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Biochemistry

सीटू में माप और कोशिका घनत्व और Bioluminescent बैक्टीरिया के प्रकाश उत्सर्जन के सहसंबंध

Published: June 28, 2018 doi: 10.3791/57881
Automatic Translation
1, 1, 1
1Institute of Biochemistry, Graz University of Technology

Summary

Bioluminescent बैक्टीरिया जैसे कोरम संवेदन के रूप में तंत्र की एक किस्म के माध्यम से प्रकाश उत्पादन को विनियमित । इस उपंयास विधि bioluminescence की सीटू जांच में और प्रकाश उत्सर्जन के सहसंबंध कोशिका घनत्व के लिए अनुमति देता है । एक कृत्रिम bioluminescent ई कोलाई प्रणाली लक्स operons, लक्स प्रोटीन के लक्षण वर्णन, और उनके खेल की अनुमति देता है ।

Abstract

प्रकाश उत्सर्जित करने में सक्षम बैक्टीरियल प्रजातियों में से एक काफी संख्या है । उनमें से सभी एक ही जीन क्लस्टर, अर्थात् लक्स ऑपरोन हिस्सा । इस समानता के बावजूद, इन बैक्टीरिया विकास व्यवहार, प्रकाश उत्सर्जन या bioluminescence के विनियमन की तीव्रता की तरह विशेषताओं में चरम बदलाव दिखा । विधि यहां प्रस्तुत एक नव विकसित परख है कि सेल के विकास की रिकॉर्डिंग को जोड़ती है और समय पर bioluminescent प्रकाश उत्सर्जन तीव्रता एक प्लेट रीडर का उपयोग है । परिणामस्वरूप विकास और प्रकाश उत्सर्जन विशेषताओं को संबंधित बैक्टीरियल तनाव की महत्वपूर्ण सुविधाओं से जोड़ा जा सकता है, जैसे कोरम संवेदन विनियमन । bioluminescent बैक्टीरिया की एक सीमा की खेती एक विशिष्ट माध्यम की आवश्यकता है (जैसे, कृत्रिम समुद्र जल मध्यम) और निर्धारित तापमान । संभाल करने के लिए आसान, गैर bioluminescent मानक-अनुसंधान जीवाणु ई कोलाई (ई. कोलाई), दूसरी ओर, प्रयोगशाला पैमाने में उच्च मात्रा में सस्ते में खेती की जा सकती है । एक पूरे लक्स ऑपरोन युक्त प्लाज्मिड शुरू करने से ई. कोलाई शोषण प्रयोगात्मक स्थितियों को सरल बनाने और इसके अतिरिक्त भविष्य अनुप्रयोगों के लिए कई संभावनाओं को खोलता कर सकते हैं । सभी लक्स एक ई. कोलाई अभिव्यक्ति तनाव का उपयोग जीन की अभिव्यक्ति गिब्सन क्लोनिंग और सात लक्स जीन और तीन के रिब जीन युक्त चार टुकड़ों के सम्मिलन के माध्यम से एक अभिव्यक्ति प्लाज्मिड के निर्माण द्वारा हासिल किया गया था लक्स-रिब एक pET28a वेक्टर में ऑपरोन । ई. कोलाई आधारित लक्स जीन अभिव्यक्ति प्रेरित किया जा सकता है और Isopropyl के माध्यम से नियंत्रित-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) इसके अलावा bioluminescent ई. कोलाई कोशिकाओं में जिसके परिणामस्वरूप. इस प्रणाली के लाभ के लिए गैर मानक विकास की स्थिति, जैसे परिभाषित तापमान के साथ साथ कोरम विनियमन प्रतिबंध और जटिल माध्यम रचनाओं से बचने के लिए कर रहे हैं । इस प्रणाली लक्स जीन और उनके नाटक का विश्लेषण सक्षम बनाता है, लक्स ऑपरोन से संबंधित जीन के बहिष्कार से, या यहां तक कि उपंयास जीन के अलावा, एक जीवाणु तनाव से एक और luxAB जीन का आदान प्रदान, या luxCDEजैसे प्रोटीन कॉम्प्लेक्स का विश्लेषण करना.

Introduction

रहने वाले जीवों द्वारा प्रकाश के उत्सर्जन (bioluminescence) एक आकर्षक बैक्टीरिया में पाया प्रक्रिया है, कवक, कीड़ों, सूत्रकृमि, मछली, और व्यंग्य1। Bioluminescent लाइट उत्सर्जन एक chemiluminescent प्रतिक्रिया से उभर आता है जिसमें रासायनिक ऊर्जा (आंशिक रूप से) प्रकाश ऊर्जा ("ठंडी बत्ती") में तब्दील हो जाती है । bioluminescent बैक्टीरिया में, heterodimeric एंजाइम luciferase catalyzes लंबी श्रृंखला के monooxygenation, aliphatic aldehydes, जैसे tetradecanal के साथ प्रकाश उत्सर्जन के साथ इसी एसिड को ४९० एनएम2पर अधिकतम, 3.

Figure 1
चित्रा 1 : बैक्टीरियल luciferase की जनरल रिएक्शन स्कीम । बैक्टीरियल luciferase (LuxAB) catalyzes के monooxygenation लंबी श्रृंखला aldehydes (ch3(ch2)nचो) का उपयोग करके कम फ्लेविन mononucleotide (FMNH2) और आणविक ऑक्सीजन (ओ2), उत्पादों उपज लांग चेन एसिड (ch3(ch2)nCOOH), फ्लेविन mononucleotide (FMN), पानी (एच2ओ), और प्रकाश के उत्सर्जन ४९० एनएम पर केंद्रित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

इस ऑक्सीकरण के दौरान जारी ऊर्जा एक उत्साहित राज्य FMN-4a-हीड्राकसीड, जो luciferin4उत्सर्जक प्रकाश के रूप में कार्य करता है का कारण बनता है । बैक्टीरियल bioluminescence, अर्थात् LuxCDABEG में शामिल प्रोटीन, लक्स ऑपरोन द्वारा इनकोडिंग और उच्च विभिंन जीवाणु उपभेदों2,5से अधिक संरक्षित कर रहे हैं । जीन luxA और luxB heterodimeric luciferase के लिए सांकेतिक शब्दों में बदलना; है luxC, luxDहै, और luxE जीन उत्पादों एक फैटी एसिड रिडक्टेस परिसर के घटक हैं; और एक फ्लेविन रिडक्टेस6के लिए luxG encodes । bioluminescent Photobacteria के एक नंबर (जैसे, Photobacterium mandapamensis २७५६१) अतिरिक्त luxF जीन ले । इसमें बताया गया कि LuxF एक homodimeric प्रोटीन है जो असामान्य फ्लेविन व्युत्पन्न ६-(३ '-(आर)-myristyl)-FMN (myrFMN)७,८,९,१०,११ बाँधता है ,12. अतिरिक्त जीन की पहचान की गई है कि riboflavin संश्लेषण के लिए जिंमेदार है (उदाहरण के लिए, ribEBH) और इसके अलावा नियामक जीन की सूचना दी गई है, कि bioluminescence का कोरम संवेदन विनियमन में एक भूमिका निभाते हैं, विशेष रूप से Vibrio के लिए fischeri और Vibrio harveyi6,13. अत्यधिक संरक्षित जीन आदेश के बावजूद, bioluminescent बैक्टीरिया विकास व्यवहार, प्रकाश उत्सर्जन की तीव्रता, या2,5,14 bioluminescence के विनियमन की तरह विशेषताओं में उच्च भिन्नता दिखाने .

