Summary
Yeni bir kuvvet-kelepçe rheometry teknik bir ses bobini motor ve bir kuvvet sensör arasında gergin düşük hacimli protein bazlı hidrojel örnekleri mekanik özelliklerini araştırmak için kullanılır. Bir analog oransal-integral-türev (PID) sistemi 'için istenen protokol deneyimli kuvvet sıkma için' sağlar.
Abstract
Burada, protein bazlı hydrogels biyomekanik özellikleri tanımlamak için bir kuvvet-kelepçe rheometry yöntemi açıklanmaktadır. Bu yöntem bir analog oransal-integral-türev (PID) sistemi bir doğrusal ses bobini motor ve güç dönüştürücü gergin silindirik protein bazlı hidrojel örnekleri üzerinde kontrol-force iletişim kuralları uygulamak için kullanır. İşlem sırasında ölçülen ve ayar noktası kuvvetleri arasındaki farkı en aza indirerek bir önceden tanımlanmış kuvvet protokolü takip etmek hidrojel örnek uzantısı PID sistemi ayarlar. Hydrogels protein bazlı benzersiz bu yaklaşım son derece düşük hacimli hidrojel örnekleri (< 5 µL) farklı protein konsantrasyonları ile hayvan zinciri sağlar. Burada uygulanan stres artırır ve doğrusal olarak zamanla azalır, kuvvet rampa protokolleri altında sistem (BM) proteinler ve standart elastik ölçümü katlama ile ilişkilendirilen esneklik ve histeresis davranışlar çalışma sağlar ve visko elastik parametreler. Sabit-kuvvet, güç darbe bir adım benzeri şekli, elastik yanıt, kusura bakma ama değişikliği yürürlükte, sahip olduğu unfolding ve refolding protein etki alanından gelen viskoelastik yanıt dan bilgisini iletmiyor altındadır. Düşük hacimli örnek ve çeşitli mekanik tedirginlikler uygulanmasında çok yönlülük nedeniyle kuvvet-kelepçe rheometry proteinlerin bir toplu yaklaşım kullanarak kuvveti altında mekanik yanıt araştırmak için optimize edilmiştir.
Introduction
Benzersiz fiziksel özelliklere sahip olma dışında protein bazlı hydrogels kuvvet Spektroskopi böylece protein kalabalık ortamlarda çalışma etkinleştirme bir 'Çek', içinde birkaç milyar molekülleri ölçümü etkinleştirerek devrim sözü tutun, Bu deri ve diğer doku karşılaştı benzer. Ortakları ve kimyasal koşullar bağlayıcı protein etki alanları zorlamak için biyomekanik cevapları çalışma izin hydrogels içinde katlanmış olarak kalır. Buna ek olarak, hydrogels içinde protein etki alanlarının biyomekanik yanıt tek molekül kuvvet Spektroskopi teknikleri ile görülen yanıt benzer. Örneğin, kimyasal denatüranlar ve oksitleyici ajanlar istikrar katlanmış devletin tek protein etki alanı düzey1,2,3 hem de makroskopik düzey4,5 azaltmak , 6 , 7. benzer şekilde, osmolytes hydrogels, visko elastik yanıt azalmasına aynı koşullar7,10kuvvet için önde gelen tek proteinler8,9, kararlılığı artırır.
Birkaç yaklaşım hydrogels, protein bazlı sentez için tarafından uygulanmış olan fiziksel etkileşimleri11,12 -kovalent cross-linking4,13kullanarak. Kovalent reaksiyonları sabit cross-linking yerlerde için izin ve bu hydrogels mekanik veya kimyasal tedirginlikler kaldırılması üzerine başlangıç durumu kurtarabilirsiniz. Amonyum Persülfat (APS) bir oksidan ve Rutenyum (II) tuzu kullanarak bir başlatıcı (Şekil 1)14olarak maruz Tirozin amino asitler arasındaki kovalent karbon-karbon bağları oluşturan kovalent cross-linking için başarılı bir yaklaşım kullanır. Beyaz ışığa maruz kalma konsantre proteinlerin bir çözüm-ebilmek var olmak dönük hidrojel. Reaksiyon başlar, protein-APS karışımı herhangi bir döküm formu enjekte edilebilir güncelleştirip kontrol ederek Politetrafloroetilen (PFTE) gibi tüpler (Şekil 1B ve 1 C), son derece küçük çözüm cilt15kullanımını sağlar. Ayrıca, cross-linking tepki tetiklemek için beyaz ışık kullanımı sonuçlar floresan proteinlerin sınırlı bir beyazlatma ve bileşik hydrogels formülasyonu floresan işaretleri (Şekil 1) ile sağlar. SpyTag-SpyCatcher kovalent etkileşim16, Amin cross-linking via oxazolidin13veya biotin streptavidin etkileşimi17temel cross-linking diğer protein bazlı hidrojel oluşumu yöntemleri kullanın.
