandwich ELISA for analyse av totale Ig isotype nivåer og prosedyrene for indirekte ELISA for analyse av antigen-spesifikke Ig isotypes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne protokollen følger retningslinjene for institusjonelle Forsøksdyrutvalget etikk Rutgers University. Alle mus brukes NIH retningslinjer og under en dyr protokollen godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk komiteen.

1. forberedelse av mus og samling av naiv musen Sera

  1. Holde alle mus for immunisering eksperimenter i en bestemt patogen-fri dyr anlegget.
  2. Bruk kjønn-matchet, ung voksen (8-12 uker gamle) knockout og littermate kontroll mus som deler samme foreldre og bur for immunisering studier.
  3. Planlegg immunisering og serum samling tidsplaner som avbildet i figur 1.
  4. Høste naiv serum hver mus på 7 dager (-7 dager) før immunisering. Følg retro-orbital blødning og serum forberedelse fremgangsmåtene som beskrevet nedenfor i trinn 4.

2. forberedelse av TNP-polysakkarid (en TI Antigen) og TNP-KLH (en TD Antigen)

  1. Oppløse antigen pulver i sterilt PBS (pH 7.4) grundig å 0,5 mg/mL TNP-polysakkarid lager og 1 mg/mL av TNP-KLH lager løsninger. Aliquot hver antigen lagerløsning i sterilt microfuge rør på 0,5 mL/t, og holde dele ved-80 ° C for langtidslagring. Unngå flere freeze- og thaw av antigen dele.
  2. Injeksjon dag, beregne volumet av TNP-polysakkarid (50 µg/100 µL/mus) eller TNP-KLH (100 µg/100 µL/mus) nødvendig av antall mus skal injiseres. Tine riktig antall TNP-polysakkarid eller TNP-KLH dele ved romtemperatur (RT).
  3. TNP-KLH gassløft fortynne første Alun adjuvant (40 mg/mL) med 3 mengder sterilt PBS til en siste konsentrasjon av 10 mg/mL. Kontroller at Alun adjuvant blandingen godt suspendert før fortynning.
  4. Kombinere like volum av 10 mg/mL Alun adjuvant slurry fra trinn 2.3 og tinte TNP-KLH løsningen (1 mg/mL) i en 5 mL polypropylen tube, bland godt og ruge på 37 ° C for 30 min. forberede denne TNP-KLH/Alun blande frisk før injeksjon.

3. immunisering av mus

  1. Utføre intraperitoneal (IP) injeksjon av TNP-polysakkarid eller TNP-KLH/Alun Immunize mus med 1 mL insulin sprøyter i et biosikkerhet skap. Sett inn nålen i ca 30° vinkel fortrinnsvis i nedre høyre kvadrant av hver musen å hindre injeksjon i de indre organene.
  2. Sette inn IP 100 µL av TNP-polysakkarid per musen på dag 0 for TI Ag immunisering (figur 1A).
  3. Sette inn IP 200 µL av TNP-KLH/Alun mix (nylagde i trinn 2.4) per musen på dag 0 for TD Ag immunisering. Gjenta samme injeksjon på dag 21 som en booster immunisering for minne studier (figur 1B).
  4. Etter injeksjon, returnere hver musen til buret sitt og holde alle de injiserte mus i bestemte patogen-fri tilstand.

4. retro-orbital blødning og Serum forberedelse

  1. Høste musen sera på ulike tidspunkt: for TNP-polysakkarid immunisering, samle musen sera på dag -7 og 7 (figur 1A); for TNP-KLH/Alun immunisering, samle musen sera på dag -7, 7: 14 og 28 (figur 1B).
  2. For Retro-orbital blødning, bedøve hver mus med 5% isoflurane i 1-2 min i en biosafety CAB25. Utføre pedal refleks for å sikre tilstrekkelig anestesi hver mus.
  3. Hold bedøvet musen i den ene hånden med pekefingeren og tommelen trekke huden rundt øyeeplet slik at øyeeplet stikker ut av kontakten25. Sette inn en ikke-heparinized Pasteur pipette eller kapillarrør i en vinkel på 45° i hjørnet indre øye socket under øyeeplet25.
  4. Bruk milde press og rotere pipette eller rør forsiktig å bryte i venen og samle 150 – 200 µL av blod i pipette eller rør. Umiddelbart overføre blodet til en bakteriefri 1.5 mL microfuge rør og tilbake musen til buret sitt å gjenopprette.
  5. La blod prøver sitter på RT for 1-2 h å koagulere.
  6. Sentrifuge koagulert blodprøvene 13.000 x g i 10 min på 4 ° C. Overføre klart serum på blodpropp til en ny bakteriefri 1.5 mL microfuge tube.
  7. Gjenta trinn 4.6 en gang å fjerne gjenværende blodpropp og samle klart serum.
  8. Aliquot serum inn bakteriefri 1.5 mL microfuge rørene på 50 µL/tube, og lagre sera på-80 ° C.
  9. Alternative øye for blødninger på ulike tidspunkt slik at hvert øye er bled minst to ganger for hele eksperimentet. På terminal blødning, samle opptil 1 mL blod fra hver mus før euthanasia. Euthanize musen med 5% CO2 etterfulgt av cervical forvridning.
    Merk: Splenic B celler kan høstes for flyt cytometric analyser og i vitro kulturstudier. Vi har også forberede genomisk DNA fra splenocytes å bekrefte genotype hver mus.

