יישומים של מיפוי-עתיים, טכניקות ניתוח חלקיקים לכמת Ca תאיים2 + איתות בחיי עיר

Summary

Ca מקודדים גנטית^{2 +} מחוונים (GECIs) השתנו באופן קיצוני איך באתרו Ca^{2 +} הדמיה מבוצעת. כדי למקסם את שחזור נתונים מהקלטות אלו, נדרש ניתוח הולם של Ca^{2 +} אותות. הפרוטוקולים נייר זה להקל על כימות של Ca^{2 +} מאותת הקליט באתרו באמצעות מיפוי ייתכן וניתוח מבוסס חלקיק.

Abstract

Ca^{2 +} הדמיה של תאים בודדים או סוגים ספציפיים של תאים בתוך הרקמות שלמים לעיתים קרובות חושף דפוסים מורכבים של Ca^{2 +} איתות. פעילות זו מחייבת ניתוח זהיר ומעמיק כימות ללכוד כמה שיותר מידע על האירועים כבסיס ככל האפשר. Spatial, זמני ופרמטרים בעוצמה מהותי Ca^{2 +} אותות כגון תדירות, משך, הפצת, מהירות, משרעת עשוי לספק מידע ביולוגי הדרושים עבור איתות תאיים. ברזולוציה גבוהה Ca^{2 +} הדמיה בדרך כלל תוצאות ברכש של קובצי נתונים גדולים שנמצאים זמן רב כדי תהליך מבחינת לתרגם את המידע ההדמיה לתוך מידע כמיתים, תהליך זה יכול להיות רגישים הטיה של טעות אנוש. ניתוח של Ca^{2 +} אותות התאים באתרו בדרך כלל מסתמך על מדידות בעוצמה פשוטה אזורים שנבחרו באופן שרירותי של הריבית (ROI) בתוך שדה ראייה (FOV). גישה זו מתעלמת הרבה של המידע איתות חשוב FOV. לכן, על מנת למקסם את השחזור של מידע מתוך הקלטות כאלו ברזולוציה גבוהה שהושג עם Ca^{2 +}צבע או optogenetic Ca^{2 +} ניתוח יכולות הדמיה, המתאים של Ca^{2 +} האותות נדרש. הפרוטוקולים המתוארים במאמר זה יתאר כיצד ניתן להשיג כמות גדולה של נתונים Ca הקלטות^{2 +} הדמיה כדי להקל על ניתוח מפורט יותר, כימות של Ca^{2 +} אותות הקליט מתאי באמצעות שילוב של ייתכן מפה (STM)-המבוסס על ניתוח וניתוח מבוסס חלקיק. הפרוטוקולים מתארים גם כמה שונה על ידי דפוסי Ca^{2 +} איתות שנצפה בתא אחר אוכלוסיות באתרו ניתן לנתח אותם כראוי. להמחשה, השיטה יבחנו Ca^{2 +} איתות אוכלוסיה מיוחדות של תאים במעי הדק, תאים ביניים של קחאל (ICC), באמצעות GECIs.

Introduction

Ca^{2 +} הוא שליח תאיים בכל מקום אשר שולטת מגוון רחב של תהליכים תאיים, כגון שריר התכווצות^1,2, חילוף החומרים³, תא התפשטות^{3,4, 5}, גירוי של שחרור נוירוטרנסמיטר עצב מסופי^6,7, והפעלה של שעתוק גורמים בגרעין. ⁷ Ca תאיים^{2 +} מאותת לעיתים קרובות ללבוש הצורה של הגבהים חולף ב Ca cytosolic^{2 +}, אלה יכולים להיות ספונטני או נובעים אגוניסט גירוי בהתאם סוג התא⁸. Spatial, זמני ופרמטרים בעוצמה מהותי Ca^{2 +} אותות כגון תדירות, משך, הפצת, מהירות, משרעת לספק את המידע הביולוגי הדרושות האיתות תאיים^{5, 7 , 9}. cytoplasmic Ca^{2 +} אותות יכול לנבוע זרם של Ca^{2 +} מן המרחב חוץ-תאית או באמצעות Ca^{2 +} שחרור תוך-פלזמית (ER) באמצעות Ca^{2 +} ערוצי הפצה כגון קולטנים ryanodine (RyRs) ו קולטנים אינוזיטול-tri-פוספט (IP₃ר’)¹⁰. RyRs ו- IP₃ר’ עשוי גם לתרום הדור של Ca^{2 +} אותות, הפתח מתואמת של הערוצים הללו, אשר בשילוב עם Ca^{2 +} זרם מנגנונים שונים יכולים לגרום מספר עצום של Ca^{2 +} איתות דפוסים אשר עוצבו על ידי המספרים ולפתוח את ההסתברות של Ca^{2 +} ערוצי זרימה, לפרופיל ביטוי של Ca^{2 +} ערוצי הפצה, הקרבה בין Ca^{2 +} זרם, ערוצי פרסום, ואת הביטוי והפצה של Ca^{2 +} חלבונים ספיגה חוזרת של הבלטה. Ca^{2 +} אותות עשוי ללבוש הצורה של מדים, ארוך טווח, תנודות הכללית בעוצמה גבוהה זה עשוי להימשך מספר שניות או דקות אפילו, הפצת תאיים המערכת Ca^{2 +} גלים זה יכול לחצות מרחקים תאיים מעל 100 מיקרומטר^{10,11,12,13,14,15,16}או יותר קצרה, במרחב מקומי אירועים כגון Ca^{2 +} ניצוצות ו- Ca^{2 +} פחזניות זה להתרחש על עשרות צירי זמן של אלפיות השנייה והתפשטה פחות מ- 5 מיקרומטר^17,18,19,20.