Dinamik mekanik analiz (DMA), şu anda yoğun polimer esaslı hydrogels13,18çalışma için kullanılan bir tekniktir. DMA Biyomalzeme için sürekli güç iletişim kuralları uygulayabilirsiniz olmakla birlikte, üzerinde 10 kPa ve 200'den fazla µL19hacimleri büyük örnek Young'un dönmeler gerektirir. Bu sınırlamalar nedeniyle, protein hydrogels genellikle bu tekniği ile araştırılması çok yumuşak. Mühendislik polyproteins üretmek için canlı bir sistem gerektiren bu yana polimerler sentez zordur bu tür yüksek birimleri en iyi4,15' verimsiz şunlardır. Ayrıca, çoğu biyolojik doku 10 kPa yumuşak. Birkaç yaklaşım kas elastikiyeti20,21çalışmada özellikle biyolojik örnekler için geliştirilmiştir. Bu teknikler de sürekli kuvvet uygulamak için geribildirim altında çalışabilir ama örnekleri çok kısa zamanlar için zorlamaya maruz küçük çapı (mikron aralığındaki) için optimize edilmiş (genellikle daha az 1 s).
Protein bazlı hydrogels tarihinde rheometry teknikleri ile başarılı bir şekilde incelenmiştir. Örneğin, bir halka şeklinde hidrojel döküm deneyimli kuvvet değişikliği uzantısı4,22bir fonksiyonu olarak ölçmek için extensional rheometry kullanımına izin verir. Protein bazlı hydrogels rheological özelliklerini çalışmak için diğer yaklaşımlar kontrollü kesme-stres rheometry kullanın. Bu teknikler de düşük numune hacmi elde etmek ve yumuşak malzeme tahammül. Ancak, bu yöntemleri eksikliği çekerek taklit yeteneği o neden protein unfolding içinde vivozorlar ve Young katsayısı çeşitli varsayımlar ve düzeltmeler23gerektiren karmaşık teorileri dayanarak hesaplanır.
Son zamanlarda küçük hacimli tüp çapı içindeki polimerli proteinlerin kullanan yeni bir yaklaşım bildirdin < 1 mm. Bu teknik ilk bizim uygulanması nerede jel istenen protokol15genişletildi uzunluğu-kelepçe modunda çalışan. Etki alanlarını açılmak iken, bu yöntemde, veri yorumu hantal yapma sürekli bir değişim uzantısı ve kuvvet proteinler deneyim. Son zamanlarda, yeni bir kuvvet-kelepçe rheometry tekniği, nerede bir geri besleme döngüsü düşük hacimli protein hydrogels bir önceden tanımlanmış kuvvet Protokolü7 (Şekil 2) açığa çıkarabilir bildirdin. Analog bir PID sistemi ile bilgisayardan gönderilen ayar noktası kuvvet algılayıcı ile ölçülmüş güç karşılaştırır ve iki giriş arasındaki fark en aza indirmek için ses bobini taşıyarak jel uzantısı ayarlar. Bu 'sıkma kuvveti' Şimdi yeni türlerine deneyler için protein hydrogels biyomekanik ölçmek için izin verir.
Kuvvet rampa modunda bir hayvan zinciri protein hidrojel sürekli artış ve zamanla kuvvet azalması deneyimleri. PID doğrusal olmayan bir şekilde, protein ve hidrojel formülasyonu türüne bağlı olarak uzatma değiştirerek için herhangi bir visko elastik deformasyon oluşan koyu çizgileri giderir. Kuvvet rampa en büyük avantajı Young katsayısı ve bir unfolding ve protein etki alanından refolding nedeniyle enerji dağıtımı gibi standart parametreler miktar sağlanmıştır.
Sabit-force modunda uygulanan kuvvet bir adım gibi moda değiştirir. Bu modda, jel genişletir ve kuvvet artırılması veya azaltılması, anılan sıraya göre ne zaman Melosun sözleşmeleri, zamana bağımlı deformasyon tarafından takip. Sabit bir güç, jel deneyimleri sırasında gerçekleşen bu visko elastik deformasyon etki alanı unfolding/refolding için doğrudan ilgilidir. Basitleştirilmiş bir şekilde, bu uzantı ortalama ve tek seferde ölçülen birkaç milyar tek molekül izlemeler eşdeğeri olarak görülebilir. Sabit-force protokolleri sürüngen ve protein hydrogels gevşeme kuvvet ve zamanın bir fonksiyonu olarak kullanılabilir. BSA tabanlı protein hydrogels için güç bir fonksiyonu olarak biz son zamanlarda elastik ve viskoelastik uzantısı ve geri tepme ile uygulanan gerilim7arasında doğrusal bir bağımlılık olduğunu göstermiştir.
Burada bir kuvvet-kelepçe rheometer bileşik jelleri protein L (L8olarak tasvir 8 etki24,) bir karışımı ve bir protein L-eGFP yapısı (L-eGFP), yapılan genel hidrojel yapar floresan ve basit-e doğru kullanma işlemi ayrıntılı göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. reaktifler eriyik hazırlığı
- Bir başlangıç protein çözüm faiz [20 mM tris (hydroxymethyl) aminomethane ve 150 mM NaCl, pH 7.4] Tris tampon kullanarak istenen konsantrasyonu protein eriterek/sulandrarak hazırlayın.