5. musen Ig Isotype-spesifikke ELISA

  1. Forberede buffere og løsninger før ELISA.
    1. Forberede 500 mL kopling Buffer (PBS, pH 7.4).
    2. Forbered vaskeløsning 500 mL (PBS-T (0,05% mellom 20), pH 7.4).
    3. Forberede 100 mL blokkerer Buffer (1% BSA i PBS, pH 7.4, lagret på 4 ° C).
    4. Forberede 1 L substrat Buffer (1 M diethanolamine, pH 9.8 (97 mL av diethanolamine i 1 L H2O, pH justert med 10 M HCl) og 0.5 mM MgCl2). Beskytte Substratbufferen fra lys ved å pakke flasken med aluminiumsfolie. Butikken på 4 ° C.
    5. Forberede 100 mL stopp løsning (3 M NaOH).
  2. Pels ELISA plater:
    1. For total serum Ig isotype ELISA, pels 96-brønns immuno plater med 10 µg/mL av isotype-spesifikke fange polyklonale geit anti-musen Ig (M, G1, G2a, G2b, G3, A eller E) Abs i kopling Buffer (PBS) på 100 µL/godt.
    2. For TNP-spesifikke Ig isotype ELISA, pels 96-brønns immuno plater med 10 µg/mL av TNP(38)-BSA i PBS på 100 µL/godt.
    3. For høy affinitet TNP-spesifikke Ig isotype ELISA, pels 96-brønns immuno plater med 10 µg/mL av TNP(3)-BSA i PBS på 100 µL/vel26. Inkuber platene på 4 ° C over natten.
  3. Belegg inkubasjon vaskes platene 2 ganger med 200 µL/vel i PBS-T. Forkaste vaske bufferen og blot tørr plater (trykk hver plate opp ned på en stabel med tørkepapir) etter hver vask.
  4. Blokkere plater: legge til 200 µL/godt av sperring Buffer (1% BSA i PBS) til belagt plater og ruge platene 1t på RT.
  5. Mens platene blokkerer, forberede fortynninger av Ig isotype standarder og serumprøver blokkerer buffer i en egen, ubehandlet 96-brønns plate på 150 µL/godt.
    1. Forberede 250 ng/mL Ig isotype standarder som starter standard konsentrasjonen (St01) og gjøre 7 til 10 av 1:2 føljetong fortynninger av Ig (St02 St07 eller St10, figur 2A).
    2. Forberede musen serum eksempler på en 1: 100 eller 1:500 fortynning faktor som starter fortynning og gjøre 3 eller 4 av 1:10 føljetong fortynninger for totalt Ig isotype eller 1:5 føljetong fortynninger for TNP-spesifikke Ig isotype av hver serum prøve (figur 2A). Forberede musen serumprøver på en fortynningsfaktoren for 1:2 som starter fortynning IgE ELISA, og gjøre 3 i 1:5 føljetong fortynninger av hver serum prøve.
  6. Etter blokkering, vaske plater fra trinn 5.4 tre ganger med 200 µL/godt av PBS-T og blot tørr platene etter hver vask.
  7. Overføre 100 µL/vel utvannet Ig isotype standarder (passende for fangst og gjenkjenning Abs) og utvannet serumprøver fra trinn 5.5 til platene i trinn 5.6. Inkuber platene med standarder og eksempler på 4 ° C over natten.
  8. Vask platene 3 ganger med 200 µL/vel av PBS-T og blot tørr platene etter hver vask.
  9. Hver tallerken, Legg 100 µL/vel 10 µg/ml av en passende alkalisk fosfatase (AP)-konjugert isotype-spesifikke geit anti-musen Ig (M, G1, G2a, G2b, G3, A eller E) Abs fortynnet i blokkering Buffer.
  10. Inkuber plater med AP-konjugerte Abs 1-2 h på RT. For IgE deteksjon, ruge platene for 1-2 h på 37 ° C.
  11. Klargjør 1 mg/mL substratløsningen ved oppløsning to tabletter 5 mg fosfatase underlaget i 10 mL av Substratbufferen.
  12. Vask hver plate 5 ganger med 200 µL/godt av PBS-T og blot tørr platene etter hver vask.
  13. Legg 100 µL/godt av substratløsningen i hver plate. At reaksjonen å utvikle på RT, som vanligvis tar bare noen minutter.
  14. Lese hver plate ved 405 nm likner en microplate med tilknyttede programvaren.
    1. Klikk "Innstillinger" å sette bølgelengdene "Lm1" "405 nm" og klikk "OK".
    2. Klikk "mal" for å tilordne "tomt" brønner, "standarder" og "Ukjent" førte i henhold til 96-brønns plate-oppsettet.
    3. "Standarder" brønner, klikker du "serien" for å sette den "Første smakebit"som"St01", velg "Start fra" på "topp", og angi "replikerer" som "2". Sjekk"Sample Descriptor" og input "Standardverdien": Velg "enheter"som"ng/mL", sett "startverdi" som "250", sette "trinnvis" som "2". Klikk "OK".
    4. Klikk "Lese" å lese platen når de konsentrert standard når en optisk tetthet (OD) ~ 1.
    5. Klikk "fil"-menyen og klikk "Lagre" for å lagre filen.
    6. Klikk "lese" for å lese platen på nytt når mest konsentrerte standard nærmer seg OD405 ~ 1.5, 2 og 2,5, henholdsvis.
  15. Stoppe reaksjonen ved å legge til 25 µL/vel av 3 M NaOH. Fullfør trinn 5,12 til 5.15 for en plate samtidig.