מיקרוסקופ פלואורסצנטי כבר בשימוש נרחב כדי לפקח Ca^{2 +} איתות בתאים בתרבית מבודדים, ברקמות ללא פגע. באופן מסורתי, ניסויים אלו כרוך בשימוש פלורסנט Ca^{2 +} אינדיקטורים, רציומטרי, רציומטרי שאינו צבענים כמו Fura2, Fluo3/4 או Rhod2, בין היתר ^21,22,23. אינדיקטורים אלה נועדו להיות חדיר אל קרום התא, ואז הופכים לכוד בתוך תאים על-ידי המחשוף של קבוצת אסתר ויה esterases אנדוגני. איגוד של Ca^{2 +} כדי האינדיקטורים זיקה גבוהה כתוצאה שינויים בזריחה תאים ורקמות היה מואר על ידי המתאים אורכי הגל של האור. השימוש תא חדיר Ca^{2 +} מחוונים שיפור משמעותי ההבנה שלנו של Ca^{2 +} איתות בתאים חיים, מותר רזולוציה מרחבית, כימות של אותות אלה היתה בלתי אפשרית על-ידי assaying Ca^{2 +} אותות באמצעים אחרים, כגון אלקטרופיזיולוגיה. אולם, Ca מסורתי^{2 +} מחוונים יש מספר מגבלות, כגון photobleaching המתרחשת על פני תקופות הקלטה מורחבת²⁴. בעוד רשות אישורים חדשים^{2 +} מחוון צבענים כמו Cal520/590 יש אות משופר מאוד רעש יחסי ואת היכולת לזהות המקומית Ca^{2 +} אותות²⁵, בעיות עם photobleaching ונעלמות דאגה כמה חוקרים ^26,27,28. Photobleaching התלול גם מגבילה את ההגדלה, קצב רכישת התמונה, והגדילה רזולוציה שיכול לשמש עבור הקלטות, כפי כוח אובייקטיבי מוגברת שיעור גבוה יותר של ייבוא תמונות דורשים עוצמת האור עירור זה מגדילה את photobleaching.

מגבלות אלו של Ca מסורתי^{2 +} מחוון צבע הם החמירו בעת הקלטת Ca^{2 +} אותות באתרו, לדוגמה בעת ההקלטה תאיים Ca^{2 +} אותות רקמות ללא פגע. בשל הבעיות שלעיל, יש ויזואליזציה של Ca^{2 +} אותות בחיי עיר באמצעות תא חדיר Ca^{2 +} אינדיקטורים הוגבל ההגדלה צריכת חשמל נמוכה, מופחת של לכידת תמונה, המגביל את היכולת של חוקרים כדי להקליט ו לכמת חנותם או במרחב מוגבל subcellular Ca^{2 +} אותות. לפיכך, עבר קשה ללכוד, לנתח, להעריך את המורכבות יכולות של Ca^{2 +} אותות, אשר יכול להיות חשובים בדורו של תגובות ביולוגיות הרצוי, כפי שתואר לעיל. ניתוח של Ca^{2 +} אותות התאים באתרו בדרך כלל מסתמך על מדידות בעוצמה פשוטה אזורים שנבחרו עניין (ROI) בתוך שדה ראייה (FOV). הבחירה שרירותית המספר, הגודל והמיקום של ROIs, תלויים הגחמה של החוקרת, יכול קשות הטיה התוצאות המתקבלות. כמו גם הטיה הגלום עם ניתוח ROI, גישה זו מתעלמת הרבה החשובים איתות המידע הכלול של FOV, כמו דינמי Ca^{2 +} אירועים בתוך שבחרת שרירותית רועי נבחרו לניתוח. יתר על כן, ניתוח של ROIs נכשלת לספק מידע אודות המאפיינים המרחביים של Ca^{2 +} האותות שנצפו. לדוגמה, זה לא ייתכן שניתן להבחין בין עלייה Ca^{2 +} הנובע הפצת Ca^{2 +} גל ואני מאוד מקומי Ca^{2 +} לשחרר את האירוע tabulations של Ca^{2 +} אותות בתוך רועי.