Not: En küçük protein konsantrasyonu hydrogels cross-linking neden için kullanılan protein bağlıdır ve genellikle > 1 mM olan. - Amonyum Persülfat (APS) (1 M) stokları ve tris(bipyridine)ruthenium(II) klorür hazırlamak ([Ru(bpy)3]2 +) APS eriterek tarafından (6.67 mM) çözümleri ve [Ru(bpy)3]2 + tozları Tris arabellek.
2. protein bazlı hidrojel sentezi
- 23 G iğne 1 mL şırınga üzerinde basılı lavabo pompası ile düzeltmek.
- 10 cm politetrafloroetilin (PTFE) tüp (0.022 içinde bir iç çapı ve 0.044 içinde bir dış çapı ile) bir jilet kullanılarak kesme. İğne ve şırınga PTFE tüp bir ucunu takın.
- Bir silane çözüme ikinci tüp sonuna yerleştirin ve şırınga pistonu geri çeker tarafından tüp doldurun. Tüp ~ 30 dakika bırakın.
- Silane çözümü kaldırmak ve basınçlı hava ile tüp kuru.
Not: tüm silane çözüm kurutulmuş ve hiçbir kalıntı tüp bırakılır emin olun. - Protein çözüm mix APS ve [Ru (bpy) 3] ile2 + Sabit hacim oranı kullanarak 1,5 mL tüp içinde [Örneğin, 15:1:1 veya 15:0.5:0.5 (v: v: v)].
- Girdap fotoaktif çözüm kadar tamamen karışık.
- (Örneğin, 14.000 x g) herhangi bir kabarcıklar çözümden kaldırmak için maksimum hızda karıştırın santrifüj kapasitesi.
- Tedavi PTFE tüp açık sonuna fotoaktif karışım içine yerleştirin ve çözüm şırınga pistonu geri çeker tarafından tüpün içine çizin.
- Yüklenen tüp ~ 10 cm uzakta o Isıtma önlemek ve orada 30 dakikaya kadar oda sıcaklığında (Şekil 1B) tutmak için 100 W civa lamba yerleştirin.
Not: bazı durumlarda, ışığa maruz kalma süresi 30 s. daha kısa jelleşme kez burada floresan tırnaklar için jeller, photobleaching sınırlamak için kullanılan olarak düşük olabilir. - İğneden tüpü çıkarması ve yakın bir tıraş bıçağı ile hidrojel biter tüp kenarlarını kesme.
- Körelmenin 24 G iğne hidrojel (Şekil 1 c) Tris çözümde Yükselt için kullanın.
Not: Körelmenin iğneler herhangi bir çentik önlemek veya hidrojel örnek zarar vermek için kullanılır. - Jelleri ekstrüzyon sırasında veya kabarcıklar nedeniyle formu ve kusurları ile jelleri atmak herhangi bir kusur için kontrol edin.
3. protein bazlı hidrojel eki ve kuvvet-kelepçe Rheometer kurulum
- Araç kontrol programını başlatın. Üzerinde ses bobini motorunu. Bir değer aralığı (Örneğin, 7.5 mm) sonuna doğru bobin konumunu belirleyin.
Not: Ses bobini pozisyon hidrojel mümkün uzantısı maksimize etmek için en fazla hareket aralığının sonuna doğru olmak tavsiye edilir. - Zkancaları yerinden-yön ve xdönemeçte hizalamadan-(ki çekerek koordinat; Şekil 2Bgörmek) yön. Mikrometre vidalar xdeğerlerini kaydedin-yön.
- 2 steril dikiş eşit uzunlukta iplikçikler halinde kesmek (2-3 cm; bkz: Şekil 3A ve B).
- Gevşek bir çift yukarıdan aşağı düğüm her ipliklerini içine kravat ve 2 döngüler (Şekil 3 c ve 3D) kuvvet sensörün bağlı kanca yerleştirin.
- Deneysel odası Tris arabellek ile doldurun ve hidrojel örnek tıbbi Cımbız kullanarak dolu odanın içine aktarın.
- Ses bobini yerleştirin ve sensör kanca çözüm yüzeye yakın zorlamak ve her yöne xkullanarak kanca hizalamak /y/z-manipülatörler konumlandırma.
- Tıbbi cımbız, protein hidrojel örnek ses için bağlı kanca üzerinde her iki bobin ve sensör (Şekil 3 c) kuvvet asmak kullanma.
- Her iki ucunda da dikiş döngü tıbbi cımbız ile tutarak ve onları aynı anda çekerek hidrojel örnek ses bobini oltaya çevresine 1 dikiş daire sıkın (şekil 3D).
- Döngü için yineleme adım 3.8 kuvvet sensör (şekil 3D) bağlı.
Not: herhangi bir yapısal hasar ve hidrojel örnek enine kesme önlemek için dikiş aşırı bir sıkma kaçının. - Herhangi bir kaymayı önlemek için her kanca vurgun üzerinde dikiş döngüler sıkın; Bu vurgun referans olarak puan arasındaki adım 3.2 kanca sıfır mesafeyi bulmak için kullanın. Tıbbi makas (şekil 3D) kullanarak dikiş aşırı uzunlukları kesti.
- Zkullanarak ekli hidrojel hareket-manipülatörler boyunca z-ekseni deneysel çözümde hidrojel sokmak için deneysel odası doğru.