  16. Analysere ELISA data ved hjelp av programvare som er tilknyttet microplate leseren:
    1. Kontroller OD405 verdiene av Ig isotype lese filene, og velg en passende lesing med lineær rekke standarder for detaljert analyse.
    2. Velg programmet 4-parameteren montering tegne standard kurver. Sjekk co-effektive av standardkurve (R2), som må være > 0,98 å sikre god kvalitet.
    3. Sjekk om OD405 verdiene for hvert utvalg redusere med økende fortynning faktorer. Hente konsentrasjonen av alle utvannet prøven ved å klikke "Ukjente".
    4. Velg en passende godt av hvert utvalg med OD405 i lineær av Ig isotype standardkurve konsentrasjon beregningen.
    5. Beregne serum Ig isotype konsentrasjon av hvert utvalg bruker formelen: serum Ig konsentrasjon = valgte godt konsentrasjon x fortynningsfaktoren.
  17. Tegne diagrammer og utføre statistiske analyser ved hjelp av en passende programvare9,10,11. Gjør loddrette scatter plott av serum Ig isotype nivåer sammenlignes Ig svarene på samme tidspunkt. For TD minne svar studier, gjøre tid-retters svar kurvene undersøke Ig isotype svarene før og etter økte immunisering. Bruke feilfelt vise standardavviket (SD) for hver gruppe med eksempler. Sammenligne Ig isotype svar mellom to genotyper mus, bruk kort t test tosidige data for å bestemme den statistiske betydningen. Angi p verdien < 0,05 som vesentlig forskjellige.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi har brukt denne protokollen for å undersøke rollene som en viktig regulator av immunsystemet, TRAF3, i TI og TD Ig isotype svar9,10,11. TRAF3 direkte eller indirekte regulerer signaltransduksjon en rekke medfødte og adaptive immunsystemet reseptorer, inkludert TNF reseptor gruppe, Toll-like reseptorer og T celle reseptor/CD28, blant annet27,28. Vi hypothesize at TRAF3 spiller forskjellige roller i ulike immun celle undergrupper å regulere antistoff svar. For å teste hypotesen, bestemt vi TI og TD Ig isotype svar bruker betinget TRAF3 knockout mus som har Traf3 genet spesielt slettet i B-celler og T celler myeloide celler, henholdsvis9,10, 11. Representant immunisering og serum samling tidsplaner for TI og TD Ig studier er avbildet i figur 1. Representant IgG1 og IgG2b ELISA resultater er vist i figur 2 og Figur 3 for å illustrere hvordan ELISA fungerer. Disse inkluderer plate oppsettet av Fortynnede standarder og prøver (figur 2A), et bilde av platen etter at AP underlaget (figur 2B), lese resultatene av OD405 (figur 2C, 2D), verdiene for standard fortynninger (figur 2E, 2F), standard kurver (Figur 3A, 3B), verdiene av fortynnede prøver (Figur 3C, 3D) og beregning av serum IgG1 og IgG2b konsentrasjoner i utvalgene (Figur 3E, 3F). Figur 4 viser representant resultatene av totale Ig isotypes i sera naiv mus. Vi viste statistisk økt basale serum nivåer av IgM, IgG2a, IgG2b, IgG3 og IgA i B-celle-spesifikke TRAF3- / - (B-TRAF3- / -) mus idet sammenlignet med kjønn og alder-matchet TRAF3-tilstrekkelig littermate kontroll mus (LMC). Denne hyperglobulinemia av B-TRAF3- / - mus skyldes utvidet B celle rommet i perifere lymfoide organer på grunn av forlenget overlevelse av eldre TRAF3- / - B celler9. Figur 5 viser representant resultatene av TI og TD Ig isotype svar mus til immunisering med TNP-polysakkarid og TNP-KLH, henholdsvis. Disse resultatene viste en signifikant høyere TI, TNP-spesifikke IgG3 nivå og også forhøyet TD, TNP-spesifikke IgG2b nivåer i myelogen celle-spesifikke TRAF3- / - (M-TRAF3- / -) mus enn i LMC. Slike økt TI IgG3 TD IgG2b svar observert i M-TRAF3- / - mus er sannsynlig på grunn av økt produksjon av pro-inflammatoriske cytokiner IL-6 og IL-12 TRAF3- / - makrofager og DCs etter immunisering11. Figur 6 viser representant resultatene av TD primære og minne svar mus til TNP-KLH immunisering. Disse resultatene viste delvis redusert TD IgM primære respons og defekt IgG1 primære og minne svar i T celle-spesifikke TRAF3- / - (T-TRAF3- / -) mus. Den defekte TD primære og minne svar T-TRAF3- / - mus resultatet fra nedsatt aktivering av TRAF3- / - CD4 T celler ved T-celle reseptor og CD28 co engasjement10. Samlet protokollen beskrevet i denne artikkelen som tillot oss å avgrense bestemt rollene til TRAF3 i ulike immun celle delsett i å regulere TI og TD Ig isotype svar i mus.