कई संशोधित उपभेदों या plasmids युक्त भागों या पूरे लक्स operons, रिपोर्टर सिस्टम के रूप में bioluminescence शोषण जाना जाता है । विभिंन अनुप्रयोगों जैसे प्रमोटर गतिविधि का निर्धारण, पर्यावरण या भोजन के नमूनों में बैक्टीरियल संदूषणों की निगरानी, Bioluminescence अनुनाद ऊर्जा स्थानांतरण (BRET), vivo में eukaryotic जीवों में संक्रमण की इमेजिंग, pyrosequencing, और इतना आगे15,16,17स्थापित किए गए थे । दिलचस्प है, तीन सबसे अक्सर इस्तेमाल किया bioluminescent रिपोर्टर सिस्टम उत्तर अमेरिकी जुगनू (Photinus pyralis), सूत्रकृमि (Photorhabdus luminescens), और समुद्र पैंशन (Renilla के प्रवेशन रोगज़नक़) से प्राप्त कर रहे हैं reniformis) । उन प्रणालियों में से कोई भी एक बैक्टीरियल मूल है, लेकिन लक्स जीन और बैक्टीरियल मूल से operons का उपयोग लागू अनुसंधान16के लिए अधिक ब्याज प्राप्त कर रहा है । बैक्टीरियल स्रोतों से bioluminescence प्रोटीन की कम प्रचुर मात्रा में आवेदन मुख्य रूप से कम स्थिरता और जीवाणुओं luminescent प्रोटीन जो उनके समुद्री निवास से संबंधित हो सकता है व्युत्पंन की दीर्घायु की वजह से है । समुद्री निवास के Bioluminescent बैक्टीरिया मानक प्रयोगशाला शर्तों के तहत नहीं जमिनीत कर रहे हैं । इन बैक्टीरिया को कृत्रिम समुद्र जल मध्यम और कम विकास/मशीन तापमान (जैसे, 28 डिग्री सेल्सियस) के रूप में विशिष्ट वृद्धि मीडिया और शर्तों, की आवश्यकता है ।

लक्स ऑपरोन विशेषताओं या अलग bioluminescent बैक्टीरियल उपभेदों, एक विधि के मानकीकरण लक्स ऑपरोन अभिव्यक्ति और विश्लेषण की एक श्रृंखला के एकल लक्स जीन की तुलना सरल बनाने के लिए एक शर्त है । इस प्रकार, पूरे लक्स एकीकरण के विचार-मानक में रिब ऑपरोन-अनुसंधान जीवाणु ई कोलाई (ई. कोलाई) उभरा । इस प्रयोजन के लिए, गिब्सन विधानसभा के लिए एक उपयोगी उपकरण के लिए कई रैखिक एकीकृत, एक अभिव्यक्ति सदिश में अतिव्यापी टुकड़े विशिष्ट प्रतिबंध साइटों के लिए आवश्यकता के बिना साबित हुआ । यह विधि भी उपयुक्त है जब डीएनए आवेषण बहुत बड़ी है (जैसे, पी mandapamensis २७५६१ luxCDABFEG-ribEBH; ~ 9 केबी ऑपरोन आकार) पीसीआर के माध्यम से परिवर्धित किया जाना है । एक लक्स ऑपरोन एकाधिक अतिव्यापी टुकड़े में अलग किया जा सकता है, तो एक अभिव्यक्ति प्लाज्मिड में इकट्ठे हो और अंत में अनुक्रम सत्यापित विधानसभा उत्पाद सीधे उच्च उपज के लिए एक उपयुक्त ई. कोलाई प्रणाली में तब्दील किया जा सकता है प्रोटीन अभिव्यक्ति18,19,20। आसान ई. कोलाई आधारित लक्स जीन अभिव्यक्ति, एक सरल सेल विकास और bioluminescent प्रकाश उत्सर्जन की रिकॉर्डिंग के संयोजन की विधि को संभालने के अलावा के लिए स्थापित हो रहे थे । विधि यहां वर्णित सीटू माप और कोशिका घनत्व और bioluminescent बैक्टीरिया के प्रकाश उत्सर्जन के सहसंबंध में अनुमति देता है ।

लक्स जीन और लक्स ऑपरोन आदेश और विभिंन bioluminescent बैक्टीरिया के विनियमन के साथ विश्लेषण, एक हाथ पर, एक कृत्रिम bioluminescent ई. कोलाई पूरे लक्स युक्त प्रणाली-पी के रिब ऑपरोन । mandapamensis २७५६१ और, दूसरी ओर, एक नव विकसित प्लेट रीडर परख सेल घनत्व और प्रकाश उत्सर्जन की सीटू रिकॉर्डिंग में संयोजन, विभिंन जीवाणु लक्स प्रणालियों के बारे में अधिक जानकारी हासिल करने में मदद करता है । इस मौलिक लक्षण वर्णन और luciferases और संबंधित एंजाइमों की तुलना बढ़ाया स्थिरता और गतिविधि के साथ पहले से ही स्थापित रिपोर्टर प्रणालियों के लिए विकल्प के लिए नेतृत्व कर सकते हैं ।

Protocol

1. डिजाइन, तैयारी, और ई कोलाई में लक्स ऑपरोन की अभिव्यक्ति

नोट: इस खंड में प्रयुक्त वाणिज्यिक किट के बारे में जानकारी के लिए सामग्री की तालिका देखें ।

  1. ई. कोलाई में लक्स ऑपरोन स्थानांतरित करने के लिए उपयुक्त प्रतिबंध साइटों और एंटीबायोटिक प्रतिरोध ब्याज की जीन के साथ एक मानक पालतू वेक्टर चुनें (जैसे, pET28a; NcoI, XhoI, कनमीसिन) ।
  2. डिजाइन टुकड़े और गिब्सन विधानसभा के लिए अतिव्यापी प्राइमरों Photobacterium mandapamensis २७५६१ (GenBank: डीक्यू 988878.2) के डीएनए अनुक्रम पर आधारित है ।
  3. डिजाइन प्राइमरों के साथ एक मानक पीसीआर प्रतिक्रिया सेट और Photobacterium mandapamensis २७५६१ के अलग जीनोमिक डीएनए के रूप में टेंपलेट (प्राइमरों और शर्तों के लिए पूरक सामग्री देखें) ।
    नोट: संबंधित बैक्टीरियल तनाव के जीनोमिक डीएनए के अलगाव पीसीआर प्रभावकारिता को बढ़ाता है ।
  4. पीसीआर प्रोडक्ट को स्पिन-कॉलम शुद्धि के जरिए शुद्ध करे ।
  5. NcoI और XhoI के साथ अलग pET28a वेक्टर के एक प्रतिबंध पाचन ३७ डिग्री सेल्सियस पर ४५ मिनट के लिए प्रदर्शन ।
  6. रैखिक वेक्टर और agarose जेल ट्रो और बाद में स्पिन कॉलम शुद्धि के माध्यम से पीसीआर टुकड़े शुद्ध ।
  7. प्रत्येक टुकड़ा और रैखिक सदिश के डीएनए एकाग्रता का निर्धारण और प्रोटोकॉल20,21के अनुसार विधानसभा के लिए इष्टतम मात्रा की गणना ।
    नोट: विधानसभा की प्रभावकारिता टुकड़ा आकार और संख्या पर निर्भर करता है और निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार समायोजित किया जा करने के लिए है20,21.
  8. एक पीसीआर ट्यूब में सभी टुकड़ों और बफर संयोजन के बाद, 1 ज के लिए ५० डिग्री सेल्सियस पर एक पीसीआर मशीन में विधानसभा मिश्रण गर्मी ।
  9. उच्च उपज प्लाज्मिड प्रतिकृति के लिए एक उचित ई. कोलाई प्रणाली में ई. कोलाई बैक्टीरियल प्लाज्मिड परिवर्तन के लिए मानक परिवर्तन प्रोटोकॉल के अनुसार इकट्ठे वेक्टर उत्पाद रूपांतरण (जैसे, ई. कोलाई TOP10 या एक्स्ट्रा लार्ज-1) ।
  10. डीएनए अलगाव के लिए नई प्लेटों पर परिवर्तन प्लेट और लकीर से कालोनियों उठाओ ।
  11. मानक प्रोटोकॉल के अनुसार प्लाज्मिड डीएनए को अलग करें ।
  12. सभी टुकड़ों सहित प्लाज्मिड की सही विधानसभा सत्यापित करने के लिए, पहले हर इकट्ठे टुकड़ा के लिए विशिष्ट प्राइमरों का उपयोग मानक प्रोटोकॉल के अनुसार एक कॉलोनी पीसीआर प्रदर्शन करते हैं ।
  13. कॉलोनी पीसीआर और बाद में agarose जेल ट्रो के लिए इसके अतिरिक्त, सही विधानसभा और सही डीएनए दृश्यों को सत्यापित करने के लिए डीएनए अनुक्रमण के लिए सभी अलग विधानसभा वैक्टर तैयार करते हैं ।
  14. उच्च उपज प्रोटीन उत्पादन के लिए एक उचित ई. कोलाई प्रणाली में ई. कोलाई बैक्टीरियल प्लाज्मिड परिवर्तन के लिए मानक परिवर्तन प्रोटोकॉल के अनुसार सत्यापित प्लाज्मिड रूपांतरण (जैसे, ई. कोलाई BL21) ।
    नोट: नीचे अभिव्यक्ति प्रोटोकॉल के साथ सीधे जारी रखें । अब भंडारण के लिए, एक ग्लिसरॉल स्टॉक की तैयारी की सिफारिश की है ।