- Y-z jel herhangi bir stres altında değil öyle ki manipülatörler kullanarak hidrojel örnekte hizalayın.
- Kuvvet sensörü sıfır ve xkullanarak iki kanca ayrı-mikrometre aşamalarında jel kuvveti yaşamaya başlayana kadar. Bu gerçekleşirse, biraz geri mikrometre xçevirin-yön.
- Her iki manipülatörler ses bobini motor ve sensör için konumunu kaydetmek ve hayvan zinciri kanca denemenin başlangıcında arasında kesin ayrım hesaplamak için bu değerleri 3.2 adımda ölçülen olan arasındaki farkı kullanın.
- ~1.5 - 2 mm aralığı bolluk Curve ayarlayın ve jel bolluk (Şekil 4A) ölçmek.
Not: bolluk her ölçüm için 2 rejimler (Şekil 4A) uyacak en uygun sayıda veri noktası için izin ilk ses bobini konumu, bolluk rejimi başlangıcı bulundurmaya çalışın. Jel uzunluğu kancalar ve bolluk içinde 2 rejimleri arasında kavşak arasındaki mesafeyi kullanarak mikron çözünürlüklü belirlenebilir (Ayrıca bkz: adım 5.1) eğri. Kuvvet sensör zamanla deneysel koşullar farklılığı nedeniyle kayması gibi bu mümkün drift raporlarda zorla jel altında olmadığı bolluk eğri parçası. Araç kontrol programı bu fark için ayar noktası komut PID döngü (Şekil 4A iç metin) gönderirken otomatik olarak dengeler.
4. protein bazlı hidrojel kontrollü kuvvet-rampa ve sabit-Force ölçüleri kullanarak karakterizasyonu
-
Kuvvet rampa deneyler
- İstenen yükleme hızı (Örneğin, 0.01 mN/s), kuvvet artırarak bir kuvvet rampa döngü gerçekleştirmek için başlangıç ve son kuvvetler ve protokolün süresi çevrilen "V" girdi. Sonra jel 0 mN (ya da düşük güç) > 200 s protein etki alanları indirgenmesi ve kurtarmak için jel esneklik için izin vermek için basılı tutun.
- Izleme kaydedin.
-
Sabit-force deneyler
- Bir sabit-force protokol tanımlı bir süre sabit bir güç (Örneğin, 1 mN) 30 s ve sonra artış gücü için (Örneğin, 0.1 mN) düşük bir güç uygulayarak gerçekleştirmek (Örneğin, 120 s), ardından gücünün aynı düşük Şoklama değeri (Örneğin, 0.1 mN) > 300 s protein etki alanları indirgenmesi ve kurtarmak için jel esneklik sağlar.
- İlk darbe takip geribildirim yanıt süresini en üst düzeye çıkarmak için PID ayarlarını ayarlayın (bkz. Şekil 2B) döngü.
Not: Sert jelleri ve yürürlükteki küçük değişiklikler, tepki süresi döngü kuvvet sensör elektronik ve bobin tepki süresi sınırlıdır ve 5 ms7olarak düşük olabilir. Daha yumuşak jeller ve yürürlükteki büyük değişiklikler için tepki süresi hydrogels (Şekil 2B) esneklik tarafından dikte edilir. - Izleme kaydedin.
5. veri analizi
- Jel kuvveti (Δx 4A rakam eklemek içinde) deneyim, jel uzunluğu L denklemi kullanarak hesaplamak başladığında kanca ile hesaplanan bobin pozisyon arasındaki ölçülen mesafeyi kullanan:
L = L0 + ∆x
L0 mikrometre vida deney (adım 3.14) önce konumu ölçülen kanca arasındaki mesafeyi işte.
Not: bir tam cross-linking neden düşük protein konsantrasyonları ile jelleri için izleme izleme ölçülen uzunluğu değişir. Ayrıca, uzun süreler, hangi jöleyi genel bir uzatma neden yaşlanma etkileri25, proteinler hydrogels içinde yaşayabilirsiniz. - Zorlanma elde etmek için jel uzunluğu için ölçülen uzantısı normalleştirmek.
- Enine yüzey alanı ölçülen gücüne polimerizasyon için kullanılan boru iç çapı kullanarak normalleştirmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1A düzeni L-EGP/L8 hidrojel sentezlemek için kullanılan fotoaktif tepki gösterir. Şekil 1B hidrojel karışımı PTFE tüpe önce ve photoactivation sonra gösterir. Şekil 1 c haddelenmiş L-eGFP-L8 hidrojel Tris çözüm içinde sunar. Hidrojel örnek hiçbir yapısal kusurları gibi çentikler var. Hydrogels açıkça görünür bir hasar ile atılmalıdır.
Birleştirilmiş işlenmesi ve kuvvet-kelepçe rheometer görünümlerini patladı Şekil 2A ve 2B'yisunulmaktadır. Şekil 2C nerede hidrojel örnek bağlı doğrusal ses bobini ve kuvvet sensör ve arabellek çözeltilerine dalmış kanca arasında gergin kuvvet-kelepçe rheometer düzeni gösterir. Analog PID sistemi kuvvet ayar noktası izleyin için doğrusal ses bobini pozisyon kontrol ederek hidrojel uzantısı ayarlar. Şekil 2B sürecin ayarlama ayrılmaz kazanç için çeşitli aralıklarla kullanarak gösterir.