Figure 1
Figur 1 : Typisk TI og TD Ag immunisering og serum samling tidsplaner. (A) TNP-polysakkarid eksperimenter. (B) TNP-KLH eksperimenter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Representant IgG1 og IgG2b ELISA. (A) 96-brønns plate oppsettet inneholder brønnene tom, 7 føljetong fortynninger (1:2) mus IgG1 og IgG2b standarder (St01 til St07), og 4 føljetong fortynninger (på 1:10) av 8 musen serum prøver (S1 til S8). Konsentrasjonen av standarder er gitt nederst på hver standard godt. Fortynningsfaktoren prøvene er gitt på bunnen av hver prøve også. (B) et bilde av tallerkenen i 5 min etter at AP underlaget. Platen lese resultatene av IgG1 (C) og IgG2b (D) ved 405 nm. Verdiene i OD405 og konsentrasjoner av ulike fortynninger av musen IgG1 (E) og mus IgG2b (F) standarder. Kons, konsentrasjon. BackCalcConc, tilbake beregnet konsentrasjon. OD, optisk tetthet; AvgOD, gjennomsnittlig OD av replikat; SD, standardavvik; CV, variasjonskoeffisienten. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Representant IgG1 og IgG2b ELISA dataanalyse. Standard kurvene i IgG1 (A) og IgG2b (B). Co-effektive R2 er > 0,98 i både standard kurver. Pilene angir den lineære rekke standard kurvene. Verdiene i OD405 og konsentrasjonen av IgG1 (C) og IgG2b (D) i ukjente (utvannet serumprøver). R, området; Kons, konsentrasjon. Beregning av musen serum konsentrasjonen av IgG1 (E) og IgG2b (F) for 8 prøvene. ND, ikke oppdages av denne ELISA. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : Representant resultatene av totale Ig isotypes i sera naiv mus. Sera ble Hentet fra kjønn-passet, 10-12 uker gamle naiv LMC og B-TRAF3- / - mus (n = 10 for hver genotype; genetisk bakgrunn: 129xC57BL/6). Basal serum nivåer av totale IgM, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgA og IgE ble fastsatt av ELISA. Statistisk signifikans identifiserte med kortet t -test for tosidige data. *, signifikant forskjellig mellom LMC og B-TRAF3- / - mus (p < 0,05); **, svært signifikant forskjellig mellom LMC og B-TRAF3- / - mus (p < 0,01). Dette tallet er endret fra Xie et al. 9. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 : Representant resultatene av TI og TD Ig isotype Svar å TNP-polysakkarid og TNP-KLH immunisering, henholdsvis. Kjønn-passet, 8-12 uker gamle LMC og M-TRAF3- / - mus (genetisk bakgrunn: C57BL/6) ble vaksinert med 50 µg av TI Ag TNP-polysakkarid (toppanelet, n = 9 for hver genotype) eller 100 µg av TD Ag TNP-KLH blandet med Alun (nedre panelet, n = 12 for hver genotype). Sera ble samlet på dagen 7 etter immunisering. Serum titers anti-TNP IgM, IgG1, IgG2b, IgG3, IgA og IgE ble analysert av ELISA. Statistisk betydning ble analysert med kortet t -test for tosidige data. *, signifikant forskjellig mellom LMC og M-TRAF3- / - mus (p < 0,05). Dette tallet er endret fra Lalani et al. 11. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6 : Representant resultatene av TD primære og minne Ig Svar å TNP-KLH immunisering. Kjønn-passet, 8-10 uker gammel LMC og T-TRAF3- / - mus (n = 10 for hver genotype; genetisk bakgrunn: 129xC57BL/6) ble vaksinert med 100 µg av den TD Ag TNP-KLH blandet med Alun på dag 0. Hver musen også fikk en booster immunisering med samme Ag og adjuvant på dag 21 etter første immunisering. Serumprøver ble samlet fra mus på dag -7, 7: 14 og 28, henholdsvis. TNP-spesifikke IgM og IgG1 nivåer i serumprøver ble målt med ELISA. Grafene skildrer resultatene av 10 par LMC og T-TRAF3- / - mus (mener ± SD). Statistisk betydning ble analysert med kortet t -test for tosidige data. *, signifikant forskjellig mellom LMC og T-TRAF3- / - mus (p < 0,05); **, svært signifikant forskjellig mellom LMC og T-TRAF3- / - mus (p < 0,01); , høyt signifikant forskjellig mellom LMC og T-TRAF3- / - mus (p < 0,001). Dette tallet er endret fra Xie et al. 10. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her beskriver vi protokollen for karakterisering av TD og TI Ig isotype svar i mus med ELISA. Vellykket implementering av denne protokollen krever bruk av materialer som er angitt i tabell 1, inkludert ELISA analysen plater, immunisering Ags, musen Ig isotype-spesifikke antistoffer og standarder. Forsiktighet bør utvises bruke vev kultur behandlet plater for ELISA. Fortynninger av standarder og serumprøver bør gjøres i separate ubehandlet plater (runde-nederst) og deretter lagt inn ELISA platene. Bruker denne protokollen, har vi konsekvent fått pålitelige resultater med høy spesifisitet og følsomhet.