2. संशोधित ई. कोलाई उपभेदों की अभिव्यक्ति

  1. एक रातोंरात संस्कृति पौंड मध्यम (जैसे, १०० मिलीलीटर की एक उपयुक्त मात्रा के टीका द्वारा अभिव्यक्ति के लिए ONC) तैयार ई. कोलाई BL21 कोशिकाओं के पहले से तैयार ग्लिसरॉल स्टॉक के साथ इकट्ठे प्लाज्मिड या सीधे एक से बदल के साथ परिवर्तन प्लेट । जोड़ें १०० µ कनमीसिन के एल (५० मिलीग्राम/एमएल, pET28a के एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन) और एक मशीनर शेखर में ३७ ° c और १२० rpm पर ONC गर्मी रात भर ।
  2. Inoculate मुख्य अभिव्यक्ति संस्कृति (जैसे, पौंड मध्यम के ८०० मिलीलीटर) के साथ 8 मिलीलीटर ONC और जोड़ें ८०० µ एल के कनमीसिन (५० मिलीग्राम/
  3. जब तक सेल घनत्व ०.६-०.८ (लगभग २.५ एच) के एक आयुध डिपो६०० तक पहुंचता एक मशीन शेखर में ३७ ° c और १२० rpm पर मुख्य संस्कृति की मशीन ।
  4. 28 डिग्री सेल्सियस के लिए गर्मी के तापमान को कम ।
  5. ०.१ mM के अंतिम एकाग्रता के लिए IPTG जोड़कर प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रेरित ।
    नोट: अनुभवजंय परीक्षणों से पता चला है कि 28 डिग्री सेल्सियस के तापमान में कमी से उच्चतम प्रकाश की तीव्रता दी ।
  6. जब तक वे चमक शुरू (लगभग 1 ज) कोशिकाओं का निरीक्षण करें ।
    नोट: अभिव्यक्ति के प्रयोजन पर निर्भर करता है, कोशिकाओं को अगले दिन तक उगाया जाता है और फिर काटा जाता है, या कोशिकाओं के रूप में वे चमक रहे है लंबे समय के रूप में मिलाते रखा जा सकता है (अधिकतम ४८ ज) । कोशिकाओं और किसी भी प्रोटीन की शुद्धि कटाई मानक प्रक्रियाओं के अनुसार किया जा सकता है ।

3. बैक्टीरियल Bioluminescent उपभेदों की अभिव्यक्ति

नोट: बैक्टीरियल bioluminescent उपभेदों विकास और प्रकाश उत्पादन के लिए विशिष्ट विकास मध्यम/कृत्रिम समुद्र जल माध्यम की आवश्यकता है ।

  1. तैयार कृत्रिम समुद्र जल मध्यम, दो अलग से तैयार मध्यम घटकों से बना है ।
    नोट: कृत्रिम सागर जल माध्यम की तैयारी मूल प्रोटोकॉल22से अनुकूलित किया गया था । 1 l तरल मध्यम या 1 l आगर मध्यम के लिए निम्न मात्रा में हैं ।
    1. कृत्रिम समुद्र जल मध्यम के लिए, निम्नलिखित लवण में तौलना: २८.१३ g NaCl, ०.७७ g KCl, १.६० g CaCl2 · 2H2ओ, ४.८० g MgCl2 · 6H2O, ०.११ g NaHCO3, व ३.५० g MgSO4 · 7H2हे.
    2. आसुत जल के 1 एल जोड़ें और सभी घटकों को भंग ।
    3. पौंड मध्यम के लिए, निम्नलिखित सामग्री में तौलना: 10 ग्राम खमीर निकालने, 10 ग्राम peptone, और आगर प्लेट्स के लिए, एक अतिरिक्त 20 ग्राम आगर.
    4. नल के पानी की २५० मिलीलीटर जोड़ें और घटकों को भंग ।
    5. आटोक्लेव दोनों तैयार मीडिया अलग से १२१ डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए ।
    6. प्लेटों के लिए, autoclaving और प्लेट तैयार करने के बाद सीधे कृत्रिम समुद्र जल मध्यम के ७५० मिलीलीटर के साथ २५० मिलीलीटर पौंड मध्यम का मिश्रण है ।
    7. तरल माध्यम के लिए, autoclaving के बाद या तो सीधे या जब नीचे ठंडा कृत्रिम समुद्र जल मध्यम के ७५० मिलीलीटर के साथ पौंड मध्यम के २५० मिलीलीटर गठबंधन ।
      नोट: कृत्रिम समुद्र जल मध्यम नमक वर्षण के माध्यम से पंकिल मिल सकता है ।
  2. लकीर पर जीवाणु bioluminescent उपभेदों कृत्रिम समुद्र जल मध्यम आगर प्लेटें और 24-30 डिग्री सेल्सियस पर रात भर गर्मी ।
    नोट: बैक्टीरियल उपभेदों के लंबे समय के भंडारण सामांय बैक्टीरियल संस्कृति के ग्लिसरॉल स्टॉक ठंड के माध्यम से प्राप्त की है । उपभेदों हमेशा सभी उपभेदों के लिए वर्दी शुरू करने की स्थिति को आश्वस्त करने के लिए पहली प्लेटों आगर पर लकीर होना चाहिए, तरल संस्कृतियों के लिए उपयोग करने से पहले, के विकास में एक अंतराल चरण के कारण गल के बाद ।
  3. थाली से एक एकल कॉलोनी के साथ inoculating १०० मिलीलीटर कृत्रिम समुद्र जल माध्यम से एक ONC तैयार करें । एक मशीनर शेखर में 24-30 ° c और १२० rpm पर ONC गर्मी रात भर ।
  4. ONC के 8 मिलीलीटर के साथ कृत्रिम समुद्र जल मध्यम के Inoculate ८०० मिलीलीटर ।
  5. एक मशीनी शेखर में 24-30 डिग्री सेल्सियस और १२० rpm पर बैक्टीरियल कोशिकाओं को मशीन ।
    नोट: bioluminescent बैक्टीरिया की हल्की तीव्रता प्रोफाइल दृढ़ता से तापमान के साथ बदलता रहता है । संबंधित बैक्टीरियल तनाव के प्रकाश उत्पादन के विनियामक तंत्र पर निर्भर करता है, प्रकाश उत्सर्जन लगभग 1-6 एच के बाद शुरू कर सकते हैं ।
  6. बैक्टीरियल सेल संस्कृति का निरीक्षण जब तक वे चमक शुरू (लगभग 1-6 ज) ।
    नोट: अभिव्यक्ति के उद्देश्य पर निर्भर करता है, कोशिकाओं को अगले दिन तक उगाया जाता है और फिर काटा जाता है, या कोशिकाओं के रूप में वे चमक रहे है लंबे समय के रूप में मिलाते रखा जा सकता है । कोशिकाओं और किसी भी प्रोटीन की शुद्धि कटाई मानक प्रक्रियाओं के अनुसार किया जा सकता है ।