Şekil 3 tipik ek işlem hidrojel örneği gösterir. Hizalanmış kanca arasında hidrojel hayvan zinciri sonra dikiş döngüler hidrojel vurgun hidrojel uzunluğu kesin belirlenmesi için izin veren ve örnek kaymasını önlemek için yakın çevresinde sıkılır.
Kuvvet rampa ölçüm ve çözümleme-in Protein Bazlı Hydrogels:
Kuvvet rampa Protokolü'nün temsilcisi ölçüleri Şekil 4A - 4 Cgösterilir. Her yeni çekme Şekil 4Agörüldüğü gibi bir bolluk ölçüm ile başlar. Sonra güç eğrisi yükü artırır ve doğrusal olarak zamanla azalır gibi bir ters "V" Protokolü uygulayarak elde edilir. Daha sonra hidrojel 0 mN kuvvet 200 için düzenlenen s protein etki alanları içinde (Şekil 4B) refold için hidrojel örnek izin vermek için. Stres sırasında önceden tanımlanmış kuvvet ayar noktası takip etmek bobin konuma göre temsil hidrojel uzantısı PID sistem değiştirir. Bolluk her eğrinin için 2 satır (Şekil 4 c) uygun. Mavi hatta ilk rejimi sığdırmak için kullanılır ne zaman hidrojel recoils ve turuncu çizgi hidrojel bolluğu olduğunda rejim sığdırmak için kullanılır. İki çizgi arasındaki kavşak mikrometre çözünürlüğe (Şekil 4A) doğru jel uzunluğunu hesaplamak için kullanılır. Daha sonra hidrojel örnek uzantısı bobin pozisyon izleme (Şekil 4 d) ilk bobin pozisyondan çıkarılarak hesaplanır. Şekil 4F stres gerginlik eğrisi sunar. Stres kesiti hidrojel örnek uygulamalı zorla bölünerek hesaplanır ve zorlanma (4E rakam) uzantısı bölünerek Şekil 4A sunulan bolluk eğrisi hesaplanan gerçek jel uzunluğu tarafından hesaplanır .
Sabit güç ölçüm ve çözümleme-in Protein Bazlı Hydrogels:
Bir sabit-force protokol temsilcisi ölçümleri are göstermek içinde Şekil 5A - 5 D. 0.1 mN sabit bir güç 30 hidrojel örnek uygulanır s, kuvvet sonra 120 için 1 mN değiştiğinde s ve son olarak, kuvvet için 300 mN 0.1 başa söndürülür s (Şekil 5A) refold protein etki alanları sağlar. Sırasında ilk 30 s düşük güç jel uzantısındaki önemli hiçbir değişiklik yok. 1 mN gücünün artırılması hidrojel hızlı elastik bir uzantısı gösterir. Bu ilk uzantısı hidrojel (1 mN) kuvvet sabit tutarken, zaman içinde uzanan tutar. Daha sonra kuvvet geri ilk düşük değeri için (0.1 mN) su ve hidrojel ilk uzunluğu (Şekil 5B) kurtarır. Hidrojel örnek (Şekil 5C) ve güç uzatma zorlanma (üst) ve stres (alt) benzer bir şekilde olduğu gibi kuvvet rampa ölçümleri (Şekil 5 d) hesaplamak için kullanılır.
Resim 1: L-eGFP/(L)8-hidrojel sentez dayalı. (A) Bu panel gösterir bir photoactivated tepki kullanarak bir L-eGFP/(L)8 protein sentezi hidrojel şemaları. Protein APS ile karıştırılır ve [Ru(bpy)3]2 + ve beyaz ışık maruz, hangi bitişik Tirozin amino asitler (gömme) arasında Kovalent bağlar oluşumunu destekler. (B) Bu panel gösterir bir L-eGFP/(L)8-, [Ru(bpy)3]2 +- ve APS-karışım dolu pozlama için beyaz ışık (üst) ve sonra (alt) önce 23 G iğne kullanarak bir PTFE tüp içine. (C) Bu panel haddelenmiş L-eGFP/(L)8gösterir-hidrojel Tris çözümde dayalı. İlave bir L-eGFP/(L)8büyütülmüş bir görüntüsünü gösterir-hidrojel dayalı. (558 mikron) polimerizasyon sırasında kullanılan PFTE boru iç çapı ile anlaşma 552 ± 8 mikron çapında dağılımıdır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: Force-kelepçe rheometer tasarım ve set-up. (A)monte kuvvet-kelepçe hidrojel rheometer işlenmesi. Kangal ve sensör kanca çözüm odası içinde zorla bir protein bazlı hidrojel örnek ses için bağlı iç metin gösterir. Kuvvet-kelepçe hidrojel rheometer şemayı göster (B) Render: (a - c) ses bobini ayarlamak için x-y-z manipülatörler kanca konum, (d) Doğrusal ses bobini motorlu, (e) güç dönüştürücü, (f) kuvvet dönüştürücü sahibi, (g) çözüm odası, ve (h - ben) x-y manipülatörler güç dönüştürücü konumunu ayarlamak için. (C) kuvvet-kelepçe hidrojel rheometer kurulum şeması. Düzeni kuvvet algılayıcıyı