Avgjørende skritt i denne protokollen inkludere Ag immunisering, retro-orbital blødning og Ig isotype-spesifikke ELISA. For TD Ag immunisering, bør TNP-KLH/Alun blanding være grundig resuspended for å sikre at riktig mengde Ag/adjuvant injiseres. Hvis blodet clots i Pipetter eller kapillarrør retro-orbital blødning, umiddelbart endre til en ny Pipetter eller kapillær tube. Buffere og reagenser i ELISA bør være klar løsninger og bør ikke inneholde precipitates, som kan gi falske positive resultater med unormal OD405 verdier. I tillegg bør bobler unngås i brønnene på alle ELISA trinnene, som kan også gi falske positive eller falske negative resultater med unormal OD405 verdier. Disse tilfeldige feil kan minimeres ved å analysere prøver duplikater. Vask trinnene i ELISA fjerne ubundet reagenser og antistoffer fra brønnene. Utilstrekkelig vask forårsaker høy bakgrunnsstøy, men overdreven vask kan føre til en reduksjon i følsomheten ved å fjerne belagt antigener eller bundet antistoffer29. Antall vask ganger beskrevet i denne ELISA protokollen er optimert basert på vår erfaring.

Det bør bemerkes at ELISA har gjenkjenning grenser, som er vanligvis definert av lineær området av standard kurver. Riktig kvantifisere serum konsentrasjonen av hver Ig isotype, må prøver fortynnes hensiktsmessig for å passe innen lineær standard kurvene. Anbefaler vi testing føljetong fortynninger av prøvene å velge riktig fortynning faktorene for beregning av Ig konsentrasjon som beskrevet i denne protokollen. Men hvis resultatene viser at fortynning faktorene testet ikke gi resultater i standardkurven lineær området, ekstra ELISA må utføres med fortynning faktorer justert i henhold til ELISA resultatene. Hvis alle fortynninger testet under den nedre Deteksjonsgrensen, må opprinnelige serumprøver og mindre fortynning faktorer brukes. Hvis OD405 verdier ikke viser proporsjonal nedgangen med øke fortynningsfaktoren for alle føljetong fortynninger testet, dette indikerer at fange Ab eller belegg Ag er mettet av alle fortynnede prøver og ytterligere høyere fortynning faktorer må brukes. Etter denne protokollen, konkluderende resultater oppnås med minst 2 runder med ELISA.

Faktorer som kan påvirke antistoff svar i mus inkluderer belastning (genetisk bakgrunn), kjønn, alder, kosthold og dyr anlegget miljø30,31,32,33,34 . For eksempel, selv om mange musen stammer produsere IgG2a, visse belastninger C57BL/6 mus produserer ikke IgG2a men produserer IgG2c i stedet35,36. Nyere bevis identifiserer også commensal microbiota som en faktor som påvirker antistoff svar37,38,39,40. Tatt disse faktorene i betraktning, anbefaler vi bruk av kjønn-matchet, unge voksne littermates av ulike genotyper som deler samme foreldre og bur for TD og TI Ag immunisering eksperimenter. I tillegg musen til mus varianten er ofte observert i mus i den likt anleggspreg (Figur 4-6), tilstrekkelig Repliker antall (vanligvis n > 8) mus kreves for hver genotype eller å få statistisk meningsfulle resultater.