4. में Vivo गतिविधि परख बैक्टीरियल Bioluminescent उपभेदों और संशोधित ई. कोलाई उपभेदों के लिए

नोट: उपभेदों के लंबे समय के भंडारण सामांय बैक्टीरियल संस्कृति के ग्लिसरॉल स्टॉक ठंड के माध्यम से acieved है । उपभेदों हमेशा सभी उपभेदों के लिए वर्दी शुरू करने की स्थिति को आश्वस्त करने के लिए पहली प्लेटों आगर पर लकीर होना चाहिए, तरल संस्कृतियों के लिए उपयोग करने से पहले, के विकास में एक अंतराल चरण के कारण गल के बाद ।

  1. लकीर एक आगर प्लेट पर वांछित bioluminescent जीवाणु तनाव या संशोधित ई. कोलाई तनाव और 28 डिग्री सेल्सियस रात भर में गर्मी ।
    ध्यान दें: मशीन तापमान तनाव तनाव से भिंन हो सकते है और empirically मूल्यांकन किया जाना है । करने के लिए bioluminescent जीवाणु उपभेदों और संशोधित ई. कोलाई उपभेदों की तुलना करने में सक्षम हो, विकास की स्थिति के समान होना चाहिए ।
  2. Inoculate से संबंधित तनाव के साथ मध्यम के 3 मिलीलीटर एक आगर प्लेट से एक कॉलोनी और 28 डिग्री सेल्सियस और १८० rpm में कोशिकाओं को एक मशीनी बरतन में लगभग 1-2 एच के लिए मशीन ।
  3. ६५० एनएम पर तरल संस्कृति के एक 1:10 कमजोर पड़ने के सेल घनत्व को मापने । ०.०५ के एक आयुध डिपो६५० के साथ 1 मिलीलीटर संस्कृति के लिए अनुपात और मात्रा की गणना ।
    नोट: बाद में प्लेट रीडर परख ६५० एनएम पर सेल घनत्व निर्धारित करने के लिए उपभेदों के प्रकाश उत्सर्जन से हस्तक्षेप से बचने होगा ।
  4. पिपेट संस्कृति और मध्यम की गणना की मात्रा में एक 24-अच्छी तरह से शीशे के नीचे के साथ काले दीवारों प्लेट । संशोधित ई. कोलाई तनाव के लिए, कनमीसिन के 1 µ एल जोड़ें (pET28a वेक्टर के एंटीबायोटिक प्रतिरोध) और 1 µ एल के IPTG (जीन अभिव्यक्ति की प्रेरण) के नमूनों के लिए । माप के दौरान वाष्पीकरण से बचने के लिए प्लेट पर ढक्कन लगाएं ।
    नोट: आश्वस्त करने के लिए कि pET28a वेक्टर पूरे लक्स ऑपरोन युक्त ई. कोलाई संस्कृति द्वारा खो नहीं मिलता है, कनमीसिन प्रत्येक ई. कोलाई नमूने में प्लेट कुओं में जोड़ा जाना चाहिए और कि ई. कोलाई के प्रकाश उत्पादन को आश्वस्त कोशिकाओं को मापा जा सकता है, जीन अभिव्यक्ति IPTG द्वारा प्रेरित किया जाना चाहिए । crosstalk और माप हस्तक्षेप से बचने के लिए, कांच के नीचे और पारदर्शी ढक्कन के साथ काले दीवारों अच्छी तरह से प्लेटें सबसे अच्छा परिणाम दिखाया । फिर भी, crosstalk मनाया जा सकता है और अच्छी तरह से पदों के लिए ध्यान से चुना जाना है ।
  5. माप को एक प्लेट रीडर में शुरू करें ।
    नोट: प्लेट रीडर प्रोटोकॉल एक विशेष रूप से इस परख ( पूरक सामग्रीदेखें) है कि दो माप, अवशोषण और bioluminescence को जोड़ती है के लिए विकसित स्क्रिप्ट पर आधारित है । डेटा बिंदुओं माप और 28 डिग्री सेल्सियस के एक निरंतर तापमान के बीच स्थायी झटकों के साथ हर 10 मिनट एकत्र कर रहे हैं.

Representative Results

लक्स ऑपरोन के जीन आदेश- luxCDABFEG -अत्यधिक विभिंन उपभेदों2,5,14से अधिक संरक्षित है । प्लाज्मिड के डिजाइन के लिए, अनुक्रम जानकारी bioluminescent बैक्टीरियल तनाव Photobacterium mandapamensis २७५६१ से लिया गया था और उसके जीन आदेश एक ही रखा गया था, और, भी, एकल जीन के बीच कोडिंग दृश्यों पर विचार किया गया । एप्लाइड गिब्सन क्लोनिंग रणनीति का एक योजनाबद्ध सिंहावलोकन चित्रा 2में दर्शाया गया है । कुल में चार टुकड़े, luxCDAB, luxF, luxEG, और ribEBH, 20-40 आधार युग्म अतिव्यापी अनुक्रम के साथ उत्पंन किया गया । गिब्सन20विधानसभा के सभी चरणों का पालन करने के बाद, डीएनए अनुक्रमण प्लाज्मिड के सही विधानसभा सभी टुकड़ों सहित, की पुष्टि की । लक्स-रिब ऑपरोन युक्त अंतिम असेंबली उत्पाद pET28a का वेक्टर मैप चित्रा 3में दर्शाया गया है । इस संशोधित pET28a वेक्टर का एक महत्वपूर्ण लाभ मानकीकृत ई. कोलाई विकास की स्थिति और IPTG के साथ नियंत्रित प्रेरण के उपयोग है ।

bioluminescent बैक्टीरिया और संबंधित कोशिका घनत्व के प्रकाश उत्सर्जन को मापने के लिए, एक प्लेट रीडर आधारित विधि विकसित किया गया था । प्लेट रीडर के लिए विधि प्रकाश तीव्रता और कोशिका घनत्व के लिए एकल माप लिपियों के संयोजन से उत्पंन किया गया था । इस उपंयास स्क्रिप्ट एक उपयोगकर्ता निर्धारित समय सीमा है, जो संबंधित विश्लेषण (उदा, 10 ज) के लिए इस्तेमाल किया बैक्टीरिया की पीढ़ी के समय के लिए समायोजित किया जा करने के लिए है आयुध डिपो६५० और प्रकाश तीव्रता हर 10 मिनट की माप सक्षम होना चाहिए । प्रकाश उत्सर्जन के साथ हस्तक्षेप से बचने के लिए ऑप्टिकल घनत्व की माप ६५० एनएम पर किया गया था । अवधारणा का एक सबूत के रूप में और स्वास्थ्य और ई. कोलाई कोशिकाओं के सही विकास व्यवहार आश्वासन देने के लिए, संदर्भ माप प्रदर्शन किया गया । चित्रा 4 ई. कोलाई BL21 कोशिकाओं की तुलना में, ई. कोलाई BL21 एक खाली pET28a वेक्टर युक्त कोशिकाओं, और ई. कोलाई BL21 pET28a वेक्टर युक्त लक्स-रिब ऑपरोन डालने के साथ कोशिकाओं प्रस्तुत कर रहे हैं । बाद के तनाव के लिए, कोई IPTG T7 प्रवर्तक के leakiness के कारण प्रकाश उत्सर्जन का विश्लेषण करने के लिए जोड़ा गया था । सभी तीन संदर्भ माप तीन वृद्धि चरणों (अंतराल, घातीय, और स्थिर चरण) के साथ एक sigmoidal वृद्धि वक्र दिखाते हैं । केवल ई. कोलाई BL21 लक्स के साथ वेक्टर pET28a युक्त कोशिकाओं -रिब ऑपरोन डालने के लिए शुरू करने के लिए प्रकाश उत्सर्जन, लेकिन माप जहां अभिव्यक्ति IPTG और प्रकाश के अलावा द्वारा प्रेरित है के विपरीत में 30 मिनट के बाद उत्सर्जित है, गैर प्रेरित कोशिकाओं केवल लगभग 5 घंटे के बाद चमक करने के लिए शुरू और प्रेरित प्रणाली की तुलना में एक बहुत कम प्रकाश उत्सर्जन (सीए 4 गुना) दिखाने के लिए ।