bağlı bir protein bazlı hidrojel örnek gösterir ve tıbbi dikiş kullanarak ses bobini kanca. Analog PID sistemi kuvvet ayar noktası izleyin için ses bobini konumunu ayarlayarak hidrojel uzunluğu değiştirir. (D) PID sistem yanıtı kuvvet ulaşmak için farklı integral-kazanç değerleri (ben) kullanarak noktası (kesik çizgi) ayarlayın. Renkli izlemeler ölçülen kuvvet (alt) temsil ve zorlanma (üst) elde edilen PID sistem yanıtı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: L-eGFP/(L)8-bağlı hidrojel eki işlemi. (A)yakın çekim görüntülemek için kanca hidrojel örnek bağlamak için kullanılan gevşek çift yukarıdan aşağı düğüm ile bağlı bir dikiş döngü. (B) iki dikiş döngüler protein bazlı hidrojel ek olarak kullanılan kuvvet sensör kanca yerleştirilir. (C) bir L-eGFP/(L)8-tabanlı hidrojel örnek arasında (oklarla gösterilen) kanca asılı. (D) dikiş (solda) ses bobini tarafında döngüler ve kuvvet sensör kanca (sağda) hidrojel örneği örnek ölçümler sırasında kaymasını önlemek için her kanca bend'etrafında sıkılır. Daha sonra tıbbi makas (kırmızı oklarla gösterilen) kullanarak aşırı dikiş atılır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: Temsilcisi kuvvet-rampa ölçüm ve veri analizi eğriler için bir L-eGFP/(L)8-hidrojel örneğe bağlı. (A)tipik bolluk ölçüm eğrisi (kırmızı) sıfır güç kuvvet sensörün ve hidrojel gerçek uzunluğunu belirlemek için kullanılır. İki doğrusal eğrileri (mavi ve turuncu çizgiler) her iki rejimler sığdırmak için kullanılır: jel (mavi çizgi), kuvvet altında olduğunda ilk ve ikinci, jel bolluk (Plato - turuncu çizgi) olduğu. İki çizgi arasındaki kavşak sıfır güç, gerçek hidrojel uzunluğunu hesaplamak için kullanılır. Oku hareket yönünü gösterir. İlave sıfır güç konumunu ve hidrojel uzunluğu düzeltme gösterir. (B) temsilcisi kuvvet-rampa eğrisi hidrojel örneğine uygulanan. (C) izleme zamanın bir fonksiyonu olarak bobin pozisyon hareketi temsil eden. Bobin adımda 3.1 (7,5 mm) protokolünde tanımlanan ilk konumdan başlar. (D) temsilcisi eğrisi hidrojel örnek zamanın bir fonksiyonu olarak uzantısı. Uzantının başlangıç konumunu arasındaki ölçülen bobin pozisyon deplasman olarak hesaplanır. (E) temsilcisi zorlanma -karşı-zaman eğrisi. Zorlanma bolluk ölçüm hesaplanan gerçek jel uzunluğu uzantısı bölünerek hesaplanır. (F) temsilcisi stres gerginlik eğrisi hidrojel örneği. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: Sabit Kuvvet ölçüm ve veri analiz. (A)bir hidrojel için uygulanan sabit-force protokol temsilcisi iz. Hidrojel 30 0.1 mN maruz s sonra kuvvet 120 için 1 mN artırılır s ve son olarak, kuvvet söndürülür 0.1 mN için h uzunluğu değişikliği temsil eden zaman izleme karşı bir bobin 300 s. (B) Bu panel gösterir konumlandırmak için force protokol sonrası ydrogel örnek. (C) Bu panel ses bobini uzaklığı ölçülen jel uzantısı gösterir. Stres (alt) ve veri analizi sonra gerginlik izlerini (üst) (D) temsilcisi figürü. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, düşük hacimli protein bazlı hydrogels biyomekanik yanıt araştırmak için bir kuvvet-kelepçe rheometry tekniğini tanımlamak. Ayrıca, bir protokol Tekdüzen silindirik düşük hacimli protein hidrojel örnek sentezlemek için sağlanmıştır. Bir iletişim kuralı da nasıl kanca herhangi bir mekanik deformasyon veya protein bazlı hidrojel örnekleri veya kayma jel zarar vermeden farklı protein bazlı hydrogels çeşitli elasticities ile bağlamayı açıklayan sunulur. Doğrusal ses bobini ve kuvvet sensör ile birlikte analog PID sistemi kuvvet rampa ve sürekli kuvvet gibi kontrollü güç iletişim kurallarını uygulama etkinleştirin. Son zamanlarda, bu teknik BSA tabanlı hydrogels farklı deneysel çözümleri7farklı çapraz bağlı konsantrasyonları biyomekanik yanıt eğitim için kullanılmıştır.