Ig isotype-spesifikke ELISA er nyttige ved titers av ulike Ig isotypes. Men denne metoden alene er ikke tilstrekkelig å avdekke de underliggende årsakene til observerte forskjeller i Ig isotype titers, og derfor brukes ofte i kombinasjon med en rekke supplerende tiltak. For å skille om forskjellen i Ig isotype titers skyldes forskjellig antall Ig-produserende B celler eller annen effektiviteten av B-celler på Ig produksjon, flow cytometri41,42,43 og enzym knyttet ImmunoSpot (ELISPOT)43,44,45 kan brukes. Analysere B celle overlevelse, spredning og germinal sentrum formasjon, omfatter alternative metoder flowcytometri, i vitro kultur splenic B-celler og immunohistochemical flekker etterfulgt av mikroskopi9,26 ,41,46,47. For å belyse endringer i Ig isotype bytte svar i B celler, i vitro kultur splenic B celler og kvantitativ brukt RT PCR med germline utskrifter av Ig tunge kjede genet segmenter er vanligvis41,43 ,48,49. For å undersøke årsaken til forskjeller i affinitet modning, er somatisk hypermutation (SHM) av Ig tunge kjede genet bestemt av sekvensering av VDJ regionen50,51,52. For å forstå forskjellene i minne B celle svar, frekvens og antall forskjellige minne B-celle undergrupper etter Ag immunisering kan analyseres av flyt identifisert cytometri med nylig markører for musen minne B-celler, inkludert CD38, CD80, CD73, PD-L2, CD62L og CCR68,53,54,55. Sammen tillater disse utfyllende metoder brukt i kombinasjon med gjeldende protokollen forskere å få et konstitusjonelt forståelse av antistoff svar i en gitt eksperimentelle.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Denne studien ble støttet av National Institutes of Health tilskudd R01 CA158402 (P. Xie) og R21 AI128264 (P. Xie), det amerikanske forsvarsdepartementet gi W81XWH-13-1-0242 (s. Xie), en Pilot Award fra Cancer Institute of New Jersey gjennom bevilgning nummer P30CA072720 fra National Cancer Institute (s. Xie), Busch biomedisinsk stipend (s. Xie), en Victor Stollar fellesskap (A. Lalani), og en Anne B. og James B. Leathem fellesskap (S. Zhu).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
VersaMax Tunable Microplate Reader MDS Analytical Technologies VERSAMAX Equipment to read the plates
SOFTmax PRO 5.3 MDS Analytical Technologies SOFTmax PRO 5.3 Software for the plate reader
GraphPad Prism GraphPad Prism Software for graphing and statistics
TNP-AECM-polysaccharide (FICOLL) Biosearch Technologies F-1300-10 A TI Ag for immunization
TNP-KLH Biosearch Technologies T-5060-5 A TD Ag for immunization
TNP(38)-BSA Biosearch Technologies T-5050-10 (conjugation ratio: 38) Coating Ag for TNP-specific ELISA
TNP(3)-BSA Biosearch Technologies T-5050-10 (conjugation ratio: 3) Coating Ag for high affinity TNP-specific Ig
Imject Alum Fisher Scientific  PI-77161 Alum adjuvant for immunization
Falcon Polypropylene tubes Fisher Scientific  14-959-11A For incubation of TNP-KLH/alum
BD Insulin Syringe Fisher Scientific  14-829-1B For i.p. injection of mice
Immuno 96-Well Plates, Flat-Bottom Fisher Scientific  14-245-61 For ELISA
Untreated 96-Well Microplates, Round-Bottom VWR 82050-622 For serial dilutions of standards and samples
Phosphatase substrate, 5 mg Tablets Sigma S0942-200TAB AP substrate
Diethanolamine VWR IC15251690 A component of AP substrate buffer
Goat anti-mouse IgM SouthernBiotech 1020-01 Capture Ab for mouse IgM
Goat anti-mouse IgG1 SouthernBiotech 1070-01 Capture Ab for mouse IgG1
Goat anti-mouse IgG2a SouthernBiotech 1080-01 Capture Ab for mouse IgG2a
Goat anti-mouse IgG2b SouthernBiotech 1090-01 Capture Ab for mouse IgG2b
Goat anti-mouse IgG3 SouthernBiotech 1100-01 Capture Ab for mouse IgG3
Goat anti-mouse IgA SouthernBiotech 1040-01 Capture Ab for mouse IgA
Goat anti-mouse IgE SouthernBiotech 1110-01 Capture Ab for mouse IgE
AP-Goat anti-mouse IgM SouthernBiotech 1020-04 Detection Ab for mouse IgM
AP-Goat anti-mouse IgG1 SouthernBiotech 1070-04 Detection Ab for mouse IgG1
AP-Goat anti-mouse IgG2a SouthernBiotech 1080-04 Detection Ab for mouse IgG2a
AP-Goat anti-mouse IgG2b SouthernBiotech 1090-04 Detection Ab for mouse IgG2b
AP-Goat anti-mouse IgG3 SouthernBiotech 1100-04 Detection Ab for mouse IgG3
AP-Goat anti-mouse IgA SouthernBiotech 1040-04 Detection Ab for mouse IgA
AP-Goat anti-mouse IgE SouthernBiotech 1110-04 Detection Ab for mouse IgE
Mouse IgM standard BD Biosciences 553472 TNP-specific IgM, Clone  G155-228
Mouse IgG1 standard BD Biosciences 554054 TNP-specific IgG1, Clone  107.3
Mouse IgG2a standard BD Biosciences 556651 TNP-specific IgG2a, Clone  G155-178
Mouse IgG2b standard BD Biosciences 554055 TNP-specific IgG2b, Clone  49.2
Mouse IgG3 standard BD Biosciences 553486 KLH-specific IgG3, Clone  A112-3
Mouse IgA standard BD Biosciences 550924 Mineral oil-induced IgA, Clone  MOPC-320
Mouse IgE standard BD Biosciences 557079 TNP-specific IgE, Clone  C38-2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Moise, A., Nedelcu, F. D., Toader, M. A., Sora, S. M., Tica, A., Ferastraoaru, D. E., Constantinescu, I. Primary immunodeficiencies of the B lymphocyte. Journal of Medicine and Life. 3, 60-63 (2010).
  2. Bishop, G. A., Haxhinasto, S. A., Stunz, L. L., Hostager, B. S. Antigen-specific B-lymphocyte activation. Critical Reviews in Immunology. 23, 149-197 (2003).
  3. Murphy, K. Janeway's Immunobiology. 8th Edition. 1, (2012).
  4. Vinuesa, C. G., Chang, P. P. Innate B cell helpers reveal novel types of antibody responses. Nature Immunology. 14, 119-126 (2013).