चित्रा 5 वृद्धि curves और लक्स ऑपरोन के प्रकाश तीव्रता ई. कोलाई और bioluminescent बैक्टीरियल तनाव P. mandapamensis २७५६१ में व्यक्त की तुलना देता है, या तो पौंड मध्यम या कृत्रिम सागर पानी के माध्यम में, सीटू विधि में स्थापित उपन्यास का उपयोग कर रही है. इन बैक्टीरिया की तुलना करने के लिए, माप 28 डिग्री सेल्सियस के एक मशीन तापमान पर प्रदर्शन किया गया । इस तापमान पौंड मध्यम में संशोधित ई. कोलाई तनाव की वृद्धि दर के रूप में अच्छी तरह के रूप में कृत्रिम समुद्र जल माध्यम कम हो जाती है, लेकिन bioluminescent जीवाणु उपभेदों के लिए कम तापमान महत्वपूर्ण हैं । इस तापमान निर्भरता चित्रा 5एमें दिख रहा है, के रूप में P mandapamensis २७५६१ ई. कोलाईसे एक बहुत उच्च कोशिका घनत्व से पता चलता है । इसके अलावा, जबकि ई. कोलाई उपभेदों के लिए, पौंड मध्यम उच्च कोशिका घनत्व के उत्पादन की अनुमति देता है, प्राकृतिक bioluminescent जीवाणु उपभेदों के लिए, कृत्रिम समुद्र जल माध्यम पसंद है और bioluminescence के लिए आवश्यक है । दर्ज की गई सेल घनत्व संबंधित प्रकाश तीव्रता के साथ सहसंबंधी बनाना, जैसा कि चित्रा 5बीमें दिखाया गया है । उल्लेखनीय है, bioluminescent ई. कोलाई कोशिकाओं दोनों पौंड मध्यम रूप में अच्छी तरह से कृत्रिम समुद्र पानी के माध्यम में समान प्रकाश उत्सर्जन maxima तक पहुंचने, हालांकि सबसे अधिक तीव्रता अलग समय बिंदुओं पर दर्ज की गई । इस अवलोकन के विपरीत, P mandapamensis २७५६१ पौंड मध्यम में अत्यधिक कम वृद्धि दर के साथ व्यवहार्य है, लेकिन बैक्टीरियल कोशिकाओं सब (चित्रा 5बी) में प्रकाश का उत्सर्जन नहीं किया । कृत्रिम समुद्र जल माध्यम में, पी mandapamensis २७५६१ लगभग 1 x 104 प्रति सेकंड है, जो लगभग २०० ई. कोलाईकी तुलना में कम का एक कारक है पर प्रकाश उत्सर्जन की एक अधिकतम दिखाता है । चित्रा 5 सी सापेक्ष प्रकाश इकाइयों जहां bioluminescence आयुध डिपो द्वारा सामान्यीकृत है का प्रतिनिधित्व करता है । इन परिणामों की पुष्टि करें कि न केवल एक ई. कोलाई में लक्स ऑपरोन युक्त प्लाज्मिड के सम्मिलन सफल और कार्यात्मक था, लेकिन यह भी है कि इस संशोधित ई. कोलाई तनाव भी उच्च प्रकाश उत्सर्जन के साथ एक वैध विकल्प है पैदावार और इस तरह के एक जटिल समुद्री जल मध्यम और कम तापमान के रूप में मरीना बैक्टीरिया के बैक्टीरियल bioluminescence की सीमा के बिना ।

इसके अतिरिक्त, ई. कोलाई आधारित एक लंबी अवधि के माप लक्स-रिब जीन अभिव्यक्ति पर 24 ज प्रकाश उत्सर्जन की लंबी उंर का विश्लेषण करने के लिए प्रदर्शन किया गया था (6 चित्रा) । प्रकाश उत्सर्जन १९.५ ज के लिए चली, बहुत लंबे समय तक जीवाणु उपभेदों (जैसे, P mandapamensis २७५६१) जहां एक क्रमिक कमी 10 घंटे के बाद बहुत कम प्रकाश उत्सर्जन में जिसके परिणामस्वरूप मनाया गया था ।

विकसित परख की सीमाओं को समझाने के लिए, चित्रा 7 तीन bioluminescent जीवाणु उपभेदों, अर्थात् Photobacterium mandapamensis एस 1, Photobacterium mandapamensis TH1 और Vibrio के माप परिणामों से पता चलता है harveyi १४१२६. पहले तनाव (एस 1) के लिए, विधि बहुत अच्छी तरह से काम करता है और लगभग 2 x 106के एक अधिक से अधिक bioluminescence तीव्रता से पता चलता है । अंय दो उपभेदों के लिए (TH1 और १४१२६), अधिक से अधिक प्रकाश तीव्रता निर्धारित नहीं किया जा सकता है क्योंकि दोनों द्वारा उत्पंन प्रकाश तीव्रता प्रयुक्त साधन सेटिंग्स का पता लगाने की सीमा से अधिक है । इन दो उपभेदों के लिए विकसित विधि (स्क्रिप्ट) के लिए निर्धारित लाभ मूल्य बहुत अधिक सेट किया गया था । फिर भी, bioluminescence गतिविधि की शुरुआत एक दूसरे के साथ तुलना की जा सकती है । p. mandapamensis TH1 और p. mandapamensis एस 1 लगभग ०.१-०.२ के एक आयुध डिपो६५० मूल्य, क्रमशः के बाद चमक शुरू करते हैं । इसके विपरीत, V. harveyi १४१२६ पर लगभग ५.५ h के बाद प्रकाश का उत्सर्जन करने के लिए शुरू होता है १.० के एक आयुध डिपो६५० मूल्य पर । प्रकाश उत्सर्जन की मनाया शुरुआत आयुध डिपो में एक घातीय वृद्धि के साथ ही bioluminescence के साथ है । यह ज्ञात है कि bioluminescence के V. harveyi १४१२६ कोरम संवेदन विनियमन और इसलिए एक विशिष्ट कोशिका के घनत्व की अनुमति लक्स ऑपरोन है, जो स्पष्ट रूप से चित्र 713में मनाया जा सकता है की सक्रियण को झूठ बोलना । यह परिणाम यह दर्शाता है कि सीटू प्लेट रीडर परख में इस उपंयास के साथ यह आसानी से bioluminescent बैक्टीरिया की तुलना संभव है और यह भी मोटे तौर पर निर्धारित है कि क्या एक कोरम संवेदन विनियमन हो सकता है द्वारा इन उपभेदों के एक विनियामक तंत्र को परिभाषित मनाया या नहीं ।

चित्रा 8 ई. कोलाई BL21 कोशिकाओं की अभिव्यक्ति संस्कृति का एक उदाहरण से पता चलता है इकट्ठे pET28a IPTG के साथ प्रेरण के बाद लक्स ऑपरोन युक्त प्लाज्मिड बंदरगाह । प्रेरण के बाद लगभग एक एच के बाद, ई. कोलाई कोशिकाओं एक नीले हरे रंग के साथ चमक शुरू करते हैं । चित्र 8 एक से पता चलता है ई. कोलाई अभिव्यक्ति प्रकाश में फोटो खिंचवाने और चित्रा 8बी अंधेरे में एक ही संस्कृति देता है । चित्र 8 सी mandapamensis के साथ कृत्रिम समुद्र जल मध्यम की एक आगर प्लेट को दर्शाया गया है एक ही नीले-हरे रंग की विशेषता के जीवाणु bioluminescence के लिए.