Formüle ve protein hydrogels ile çalışma önemli bir tekrarlanabilirlik ölçümlerin yönüdür. Jelleri bir çok düşük protein konsantrasyonu veya eksik cross-linking ile formüle edilmiş, kalıcı plastik deformasyona uzantısı7sırasında görünür. Viskoelastik etkileri etki alanı unfolding ve moleküler düzenlenmesi jel içinde çıktı gibi bu plastik deformasyona veri yorumlanması, büyük ölçüde sınırlar. Eğer görmek için kolay bir test var tamamlamak cross-linking olduğunu 6 M guanidinium klorür1gibi kimyasal denatüranlar hidrojel sokmak için. Bu durumda, olmamalıdır herhangi bir viskoelastik etkileri stres -karşıiçinde-zorlanma eğrileri, tüm etki alanları kimyasal olarak gelişeceğini ve molekülleri şimdi basit polimerler4,7,26davranıyor. Ayrıca, jel geri ilk arabellek7içinde dalmış zaman onun ilk elastikiyet kurtarmanız gerekir.
Varyasyonlar ile farklı jeller elde izleri arasında ölçülen yanıt varsa, çeşitli yönleri sorun giderme için düşünülmelidir: çözüm cross-linking ile karıştırma, homojen olmayan bir protein, protein toplamada kimyasallar, kabarcıklar, protein bazlı hidrojel yanlış silanization nedeniyle PFTE Tüp bağlama varlığı. Silane tüp duvarlarda artıkları hidrojel kontamine ve yapısal kusurlar için yol. Bu hatanın oluşmaması için daha fazla basınçlı hava tüp silane toplam kaldırılmasını sağlamak için gereklidir. Ayrıca, kabarcıklar hidrojel fotoaktif karışımı PTFE tüp içine emme sırasında oluşabilir. Bu baloncuklar hasar örnek ve hidrojel biyomekanik yanıt tesir açabilir. Herhangi bir kabarcık oluşumunu önlemek için PTFE tüp sonu yükleme işlemi sırasında çözüm mix içinde olması gerekir ve yavaş yavaş şırınga pistonu geri çekildi. Başka bir tipik bir dikiş döngüler hidrojel örnekleri etrafında bir çentik oluşumu ve hidrojel kesme yol açabilecek ek işlemi sırasında aşırı sıkma hatadır. Ses bobini hareket aralığını ekli hidrojel örnek maksimum uzantısı sınırlar. Bu sınırlama dikkate alınmak ne zaman birkaç yüz genişletmek jelleri ölçme zorunda ilk uzunlukları yüzdesi. Örneğin, bir hidrojel için % 200'den fazla genişletmek için bir başlangıç uzunluğu daha az 4 mm gereklidir.
Protein bazlı hydrogels biyouyumluluk ve proteinler, onların ana bina üniteleri ve proteinler için karakteristik olan doğal katlama geçiş türetilmiş yüksek esnekliği nedeniyle Biyomalzeme benzersiz bir sınıfıdır. Ayrıca, bu hydrogels doku mühendisliği, ilaç dağıtım sistemleri ve biyolojik mürekkep (bioink) 3D yazdırma27için mükemmel bir potansiyele sahip. Kuvvet-kelepçe hidrojel rheometer proteinler, büyük bir çeşitlilik araştırmak için kullanılabilir. Ayrıca, kuvvet-kelepçe rheometer sabit-force protokol düşük hacimli hidrojel örnekleri üzerinde uygulama sağlar. Bu deneyler elastik ve viskoelastik davranışları ayırımı izin ve (BM) katlanır mekanik bir toplu yaklaşım konusunda çalışma.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Araştırma büyüme girişimi (Ödülü No 101 X 340), Ulusal Bilim Vakfı, büyük araştırma araçları programı (Grant No mali desteği anıyoruz PHY-1626450), büyük Milwaukee Vakfı (Shaw Ödülü) ve University of Wisconsin sistemi (uygulamalı araştırma hibe).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SI-KG4A force transducer | World Precision Instruments (WPI) | SI-KG4A | |
| Linear Voice Coil Motor | Equipement Solutions | LFA2010 | |
| Bovine serum albumin | Rocky Mountain Biologicals (RMBIO) | BSA-AAF-1XG / 100 G | |
| Trizma | Sigma-Aldrich | T1503-1KG | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653-1KG | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | 248614-100G | |
| Tris(bipyridine)ruthenium(II) chloride | Sigma-Aldrich | 544981-1G | |
| EXPRESS MEDICAL SUPPLIES 6-0 NYLON SUTURE 12/PK | Fisher Scientific | NC0395626 | |
| 1mL Syringe Only, Luer-Lok Tip | BD | 309628 | |
| Silane, Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-25ML | |
| Microbore PTFE Tubing, 0.022"ID x 0.042"OD, 100 ft/roll | Cole-Parmer | EW-06417-21 | |
| Hypodermic Needle, 23 Gauge | Healthcare Supply Pros | 305194 | |
| Jensen Global JG24-1.5X Red IT Dispensing Tips - 24 gauge | KIMCO | JG24-1.5X | |
| USH-103D USHIO 100W Short Arc Mercury Lamp | ALB | USH-103D USHIO | |
| Medical Tweezers | |||
| Medical scissors | |||
| Olympus | |||
| The computer code and CAD design of the custom parts can be made available on request to the corresponding author. |
References
- Cao, Y., Li, H. How do chemical denaturants affect the mechanical folding and unfolding of proteins? Journal of Molecular Biology. 375 (1), 316-324 (2008).