כניסתו של Ca מקודדים גנטית^{2 +} (GECIs) אינדיקטורים השתנה באופן קיצוני איך Ca^{2 +} הדמיה יכול להיות שבוצעו ב באתרו^{29,30,31,32,33} . ישנם מספר יתרונות לשימוש GECIs על צבע. הוא אולי החשוב ביותר כי הביטוי של GECI יכול להתבצע באופן תא ספציפיים, אשר מפחית את זיהום הרקע הבלתי רצויים מתאי לא עניין. יתרון נוסף של GECIs מעל Ca מסורתי^{2 +} מחוונים הוא photobleaching הזה מצטמצם (כמו זריחה, consequentially photobleaching מתרחשת רק כאשר תאים פעילים), לעומת דגימות צבע טעון, במיוחד בתיכון ההגדלה ואת שיעור גבוה של התמונה ללכוד³⁴. לפיכך, הדמיה עם GECIs, כמו הסדרה GCaMP של חיישנים optogenetic, מעניקה חוקרים את היכולת להקליט לתדרך, שעברה לוקליזציה תת הסלולר Ca^{2 +} מאותת בחיי עיר ולחקור Ca^{2 +} איתות בתאים בתוך שלהם סביבות מקורי זה לא היה אפשרי בעבר. כדי ששחזור מידע מתוך הקלטות כאלו ברזולוציה גבוהה, נדרש ניתוח יכולות המתאים של Ca^{2 +} האותות. יצוין כי בעוד GECIs יכולים להציע שלנקות כמה יתרונות, מחקרים שנעשו לאחרונה חשפו כי ניתן לבצע בהצלחה Ca^{2 +} הדמיה של אוכלוסיות גדולות של מחלקות שונות עצבית של נוירונים בו זמנית באמצעות קונבנציונלי Ca^{2 +} אינדיקטורים לא מקודדים גנטית לתוך החיות³⁵. גישה זו בשימוש אימונוהיסטוכימיה לאחר הוק לחשוף מספר מחלקות שונות של נוירונים שנשרפים בתדר גבוה ואינו מסונכרן, ונמנע את הפוטנציאל שינויים גנטיים החיה אולי הפרעת פיזיולוגיים התנהגות החוקר מבקש להבין^35,36.