Figure 2
चित्रा 2 : एप्लाइड गिब्सन क्लोनिंग रणनीति के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व । कदम (I): अतिव्यापी प्राइमरों (रंगीन तीर; ca. 20-40 आधार जोड़ी ओवरलैप) डिज़ाइन किए गए हैं । अतिव्यापी प्राइमरों एनीलिंग एक टुकड़ा के संबंधित 5 ' और 3 ' क्षेत्र और आसंन खंड के संबंधित 3 ' और 5 क्षेत्र से मिलकर अनुक्रम होते हैं । चरण (II): विधानसभा के लिए डिजाइन टुकड़े मानक पीसीआर प्रतिक्रियाओं के माध्यम से उत्पन्न कर रहे हैं । चरण (III): लक्ष्य वेक्टर प्रतिबंध पाचन द्वारा रैखिक है (जैसे, NcoI, XhoI) । चरण (IV): सभी टुकड़ों और रैखिक वेक्टर के डीएनए सांद्रता के लिए गिब्सन विधानसभा के लिए उपयुक्त एकाग्रता को समायोजित निर्धारित किया है (निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार) । चरण (V): सभी टुकड़ों और अनुकूलित डीएनए सांद्रता के साथ रैखिक वेक्टर गिब्सन विधानसभा मास्टर मिश्रण (T5 exonuclease, डीएनए पोलीमरेज़, और डीएनए ligase) के साथ संयुक्त कर रहे है और 1 घंटे के लिए ५० डिग्री सेल्सियस पर मशीन है (VI): विधानसभा उत्पाद बदल रहा है उच्च उपज प्लाज्मिड प्रतिकृति के लिए एक उचित ई. कोलाई तनाव में मानक प्रोटोकॉल के अनुसार (जैसे, ई. कोलाई TOP10 या एक्स्ट्रा लार्ज-1) । कदम (VII): प्लाज्मिड के सही विधानसभा सत्यापित करने के लिए, इकट्ठे प्लाज्मिड के डीएनए अनुक्रमण किया जा करने के लिए है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : लक्स-रिब ऑपरोन युक्त pET28a का वेक्टर नक्शा. पी mandapamensis २७५६१ के लक्स-रिब ऑपरोन को मूल जीन क्रम (luxCDABFEG-ribEBH) में pET28a के मल्टीपल क्लोनिंग साइट में डाला जाता है. NcoI और XhoI क्लोनिंग के लिए इस्तेमाल प्रतिबंध साइटों रहे हैं । ऑपरोन के गिब्सन विधानसभा के लिए इस्तेमाल टुकड़े नारंगी में luxCDAB हैं, हरे रंग में luxF , luxEG में नीले और ribEBH में लैवेंडर; एक टुकड़े के भीतर जीन एक अलग बॉक्स के रूप में दिखाया जाता है । ऑपरोन के प्रत्येक जीन के बीच कोडिंग अनुक्रम लागू क्लोनिंग रणनीति में शामिल हैं । pET28a के अंतिम प्लाज्मिड आकार पूरे लक्स युक्त-रिब ऑपरोन १४,६२५ आधार जोड़े है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : विकास घटता है और संदर्भ उपभेदों के प्रकाश तीव्रता की तुलना । ६५० एनएम पर आयुध डिपो और प्रति सेकंड गिनती में bioluminescence तीव्रता 28 डिग्री सेल्सियस पर 10 घंटे से अधिक हर 10 मिनट मापा गया । सभी माप चार तकनीकी प्रतिकृति प्रत्येक के साथ तीन जैविक प्रतिकृति का मतलब मान रहे हैं । त्रुटि पट्टियां मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं । ई. कोलाई BL21 कोशिकाओं (ग्रे चौकों), ई. कोलाई BL21 कोशिकाओं को एक खाली pET28a वेक्टर युक्त (ग्रे हलकों), और ई. कोलाई BL21 लक्स के साथ वेक्टर pET28a युक्त कोशिकाओं -रिब ऑपरोन डालने (काला हीरा) के लिए विश्लेषण किया गया हमारे ई. कोलाई कोशिकाओं के सही विकास व्यवहार आश्वासन देता हूं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए । 

Figure 5
चित्रा 5 : वृद्धि curves और लक्स ऑपरोन के प्रकाश तीव्रता के मुक़ाबले ई. कोलाई (चौकों) और P. mandapamensis २७५६१ (हलकों) में पौंड मध्यम (खुले प्रतीकों) या कृत्रिम समुद्र जल मध्यम (भर प्रतीकों) में व्यक्त की । सभी माप चार तकनीकी प्रतिकृति प्रत्येक के साथ तीन जैविक प्रतिकृति का मतलब मान रहे हैं । त्रुटि पट्टियां मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं । सभी प्रयोगों 28 डिग्री सेल्सियस के एक मशीन तापमान पर प्रदर्शन किया गया । (एक) ऑप्टिकल घनत्व (आयुध डिपो) माप पर ६५० एनएम 10 के लिए हर 10 मिनट प्रदर्शन किया गया एच. ई. कोलाई लक्स ऑपरोन अभिव्यक्ति (बाएं पैनल) पौंड मध्यम और कृत्रिम समुद्र जल मध्यम में mandapamensis २७५६१ (सही पैनल) की तुलना में है । bioluminescence-व्यवधान से बचने के लिए सेल घनत्व ६५० एनएम पर निर्धारित किया जाता है । (ख) प्रकाश की तीव्रता का मापन (bioluminescence [गणना/एस) 10 एच. ई. कोलाई लक्स ऑपरोन अभिव्यक्ति (बाएं पैनल) के लिए हर 10 मिनट की तुलना में पौंड मध्यम और कृत्रिम सागर में P. mandapamensis २७५६१ (दायां पैनल) के लिए किया गया है पाणी मध्यम आहे. (ग) रिश्तेदार प्रकाश तीव्रता (RLU/ लक्स ऑपरोन के आयुध डिपो) ई. कोलाई (बाएं पैनल) और P. mandapamensis २७५६१ (दायां पैनल) में व्यक्त कोशिका घनत्व को सामांय bioluminescence द्वारा निर्धारित कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6 : वृद्धि curves और ई. कोलाई आधारित लक्स जीन अभिव्यक्ति के प्रकाश तीव्रता की तुलना के लिए 24 एच । ६५० एनएम पर आयुध डिपो और प्रति सेकंड गिनती में bioluminescence तीव्रता 28 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे में हर 10 मिनट मापा गया । सभी माप चार तकनीकी प्रतिकृति प्रत्येक के साथ तीन जैविक प्रतिकृति का मतलब मान रहे हैं । त्रुटि पट्टियां मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं । इसके अतिरिक्त, सापेक्ष प्रकाश तीव्रता (RLU/आयुध डिपो) जहां bioluminescence कोशिका घनत्व द्वारा सामान्यीकृत है प्रतिनिधित्व कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्र 7 : संभावित कोरम संवेदन विनियमन का मूल्यांकन करने के लिए bioluminescent बैक्टीरिया की तुलना. प्रकाश उत्सर्जन और कोशिका घनत्व 10 घंटे के लिए हर 10 मिनट मापा जाता है और चार तकनीकी प्रतिकृति प्रत्येक के साथ तीन जैविक प्रतिकृति के अर्थ मूल्यों का प्रतिनिधित्व करते हैं । त्रुटि पट्टियां मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं । Photobacterium mandapamensis TH1 (काले चौकों), Vibrio harveyi १४१२६ (ग्रे हलकों) और Photobacterium mandapamensis s (ग्रे हीरे) की माप एक दूसरे की तुलना में थे; (क) ६५० एनएम पर ऑप्टिकल घनत्व (आयुध डिपो) चित्रित, (ख) प्रकाश तीव्रता (bioluminescence [गिनती/एस), और (ग) सापेक्ष प्रकाश तीव्रता (RLU/ कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 8
चित्र 8 : तरल मीडिया में Bioluminescence प्लेटों पर और आगर । (क) ई. कोलाई BL21 कोशिकाओं के साथ 2 एल पौंड मध्यम inoculated के साथ 5 एल कुप्पी pET28a लक्स ऑपरोन प्लाज्मिड तस्वीर प्रकाश में व्यक्त. (ख) में के रूप में एक ही संस्कृति (क) अंधेरे में फोटो खिंचवाने । चित्र A और B को अभिव्यक्ति की प्रेरण के बाद लगभग 2 ज लिया गया था । (ग) कृत्रिम समुद्र जल मध्यम आगर mandapamensis की लकीर वाली संस्कृति के साथ प्लेट एस s तस्वीर अंधेरे में । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