- Carrion-Vazquez, M., et al. Mechanical and chemical unfolding of a single protein: a comparison. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (7), 3694-3699 (1999).
- Wiita, A. P., et al. Probing the chemistry of thioredoxin catalysis with force. Nature. 450 (7166), 124-127 (2007).
- Lv, S., et al. Designed biomaterials to mimic the mechanical properties of muscles. Nature. 465 (7294), 69-73 (2010).
- Plumere, N., et al. A redox hydrogel protects hydrogenase from high-potential deactivation and oxygen damage. Nature Chemistry. 6 (9), 822-827 (2014).
- Kong, N., Peng, Q., Li, H. B. Rationally Designed Dynamic Protein Hydrogels with Reversibly Tunable Mechanical Properties. Advanced Functional Materials. 24 (46), 7310-7317 (2014).
- Khoury, L. R., Nowitzke, J., Shmilovich, K., Popa, I. Study of Biomechanical Properties of Protein-Based Hydrogels Using Force-Clamp Rheometry. Macromolecules. 51 (4), 1441-1452 (2018).
- Auton, M., Rosgen, J., Sinev, M., Holthauzen, L. M. F., Bolen, D. W. Osmolyte effects on protein stability and solubility: A balancing act between backbone and side-chains. Biophysical Chemistry. 159 (1), 90-99 (2011).
- Popa, I., Kosuri, P., Alegre-Cebollada, J., Garcia-Manyes, S., Fernandez, J. M. Force dependency of biochemical reactions measured by single-molecule force-clamp spectroscopy. Nature Protocols. 8 (7), 1261-1276 (2013).
- Aioanei, D., Brucale, M., Tessari, I., Bubacco, L., Samori, B. Worm-Like Ising Model for Protein Mechanical Unfolding under the Effect of Osmolytes. Biophysical Journal. 102 (2), 342-350 (2012).
- Wheeldon, I. R., Gallaway, J. W., Barton, S. C., Banta, S. Bioelectrocatalytic hydrogels from electron-conducting metallopolypeptides coassembled with bifunctional enzymatic building blocks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (40), 15275-15280 (2008).
- Sathaye, S., et al. Rheology of peptide- and protein-based physical hydrogels: are everyday measurements just scratching the surface? Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 7 (1), 34-68 (2015).
- Ma, X., et al. A Biocompatible and Biodegradable Protein Hydrogel with Green and Red Autofluorescence: Preparation, Characterization and In Vivo Biodegradation Tracking and Modeling. Scientific Reports. 6, 19370 (2016).
- Fancy, D. A., Kodadek, T. Chemistry for the analysis of protein-protein interactions: rapid and efficient cross-linking triggered by long wavelength light. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (11), 6020-6024 (1999).
- Saqlain, F., Popa, I., Fernandez, J. M., Alegre-Cebollada, J. A Novel Strategy for Utilizing Voice Coil Servoactuators in Tensile Tests of Low Volume Protein Hydrogels. Macromolecular Materials and Engineering. 300 (3), 369-376 (2015).
- Sun, F., Zhang, W. B., Mahdavi, A., Arnold, F. H., Tirrell, D. A. Synthesis of bioactive protein hydrogels by genetically encoded SpyTag-SpyCatcher chemistry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (31), 11269-11274 (2014).
- Thompson, M. S., et al. Self-assembling hydrogels crosslinked solely by receptor-ligand interactions: tunability, rationalization of physical properties, and 3D cell culture. Chemistry. 21 (8), 3178-3182 (2015).
- Kocen, R., Gasik, M., Gantar, A., Novak, S. Viscoelastic behaviour of hydrogel-based composites for tissue engineering under mechanical load. Biomedical Materials. 12 (2), (2017).
- Desai, M. S., et al.
- Fusi, L., Brunello, E., Yan, Z., Irving, M. Thick filament mechano-sensing is a calcium-independent regulatory mechanism in skeletal muscle. Nature Communications. 7, (2016).
- McDonald, K. S. Ca2+ dependence of loaded shortening in rat skinned cardiac myocytes and skeletal muscle fibres. Journal of Physiology-London. 525 (1), 169-181 (2000).
- Wu, J. H., et al. Rationally designed synthetic protein hydrogels with predictable mechanical properties. Nature Communications. 9, (2018).
- Bharadwaj, N. A., Ewoldt, R. H. Single-point parallel disk correction for asymptotically nonlinear oscillatory shear. Rheologica Acta. 54 (3), 223-233 (2015).
- Valle-Orero, J., Rivas-Pardo, J. A., Popa, I. Multidomain proteins under force. Nanotechnology. 28 (17), 174003 (2017).
- Valle-Orero, J., et al. Mechanical Deformation Accelerates Protein Ageing. Angewandte Chemie International Edition. 56 (33), 9741-9746 (2017).
- Fang, J., et al. Forced protein unfolding leads to highly elastic and tough protein hydrogels. Nature Communications. 4, (2013).
- Gungor-Ozkerim, P. S., Inci, I., Zhang, Y. S., Khademhosseini, A., Dokmeci, M. R. Bioinks for 3D bioprinting: an overview. Biomaterial Science. , (2018).