הפרוטוקולים המתוארים במאמר זה להקל על ניתוח מפורט יותר ואותות כימות של Ca^{2 +} נרשם מתאי באתרו באמצעות שילוב של מפת ייתכן (STM)-המבוסס על ניתוח וניתוח מבוסס חלקיק. הפרוטוקולים מתארים גם כמה שונה על ידי דפוסי Ca^{2 +} איתות שנצפה בתא אחר אוכלוסיות באתרו ניתן לנתח אותם כראוי. להמחשה, השיטה יבחנו Ca^{2 +} איתות אוכלוסיה מיוחדות של תאים במעי הדק, תאים ביניים של קחאל (ICC). ICC נמצאים תאים מיוחדים במערכת העיכול (GI) כי התערוכה דינמי תאיים Ca^{2 +} איתות, כפי visualized באמצעות עכברים המבטאים GCaMPs^{37,38,39,40, 41,42}. Ca^{2 +} תופעות מעבר ב- ICC מקושרים הפעלה של Ca^{2 +}-מופעל Cl^– ערוצים (מקודד על-ידי Ano1) חשובים בוויסות של דעתנית של שריר חלק המעי תאים (SMCs)^{43, 44,45}. לפיכך, המחקר של Ca^{2 +} איתות ב- ICC הוא יסוד להבנת תנועתיות מעיים. המעי הדק מאתר ומציע דוגמה מצוינת לצורך ההדגמה, שכן ישנם שני סוגים של ICC מופרדים מבחינה אנטומית, ניתן לאבחן באופן עצמאי: אני) ICC ממוקמים באזור שבין שריר חלק מעגלי האורך והרוחב שכבות, המקיפים את מקלעת myenteric (ICC-שלי). תאים אלה משמשים כתאים קוצב לב ולהפיק את הפעילות החשמלית המכונה גלים איטיים^46,47,48,49; ii) ICC נמצאים גם בקרב מקלעת עשיר המסופים של מוטורי לגלוקוז (מקלעת עמוק שרירים, ובכך DMP-ICC). תאים אלה לשמש כמתווכים של התגובות עצבית מנוע המעית^37,39,40,50. ICC-מיי ICC-DMP נפרדים מורפולוגית, Ca^{2 +} איתות והתנהגותם שונה באופן קיצוני להשלים את משימותיהם ספציפיים. ICC-מיי stellate בכושר, יוצרים רשת של תאים מחוברים באמצעות פער צמתי^51,52. Ca^{2 +} מאותת במניפסט ICC-מיי כמו קצר ומקומי, במרחב Ca^{2 +} שחרור אירועים המתרחשים באתרים מרובים באופן אסינכרוני דרך הרשת ICC-מיי כמו מטמיעים בתוך FOV (עם תמונה עם יעד X 60)³⁸. אותות אסינכרוני אלה מאורגנות חנותם לשנייה אחת אשכולות זה, כאשר ייערכו יחד, בסכום נטו 1 s הסלולר עלייה Ca^{2 +}. אותות אלה מפיצות מתא לתא בתוך הרשת ICC, ולכן לארגן Ca^{2 +} איתות, שנוצר מתוך אתרי משנה הסלולר, לתוך רקמות רחב Ca^{2 +} גל. קיבוץ באשכולות הטמפורלי, סיכום של Ca^{2 +} אותות ב- ICC-שלי יש כבר שנקרא Ca^{2 +} אשכולות ארעי (CTCs)³⁸. CTCs להתרחש בקצב אחיד (למשל די דומה ולקשרים תקופות דומות בין CTCs) 30 פעמים בדקה העכבר. לעומת זאת, ICC-DMP פלך בצורת התאים, חלקם עם תהליכים משניים, להפיץ בין SMCs לבין תהליכים עצב דליות. ואינם באופן עצמאי טופס^51,רשת⁵². ICC-DMP טופס צמתי הפער עם SMCs, עם זאת, פונקציה בתוך זה syncytium גדול יותר, המכונה של syncytium SIP⁵³. Ca^{2 +} אותות להתרחש באתרים מרובים לאורך האורכים של תאים, אך אלה תופעות מעבר לא entrained או חנותם מקובצים באשכולות, כפי שנצפה ב- ICC-מיי³⁷. Ca^{2 +} אותות ב- ICC-DMP להתרחש בצורה סטוכסטי, עם עוצמות משתנה, משכים, המאפיינים המרחביים. הפרוטוקולים להלן, לפי הדוגמה של Ca^{2 +} איתות ב- ICC-מיי, ICC-DMP, לתאר את שיטות לניתוח מורכב איתות בסוגים ספציפיים של תאים באתרו. אנחנו מנוצל מערכת p Cre-לקס inducible לבטא GCaMP6f באופן בלעדי ב- ICC, לאחר גרימת ההפעלה של Cre-Recombinase (Cre) מונע על ידי יזם ספציפי ICC (קיט).

Protocol

כל בעלי החיים שבהם משתמשים הפרוטוקולים ביצעו במחקר זה היו לפי מוסדות לאומיים של בריאות המדריך על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה. כל ההליכים אושרו על-ידי שימוש חיה מוסדיים ו טיפול ועד האוניברסיטה של נבאדה, רינו. 1. דור של KitGCaMP6f עכברים קרוס Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D (עכברים GCaMP6f) ו- c-Kit/ C…

Representative Results

באמצעות ערכת-Cre-GCaMP6F עכברים (איור 1), דינמי Ca2 + איתות התנהגויות של ICC במערכת העיכול יכולים לדימות באתרו. עם מיקרוסקופיה קונפוקלית, ניתן לרכוש תמונות ברזולוציה גבוהה של אוכלוסיות ספציפיות של ICC בלי לזהם אותות אחרים אוכלוסיות של ICC בתוך רקמת אותו אבל במיש…

Discussion

Ca^{2 +} הדמיה של סוגי תאים בתוך הרקמות שלמים או רשתות של תאים ספציפיים לעיתים קרובות חושף דפוסים מורכבים של Ca^{2 +} תופעות מעבר. פעילות זו מחייבת ניתוח זהיר ומעמיק כימות ללכוד כמה שיותר מידע אודות אירועים הבסיסית וקינטיקה של אירועים אלה ככל האפשר. ה-STM וניתוח PTCL לספק הזדמנות כדי למקסם א?…

Materials

Image J software	NIH	1.5a	Image J software
Volumetry	GWH	Volumetry 8Gd	Custom made analysis software
Isoflurane	Baxter, Deerfield, IL, USA	NDC 10019-360-60
Tamoxifen	Sigma	T5648
GCaMP6F mice	Jackson Laboratory	Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D
Kit-Cre mice	Gifted From Dr. Dieter Saur	c-Kit+/Cre-ERT2
Ethanol	Pharmco-Aaper	SDA 2B-6