एक अभिव्यक्ति के निर्माण प्लाज्मिड चार टुकड़े से युक्त पूरे लक्स-रिब ऑपरोन पी mandapamensis २७५६१ की रचना गिब्सन क्लोनिंग के माध्यम से प्राप्त किया गया था । इस ई. कोलाई आधारित लक्स जीन अभिव्यक्ति ई. कोलाई कोशिकाओं प्रकाश उत्सर्जन करने के लिए सक्षम बनाता है । कोरम संवेदन विनियमन और गैर मानक विकास की स्थिति से परहेज इस प्रणाली के पर्याप्त लाभ हैं ।

गिब्सन क्लोनिंग रणनीति का उपयोग कर के लाभ एकाधिक रैखिक डीएनए टुकड़े, उच्च लचीलापन और विशिष्ट प्रतिबंध साइटों के लिए कोई ज़रूरत नहीं की आसान विधानसभा18,19,20हैं । इस विधि को आसानी से एक लक्स ऑपरोन बदलने के लिए, एकल जीन या जीन समूहों को छोड़कर या नए जीन शुरू करने या दूसरे के साथ एक तनाव से जीन का आदान प्रदान की अनुमति देता है । इस विधि के आवेदन के लिए एक शर्त संबंधित लक्स ऑपरोन जीन अनुक्रम की उपलब्धता है । केवल bioluminescent बैक्टीरिया की एक छोटी संख्या के लिए संबंधित लक्स ऑपरोन के पूर्ण डीएनए अनुक्रम ज्ञात और/ इन दृश्यों में से कई क्योंकि वे बन्दूक अनुक्रमण का उपयोग कर उत्पन्न किया गया खंडित कर रहे हैं । जांच में mandapamensis के मामले में २७५६१ लक्स ऑपरोन का पूरा डीएनए अनुक्रम जाना जाता है और NCBI जीन डाटाबेस (GenBank: डीक्यू 988878.2) से उपलब्ध है ।

गिब्सन विधानसभा के प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम एक टुकड़े के डीएनए एकाग्रता की गणना है । निर्माता के असेंबली प्रोटोकॉल में यह ०.२-०.५ pmols और 4-6 टुकड़े20,21के लिए 20 µ एल की कुल मात्रा का उपयोग करने की सिफारिश की गई थी । हमारे मामले में, जहां luxCDABFEG-ribEBH 4 टुकड़े शामिल है, सांद्रता और कुल मात्रा ०.१ pmol और ४५ µ एल थे, क्रमशः, पीसीआर उत्पादों की उपज पर निर्भर करता है । एक तरफ तो एकाग्रता कम करनी पड़ती थी और दूसरी तरफ, मात्रा को बढ़ाना पड़ता था । फिर भी, विधानसभा बहुत अच्छी तरह से काम किया और डीएनए अनुक्रमण पहले प्रयास में सही प्रविष्टि की पुष्टि की । यह खोज हमारी जांच, जो आसानी से18,19,20संशोधित किया जा सकता है के लिए एक मजबूत और उपयुक्त विधि के रूप में गिब्सन विधानसभा की पुष्टि की ।

नव स्थापित प्लेट रीडर परख एक आसान तरीका संभाल रहा है । यह नए या (संयुक्त राष्ट्र-) bioluminescent जीवाणु उपभेदों ज्ञात के एक साधारण प्राथमिक विश्लेषण सक्षम बनाता है और पहले से ही प्रकाश उत्पादन के विनियामक तंत्र पर पहले संकेत देता है (जैसे, कम सेल घनत्व में luminescence में अंतराल) । इसके अतिरिक्त, प्रकाश उत्पादन के साथ संयोजन में वृद्धि की स्थिति आसानी से बस विकास मध्यम या तापमान बदल द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है ।

प्लेट रीडर के साथ माप 28 डिग्री सेल्सियस पर प्रदर्शन किया गया । इस असामांय सेटिंग के लिए कारण bioluminescent जीवाणु उपभेदों के तापमान संवेदनशीलता है, जहां 30 डिग्री सेल्सियस से ऊपर तापमान कम या यहां तक कि कोई वृद्धि और/ ध्यान दें, कि प्लेट रीडर एक लापता सक्रिय शीतलन प्रणाली की सीमा के साथ समय के साथ एक निर्धारित तापमान रखने में सक्षम है । इसलिए, परिवेश के तापमान माप के तापमान के नीचे हो गया है ।

अवधारणा का एक सबूत के रूप में, ई. कोलाई bioluminescent तनाव पी mandapamensis के साथ निर्माण की तुलना (चित्रा 5) एक हाथ पर और संदर्भ माप (4 चित्रा) दूसरे हाथ पर प्रदर्शन किया और पुष्टि कर रहे थे इस नव स्थापित प्रणाली की विश्वसनीयता । साथ ही, लंबी अवधि के माप प्रकाश उत्सर्जन (चित्रा 6) की दीर्घायु का आश्वासन दिया । लेकिन एक विचार है कि आयुध डिपो मूल्यों एक निश्चित ऑप्टिकल घनत्व के ऊपर विश्वसनीय नहीं हैं, उपयोग माप डिवाइस की विशेषताओं पर निर्भर करता है (लगभग 15 वर्तमान मामले में एच) जहां एक उपयुक्त कमजोर पड़ने में एक माप के लिए आवश्यक होगा डिटेक्टर की रैखिक रेंज । इन उच्च प्रसरण में आयुध डिपो मान इन लंबे समय तक माप विश्वसनीय नहीं है । इसलिए, ऐसे 10 एच के रूप में कम माप प्रयोगात्मक सेटअप का उपयोग कर सिफारिश कर रहे है यहां की सूचना दी ।

स्थापित प्लेट रीडर परख की सीमाएं चित्रा 7में देखा जा सकता है । कठिनाई माप की एक उपयुक्त सेटिंग को खोजने के लिए है । ' गेन वैल्यू ' फोटो गुणक ट्यूब (पीएमटी) की संवेदनशीलता को समायोजित करता है । लाभ PMT में संकेत के प्रवर्धन है, जिसका अर्थ है कि एक उच्च लाभ कारक संकेत में वृद्धि होगी. लाभ बहुत कम सेट है, तो शोर अनुपात करने के लिए संकेत बड़ा और प्रकाश की तीव्रता हो जाता है "कम" चमक bioluminescent बैक्टीरिया किसी भी अधिक मापा जा सकता है (शून्य करने के लिए करीब संकेत, नहीं दिखाया डेटा). एक bioluminescent परख में चुनौती को लाभ तो सेट सभी जीवाणु उपभेदों के लिए माप परिणाम साधन की सीमा के भीतर रहना है । इसके अतिरिक्त, माप सीमा luminescence के लिए माप अंतराल समय (जैसे, 1 s के लिए अधिकतम २,०००,०००) पर निर्भर करता है ।

लाभ २८००, जो empirically परीक्षण किया गया था और विशिष्ट प्लेट इस पद्धति की स्थापना के लिए इस्तेमाल रीडर के लिए चुना गया था । प्रयुक्त लाभ सेटिंग bioluminescent ई. कोलाई सिस्टम, p mandapamensis २७५६१, और p. mandapamensis एस के द्वारा अधिकतम उत्सर्जित प्रकाश की रिकॉर्डिंग की अनुमति देता है एक ओवरफ़्लो के बिना, लेकिन उपभेदों के लिए p mandapamensis TH1 और V. harveyi १४१२६ लाभ बहुत अधिक था । इसलिए, इन बाद उपभेदों का पता लगाने की सीमा से अधिक है और असली अधिक से अधिक प्रकाश तीव्रता मापा नहीं जा सकता । इस तकनीकी सीमा bioluminescent बैक्टीरिया है, जो अधिकतम प्रकाश उत्सर्जन में उच्च रूपांतरों दिखाने की तुलना को रोकने सकता है, हालांकि विकास की स्थिति और कोशिका घनत्व तुलनीय हो सकता है ।

प्रयुक्त अच्छी तरह से प्लेटों के भीतर विश्लेषित बैक्टीरियल उपभेदों की स्थिति empirically मूल्यांकन किया जाना है । हालांकि कांच के नीचे से काले अच्छी तरह से प्लेटें इस्तेमाल किया गया, नमूनों के बीच crosstalk मनाया गया । विशिष्ट उपभेदों के प्रकाश की तीव्रता इतनी अधिक है, कि सभी पड़ोसी कुओं झूठी सकारात्मक प्रकाश उत्सर्जन दिखाएगा (जैसे, रिक्त) । इसलिए, यह दो अलग उपभेदों या तो अलग से या एक दूसरे के लिए एक निश्चित स्थानिक जुदाई के साथ उपाय महत्वपूर्ण है ।

वहां पहले से ही कई संशोधित ई. कोलाई उपभेदों जाना जाता है कि लक्स ऑपरोन के कुछ हिस्सों में होते है और मुख्य रूप से आवेदन उंमुख15,16,17। तरीकों यहां वर्णित है, मौलिक अनुसंधान पर उद्देश्य, उदाहरण के लिए प्रत्येक लक्स जीन अलग विश्लेषण की संभावना है । हालांकि bioluminescence के शोध का एक लंबा इतिहास रहा है, फिर भी कई खुले सवाल हैं. को छोड़कर या लक्स ऑपरोन से जीन शुरू करने, एक और तनाव से जीन के साथ luxAB जीन का आदान प्रदान, या प्रोटीन परिसरों का विश्लेषण, आसान ई. कोलाई प्रणाली और प्लेट के आगे आवेदन संभाल में एंबेडेड रीडर परख, यह विनियामक प्रक्रियाओं और लक्स जीन के कार्यों के बारे में अधिक जानकारी प्राप्त करने के लिए संभव हो सकता है ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम प्लेट रीडर के लिए स्वयं की लिखी पटकथा स्थापित करने में उनके समर्थन के लिए Wladislaw Maier (बीएमजी Labtech GmbH) का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । इस काम को ऑस्ट्रिया के "शौकीनों zur Förderung डेर wissenschaftlichen Forschung" (FWF) से पीएम (P24189) और पीएचडी प्रोग्राम "कासलीवाल आणविक Enzymology" (W901) ने पीएम को सपोर्ट किया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NEBuilder High-Fidelity DNA Assembly Cloning Kit New England Biolabs Inc. E2621S for 10 rxn
dx.doi.org/10.17504/protocols.io.cwaxad
Phusion Polymerase  Thermo Scientific F530S
Q5 High Fidelity DNA Polymerase New England Biolabs Inc. M0491S
GeneJet Genomic DNA Purififcation Kit Thermo Scientific K0721 for 50 rxn
Restriction enzymes and buffer (NcoI, XhoI) New England Biolabs Inc. R3193S/R0146S
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up kit  Promega A9282 for 250 rxn
Monarch DNA Gel Extraction Kit  New England Biolabs Inc. #T1020S for 50 rxn
GeneJet Plasmid Miniprep Kit  Thermo Scientific K0503 for 250 rxn
GoTaq G2 DNA Polymerase Promega M7841
24-well black sensoplate with glass bottom Greiner Bio One 662892
FLUOStar Omega plate reader  BMG Labtech
OPTIMA/Mars Analysis Software BMG Labtech Version 2.20
Microsoft Excel 2010 Microsoft
Multitron Standard Incubator Shaker Infors AG

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References

  1. Widder, E. A. Bioluminescence in the Ocean: Origins of Biological Chemical, and Ecological Diversity. Science. 328 (5979), 704-708 (2010).
  2. Dunlap, P. Bioluminescence, Microbial. Encycl Microbiol. , 45-61 (2009).
  3. Ulitzur, S., Hastings, J. W. Evidence for tetradecanal as the natural aldehyde in bacterial bioluminescence. Proc Natl Acad Sci USA. 76 (1), 265-267 (1979).
  4. Kurfürst, M., Ghisla, S., Hastings, J. W. Characterization and postulated structure of the primary emitter in the bacterial luciferase reaction. Proc Natl Acad Sci USA. 81, 2990-2994 (1984).
  5. Dunlap, P. Biochemistry and genetics of bacterial bioluminescence. Biolumin Fundam Appl Biotechnol. 1, 37-64 (2014).
  6. Meighen, E. A. Bacterial Bioluminescence: Organization, regulation, and application of the lux genes. FASEB J. 7, 1016-1022 (1993).
  7. Moore, S. A., James, M. N. G., O'Kane, D. J., Lee, J. Crystallization of Photobacterium leiognathi non-fluorescent flavoprotein with limited sequence identity to bacterial luciferase. J Mol Biol. 224, 523-526 (1992).
  8. Moore, S. A., James, M. N. G., O'Kane, D. J., Lee, J. Crystal structure of a flavoprotein related to the subunits of bacterial luciferase. EMBO J. 12 (5), 1767-1774 (1993).
  9. Moore, S. A., James, M. N. G. Common structural features of the luxF protein and the subunits of bacterial luciferase: Evidence for a (βα)8 fold in luciferase. Protein Sci. 3, 1914-1926 (1994).
  10. Moore, S. A., James, M. N. G. Structural refinement of the non-fluorescent flavoprotein from Photobacterium leiognathi at 1.60 Å resolution. J Mol Biol. 249, 195-214 (1995).
  11. Kita, A., Kasai, S., Miyata, M., Miki, K. Structure of flavoprotein FP390 from a luminescent bacterium Photobacterium phosphoreum refined at 2.7 Å resolution. Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr. 52 (1), 77-86 (1996).
  12. Bergner, T., et al. Structural and biochemical properties of LuxF from Photobacterium leiognathi. Biochim Biophys Acta - Proteins Proteomics. 1854 (10), 1466-1475 (2015).
  13. Defoirdt, T., Boon, N., Sorgeloos, P., Verstraete, W., Bossier, P. Quorum sensing and quorum quenching in Vibrio harveyi: Lessons learned from in vivo work. ISME J. 2 (1), 19-26 (2008).
  14. Meighen, E. Genetics of bacterial bioluminescence. Annu Rev Genet. 28, 117-139 (1994).
  15. Kelkar, M., De, A. Bioluminescence based in vivo screening technologies. Curr Opin Pharmacol. 12 (5), 592-600 (2012).
  16. Waidmann, M. S., Bleichrodt, F. S., Laslo, T., Riedel, C. U. Bacterial luciferase reporters: The Swiss army knife of molecular biology. Bioeng Bugs. 2 (1), 8-16 (2011).
  17. Wilson, T., Hastings, J. W. Bioluminescence living lights, lights for living. , Harvard University Press. (2013).
  18. Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  19. Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome. Nat Methods. 7 (11), 901-903 (2010).
  20. Gibson, D. G. Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments. Methods Enzymol. 498, 349-361 (2011).
  21. NEB NEBuilder HiFi DNA Assembly Reaction. , (2015).
  22. Atlas, R. M. Handbook of Microbiological Media, Third Edition. , CRC Press. (2004).

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<em>सीटू में</em> माप और कोशिका घनत्व और Bioluminescent बैक्टीरिया के प्रकाश उत्सर्जन के सहसंबंध
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Brodl, E., Niederhauser, J., Macheroux, P. In Situ Measurement and Correlation of Cell Density and Light Emission of Bioluminescent Bacteria. J. Vis. Exp. (136), e57881, doi:10.3791/57881 (2018).

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