  5. Bekeredjian-Ding, I., Jego, G. Toll-like receptors--sentries in the B-cell response. Immunology. 128, 311-323 (2009).
  6. Mond, J. J., Lees, A., Snapper, C. M. T cell-independent antigens type 2. Annual Review of Immunology. 13, 655-692 (1995).
  7. Garcia de Vinuesa, C., O'Leary, P., Sze, D. M., Toellner, K. M., MacLennan, I. C. T-independent type 2 antigens induce B cell proliferation in multiple splenic sites, but exponential growth is confined to extrafollicular foci. European Journal of Immunology. 29, 1314-1323 (1999).
  8. Kurosaki, T., Kometani, K., Ise, W. Memory B cells. Nature Reviews Immunology. 15, 149-159 (2015).
  9. Xie, P., Stunz, L. L., Larison, K. D., Yang, B., Bishop, G. A. Tumor necrosis factor receptor-associated factor 3 is a critical regulator of B cell homeostasis in secondary lymphoid organs. Immunity. 27, 253-267 (2007).
  10. Xie, P., Kraus, Z. J., Stunz, L. L., Liu, Y., Bishop, G. A. TNF Receptor-Associated Factor 3 Is Required for T Cell-Mediated Immunity and TCR/CD28 Signaling. The Journal of Immunology. 186, 143-155 (2011).
  11. Lalani, A. I., Moore, C. R., Luo, C., Kreider, B. Z., Liu, Y., Morse, H. C., Xie, P. Myeloid Cell TRAF3 Regulates Immune Responses and Inhibits Inflammation and Tumor Development in Mice. The Journal of Immunology. 194, 334-348 (2015).
  12. Lee, S., Nguyen, M. T. Recent advances of vaccine adjuvants for infectious diseases. Immune Network. 15, 51-57 (2015).
  13. Gavin, A. L., Hoebe, K., Duong, B., Ota, T., Martin, C., Beutler, B., Nemazee, D. Adjuvant-enhanced antibody responses in the absence of toll-like receptor signaling. Science. 314, 1936-1938 (2006).
  14. Klinman, D. M., Currie, D., Gursel, I., Verthelyi, D. Use of CpG oligodeoxynucleotides as immune adjuvants. Immunological Reviews. 199, 201-216 (2004).
  15. Gan, S. D., Patel, K. R. Enzyme immunoassay and enzyme-linked immunosorbent assay. Journal of Investigative Dermatology. 133, 12 (2013).
  16. Shah, K., Maghsoudlou, P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA): the basics. British Journal of Hospital Medicine. 77, 98-101 (2016).
  17. Nencini, F., Pratesi, S., Petroni, G., Matucci, A., Maggi, E., Vultaggio, A. Assays and strategies for immunogenicity assessment of biological agents. Drug Development Research. 75, Suppl 1 4-6 (2014).
  18. Haber, E., Page, L. B., Richards, F. F. Radio immunoassay employing gel filtration. Analytical Biochemistry. 12, 163-172 (1965).
  19. Yalow, R. S., Berson, S. A. Immunoassay of endogenous plasma insulin in man. 1960. Obesity Research. 4, 583-600 (1996).
  20. Lequin, R. M. Enzyme immunoassay (EIA)/enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Clinical Chemistry. 51, 2415-2418 (2005).
  21. Wreghitt, T. G., Tedder, R. S., Nagington, J., Ferns, R. B. Antibody assays for varicella-zoster virus: comparison of competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), competitive radioimmunoassay (RIA), complement fixation, and indirect immunofluorescence assays. Journal of Medical Virology. 13, 361-370 (1984).
  22. Mathew, B. C., Biju, R. S., Thapalia, N. An overview of electrochemiluminescent (ECL) technology in laboratory investigations. Kathmandu University Medical Journal. 3, 91-93 (2005).
  23. Mikulskis, A., Yeung, D., Subramanyam, M., Amaravadi, L. Solution ELISA as a platform of choice for development of robust, drug tolerant immunogenicity assays in support of drug development. The Journal of Immunological Methods. 365, 38-49 (2011).
  24. Wadhwa, M., Bird, C., Dilger, P., Gaines-Das, R., Thorpe, R. Strategies for detection, measurement and characterization of unwanted antibodies induced by therapeutic biologicals. The Journal of Immunological Methods. 278, 1-17 (2003).
  25. Wolforth, J. B. Methods of Blood Collection in the Mouse. Laboratory Animals. 29, 47-53 (2000).
  26. Stunz, L. L., Busch, L. K., Munroe, M. E., Sigmund, C. D., Tygrett, L. T., Waldschmidt, T. J., Bishop, G. A. Expression of the Cytoplasmic Tail of LMP1 in Mice Induces Hyperactivation of B Lymphocytes and Disordered Lymphoid Architecture. Immunity. 21, 255-266 (2004).
  27. Xie, P. TRAF molecules in cell signaling and in human diseases. Journal of Molecular Signaling. 8, 7 (2013).
  28. Lalani, A. I., Zhu, S., Gokhale, S., Jin, J., Xie, P. TRAF molecules in inflammation and inflammatory diseases. Current Pharmacology Reports. 4, 64-90 (2018).
  29. Tate, J., Ward, G. Interferences in immunoassay. The Clinical Biochemist Reviews. 25, 105-120 (2004).
  30. Specter, S., Friedman, H. Age- and sex-related differences in antibody formation and blastogenic responsiveness of splenocytes from RIII mice developing virus-induced mammary adenocarcinoma. The Journal of the National Cancer Institute. 67, 1347-1351 (1981).
  31. Giefing-Kroll, C., Berger, P., Lepperdinger, G., Grubeck-Loebenstein, B. How sex and age affect immune responses, susceptibility to infections, and response to vaccination. Aging Cell. 14, 309-321 (2015).
  32. Kaminski, D. A., Stavnezer, J. Antibody class switching differs among SJL, C57BL/6 and 129 mice. International Immunology. 19, 545-556 (2007).
  33. Sellers, R. S., Clifford, C. B., Treuting, P. M., Brayton, C. Immunological variation between inbred laboratory mouse strains: points to consider in phenotyping genetically immunomodified mice. Veterinary Pathology. 49, 32-43 (2012).
  34. Conour, L. A., Murray, K. A., Brown, M. J. Preparation of animals for research--issues to consider for rodents and rabbits. Institute of Laboratory Animal Resources Journal. 47, 283-293 (2006).
  35. Vlkova, M., Rohousova, I., Hostomska, J., Pohankova, L., Zidkova, L., Drahota, J., Valenzuela, J. G., Volf, P. Kinetics of antibody response in BALB/c and C57BL/6 mice bitten by Phlebotomus papatasi. PLOS Neglected Tropical Diseases. 6, 1719 (2012).
  36. Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. The Journal of Immunology. 172, 2731-2738 (2004).
  37. Ruane, D., Chorny, A., Lee, H., Faith, J., Pandey, G., Shan, M., Simchoni, N., Rahman, A., Garg, A., Weinstein, E. G., et al. Microbiota regulate the ability of lung dendritic cells to induce IgA class-switch recombination and generate protective gastrointestinal immune responses. The Journal of Experimental Medicine. 213, 53-73 (2016).
  38. Chorny, A., Puga, I., Cerutti, A. Innate signaling networks in mucosal IgA class switching. Advances in Immunology. 107, 31-69 (2010).
  39. Van Praet, J. T., Donovan, E., Vanassche, I., Drennan, M. B., Windels, F., Dendooven, A., Allais, L., Cuvelier, C. A., van de Loo, F., Norris, P. S., et al. Commensal microbiota influence systemic autoimmune responses. The EMBO Journal. 34, 466-474 (2015).
  40. Nguyen, Q. N., Himes, J. E., Martinez, D. R., Permar, S. R. The Impact of the Gut Microbiota on Humoral Immunity to Pathogens and Vaccination in Early Infancy. PLOS Pathogens. 12, 1005997 (2016).
  41. Jeevan-Raj, B. P., Robert, I., Heyer, V., Page, A., Wang, J. H., Cammas, F., Alt, F. W., Losson, R., Reina-San-Martin, B. Epigenetic tethering of AID to the donor switch region during immunoglobulin class switch recombination. The Journal of Experimental Medicine. 208, 1649-1660 (2011).
  42. Chen, Z., Getahun, A., Chen, X., Dollin, Y., Cambier, J. C., Wang, J. H. Imbalanced PTEN and PI3K Signaling Impairs Class Switch Recombination. The Journal of Immunology. 195, 5461-5471 (2015).
  43. Boboila, C., Yan, C., Wesemann, D. R., Jankovic, M., Wang, J. H., Manis, J., Nussenzweig, A., Nussenzweig, M., Alt, F. W. Alternative end-joining catalyzes class switch recombination in the absence of both Ku70 and DNA ligase 4. The Journal of Experimental Medicine. 207, 417-427 (2010).
  44. Shah, H. B., Koelsch, K. A. B-Cell ELISPOT: For the Identification of Antigen-Specific Antibody-Secreting Cells. Methods in Molecular Biology. 1312, 419-426 (2015).
  45. Bonsignori, M., Moody, M. A. Simultaneous Detection of Antigen-Specific IgG- and IgM-Secreting Cells with a B Cell Fluorospot Assay. Cells. 1, 15-26 (2012).
  46. Sasaki, Y., Derudder, E., Hobeika, E., Pelanda, R., Reth, M., Rajewsky, K., Schmidt-Supprian, M. Canonical NF-kappaB activity, dispensable for B cell development, replaces BAFF-receptor signals and promotes B cell proliferation upon activation. Immunity. 24, 729-739 (2006).
  47. Goodlad, J. R., Macartney, J. C. Germinal-center cell proliferation in response to T-independent antigens: a stathmokinetic, morphometric and immunohistochemical study in vivo. European Journal of Immunology. 25, 1918-1926 (1995).
  48. Xie, P., Poovassery, J., Stunz, L. L., Smith, S. M., Schultz, M. L., Carlin, L. E., Bishop, G. A. Enhanced Toll-like receptor (TLR) responses of TNFR-associated factor 3 (TRAF3)-deficient B lymphocytes. Journal of Leukocyte Biology. 90, 1149-1157 (2011).
  49. Kaku, H., Horikawa, K., Obata, Y., Kato, I., Okamoto, H., Sakaguchi, N., Gerondakis, S., Takatsu, K. NF-kappaB is required for CD38-mediated induction of C(gamma)1 germline transcripts in murine B lymphocytes. International Immunology. 14, 1055-1064 (2002).
  50. Dudley, D. D., Chaudhuri, J., Bassing, C. H., Alt, F. W. Mechanism and control of V(D)J recombination versus class switch recombination: similarities and differences. Advances in Immunology. 86, 43-112 (2005).
  51. Lange, H., Hecht, O., Zemlin, M., Trad, A., Tanasa, R. I., Schroeder, H. W., Lemke, H. Immunoglobulin class switching appears to be regulated by B-cell antigen receptor-specific T-cell action. European Journal of Immunology. 42, 1016-1029 (2012).
  52. Moore, C. R., Liu, Y., Shao, C. S., Covey, L. R., Morse, H. C., Xie, P. Specific deletion of TRAF3 in B lymphocytes leads to B lymphoma development in mice. Leukemia. 26, 1122-1127 (2012).
  53. Bergmann, B., Grimsholm, O., Thorarinsdottir, K., Ren, W., Jirholt, P., Gjertsson, I., Martensson, I. L. Memory B cells in mouse models. Scandinavian Journal of Immunology. 78, 149-156 (2013).
  54. McHeyzer-Williams, L. J., Milpied, P. J., Okitsu, S. L., McHeyzer-Williams, M. G. Class-switched memory B cells remodel BCRs within secondary germinal centers. Nature Immunology. 16, 296-305 (2015).
  55. Elgueta, R., Marks, E., Nowak, E., Menezes, S., Benson, M., Raman, V. S., Ortiz, C., O'Connell, S., Hess, H., Lord, G. M., et al. CCR6-dependent positioning of memory B cells is essential for their ability to mount a recall response to antigen. The Journal of Immunology. 194, 505-513 (2015).

Tags

Immunologi og infeksjon problemet 139 Thymus-avhengige (TD) antigen thymus-uavhengig (TI) antigen immunglobulin (Ig) Ig isotype minne svar immunisering adjuvant enzym knyttet immunosorbent analysen (ELISA)
Karakteristikk av Thymus avhengig og uavhengig av Thymus immunglobulin Isotype svar i mus med enzym knyttet Immunosorbent analysen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lalani, A. I., Zhu, S., Xie, P.… More

Lalani, A. I., Zhu, S., Xie, P. Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay. J. Vis. Exp. (139), e57843, doi:10.3791/57843 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter