Приложения пространственно временных карт и методы анализа частиц для количественного определения внутриклеточных Ca2 + сигнализации в Situ

Summary

Генетически закодированный Ca^{2 +} показателей (GECIs) радикально изменили как на месте Ca^{2 +} изображения производится. Для максимального восстановления данных от таких записей, необходим соответствующий анализ Ca^{2 +} сигналов. Протоколы в настоящем документе облегчить количественную оценку Ca^{2 +} сигналов, записанная на месте с помощью пространственно-временных сопоставления и анализа на основе частиц.

Abstract

CA^{2 +} изображений изолированных клеток или определенные типы клеток в неповрежденной ткани часто показывает сложные узоры Ca^{2 +} сигнализации. Эта деятельность требует тщательного и углубленного анализа и количественной оценки, чтобы захватить как можно больше информации об основных событиях как можно скорее. Пространственных, временных и интенсивности параметров присущих Ca^{2 +} сигналов, таких как частота, продолжительность, распространения, скорости и амплитуды может предоставить некоторые биологические информацию, необходимую для внутриклеточной сигнализации. Высоким разрешением Ca^{2 +} обычно визуализации результатов в приобретении данных большого размера файлов, которые отнимают много времени процесса с точки зрения перевода изображений информации в количественные данные, и этот процесс может быть восприимчивым к человеческой ошибки и предвзятости. Анализ Ca^{2 +} сигналов от клеток на месте обычно основывается на простой интенсивности измерения из произвольно выбранных областей интереса (ROI) в поле зрения (FOV). Этот подход игнорирует большую часть важных сигналов информацию, содержащуюся в ПЗ. Таким образом чтобы максимизировать восстановления информации из такого высокого разрешения записи, полученные с Ca^{2 +}красителей или optogenetic Ca^{2 +} требуется изображений, соответствующих пространственных и временных анализ Ca^{2 +} сигналов. Протоколы, изложенных в настоящем документе будет описывать, как можно получить большой объем данных от Ca^{2 +} изображений записи для облегчения более полный анализ и количественная оценка Ca^{2 +} сигналов, записанная из клеток, используя комбинацию пространственно-временных карта (СТМ)-на основе анализа и анализа на основе частиц. Протоколы также описывают как различные модели Ca^{2 +} сигнализации наблюдаемых в различных клеток, которые население на местах могут быть проанализированы надлежащим образом. Для иллюстрации, метод будет проверять Ca^{2 +} сигнализации в специализированных популяции клеток в тонком кишечнике, интерстициальных клеток Кахаля (МУС), с помощью GECIs.

Introduction

CA^{2 +} является вездесущий внутриклеточным messenger, который контролирует широкий спектр клеточных процессов, таких как мышцы сжатия^1,2, метаболизм³, клетки распространения^{3,4, 5}, стимулирование нейромедиатора релиз на нерв терминалы^6,7и активация транскрипции факторы в ядре. ⁷ внутриклеточных Ca^{2 +} сигналы часто принимают форму переходных фасады в цитозольной Ca^{2 +}, и они могут быть спонтанным или возникают от стимуляции агонистов в зависимости от типа ячейки⁸. Пространственных, временных и интенсивности параметров присущих Ca^{2 +} сигналов, таких как частота, продолжительность, распространения, скорости и амплитуды может предоставить биологической информации, необходимой для внутриклеточных сигнальных^{5, 7 , 9}. сигналы цитоплазматических Ca^{2 +} может быть результатом притока Ca^{2 +} из внеклеточного пространства или через Ca^{2 +} освобождение от эндоплазменный ретикулум (ER) через Ca^{2 +} релиз каналы, такие как рианодиновыми рецепторы (RyRs) и рецепторов инозит tri фосфат (IP₃Rs)¹⁰. RyRs и IP₃Rs может как способствовать поколения Ca^{2 +} сигналов и согласованные открытие этих каналов, которые в сочетании с различными Ca^{2 +} приток механизмов может привести к множество Ca^{2 +} сигнализации модели которые формируются в цифрах и открыть вероятность Ca^{2 +} приток каналов, выражение профиль Ca^{2 +} релиз каналов, близость между Ca^{2 +} приток и выпуска каналы и выражение и распространение Ca^{2 +} белков reuptake и экструзии. CA^{2 +} сигналы могут принимать форму единообразных, длительный, высокой интенсивности глобальных колебаний, которые может длиться несколько секунд или даже минут, распространяющихся межклеточной и внутриклеточной Ca^{2 +} волны, которые могут пересекать внутриклеточных расстояния более 100 мкм в^{10,11,12,13,14,,1516}или более краткий, пространственно-локализованных событий как Ca^{2 +} искры и Ca^{2 +} затяжек, которые происходят на десятки миллисекунд сроками и распространения менее 5 мкм^17,18,19,20.

Люминесцентная микроскопия широко используется для мониторинга Ca^{2 +} сигнализации в изолированных и культивируемых клеток и неповрежденной ткани. Традиционно эти эксперименты связаны с использованием флуоресцентных Ca^{2 +} показателей, ratiometric и не ratiometric красители например Fura2, Fluo3/4 или Rhod2, среди других ^21,,22–²³. Эти показатели были разработаны для быть проницаемой мембраны клетки и затем стать в ловушке клеток путем расщепления эфирную группу через эндогенные эстераз. Связывание Ca^{2 +} с высоким сродством показателями вызвали изменения в флуоресценции, когда клетки и ткани были освещены соответствующие длин волн света. Использование показателей клеток проницаемых Ca^{2 +} значительно расширить наше понимание Ca^{2 +} сигнализации в живых клетках и пространственное разрешение и количественной оценки этих сигналов, что не было возможно, опробование Ca^{2 +} сигналов через другие средства, такие как электрофизиологии. Однако традиционные Ca^{2 +} показатели имеют ряд ограничений, таких как Фотообесцвечивание, которое происходит через расширенный записи периодов²⁴. В то время как новые Ca^{2 +} индикатор красителей, таких, как Cal520/590 значительно улучшить сигнал шум соотношения и способность обнаруживать местных Ca^{2 +} сигналы²⁵, проблемы с Фотообесцвечивание может по-прежнему остаются проблемой для некоторых исследователей ^26,27,28. Резкий Фотообесцвечивание также ограничивает масштаб, скорость загрузки изображений, и резолюции, который может использоваться для записи, как увеличение мощности объективных и более высокие темпы захвата изображений требуется увеличение интенсивности света возбуждения, увеличивает Фотообесцвечивание.

Эти ограничения традиционных Ca^{2 +} индикатор красители усугубляются при записи Ca^{2 +} сигналов на местах, например при записи внутриклеточных Ca^{2 +} сигналы от нетронутыми тканей. Из-за выше проблемы, Визуализация Ca^{2 +} сигналов на месте с использованием клеток проницаемых Ca^{2 +} показателей была ограничена увеличения малой мощности и сниженные ставки захвата изображения, ограничивает возможности следователей для записи и количественно височно или пространственно ограниченных субцеллюлярные Ca^{2 +} сигналов. Таким образом было трудно захватить, проанализировать и оценить пространственные и временные сложности Ca^{2 +} сигналов, которые могут быть важны в поколение желаемого биологических реакций, как описано выше. Анализ Ca^{2 +} сигналов от клеток на месте обычно основывается на простой интенсивности измерения из выбранных областей интереса (ROI) в поле зрения (FOV). Произвольный выбор количество, размер и положение трансформирования, зависит от прихоти исследователя, может серьезно смещения полученные результаты. А также присущи предвзятости с анализом ROI, этот подход игнорирует большую часть важных сигналов информация, содержащаяся в ПЗ, как динамический Ca^{2 +} события в пределах произвольно выбранной ROI отбираются для анализа. Кроме того анализ Руа не для предоставления сведений о пространственных характеристик Ca^{2 +} сигналов наблюдается. Например, это не возможно провести различие между увеличением Ca^{2 +} в результате распространения Ca^{2 +} волна и высоко локализованных Ca^{2 +} релиз событий из таблицы Ca^{2 +} сигналов в пределах ROI.

С появлением генетически закодированный Ca^{2 +} показателей (GECIs), радикально изменилась, как Ca^{2 +} изображений может быть выполненной в situ^{29,30,,3132,33} . Есть несколько преимуществ использования GECIs над красители. Наиболее важным, возможно, что выражение ГЕЧИ может быть выполнена определенным образом клеток, что уменьшает нежелательные фон загрязнения от клеток не интерес. Еще одним преимуществом GECIs над традиционными Ca^{2 +} показателей является, что Фотообесцвечивание уменьшается (флуоресценции и, как следствие, Фотообесцвечивание происходит только когда клетки являются активные), по сравнению с краситель загружены образцы, особенно на высоких увеличение и высокие показатели образа захвата³⁴. Таким образом, формирование изображений с GECIs, такие, как GCaMP серии optogenetic датчиков, предоставляет следователям возможность записи краткие, локализованные субклеточном Ca^{2 +} сигналов в situ и расследовать Ca^{2 +} сигнализации в клетках в течение их родной среды, которые ранее не удалось. Для максимального восстановления информации из такого высокого разрешения записи, соответствующие пространственной и временной анализ Ca^{2 +} сигналов не требуется. Следует отметить, что, хотя GECIs может предложить некоторые ясные преимущества, недавние исследования показали, что Ca^{2 +} изображений могут быть успешно выполнены из больших популяций различных классов нейрохимических нейронов одновременно с использованием обычных CA^{2 +} индикаторы, которые генетически не кодируются в животных³⁵. Этот подход используется post hoc иммуногистохимия выявить несколько различных классов нейронов стрельбы на высоких частотах в синхронизированных выстрелов и избегать потенциал, что генетические модификации для животного может помешали физиологических поведение следователь стремится понять^35,36.

Протоколы, изложенных в настоящем документе облегчить более полный анализ и количественная оценка Ca^{2 +} сигналов, записанные с клетки на месте, используя комбинацию пространственно-временных карты (СТМ)-на основе анализа и анализа на основе частиц. Протоколы также описывают как различные модели Ca^{2 +} сигнализации наблюдаемых в различных клеток, которые население на местах могут быть проанализированы надлежащим образом. Для иллюстрации, метод будет проверять Ca^{2 +} сигнализации в специализированных популяции клеток в тонком кишечнике, интерстициальных клеток Кахаля (ICC). ICC – специализированные клетки желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), которые экспонат динамическое внутриклеточных Ca^{2 +} сигнализации, как визуализируются с помощью мыши, выражая GCaMPs^{37,,3839,40, , 41}–⁴². CA^{2 +} переходные процессы в МУС связаны с активации Ca^{2 +}-активированный Cl^– (в формате Ano1) каналы, которые играют важную роль в регуляции возбудимости кишечных гладкомышечные клетки (SMCs)^{43, 45 44,}. Таким образом изучение Ca^{2 +} сигнализации в МУС имеет основополагающее значение для понимания кишечной моторики. Мышиных тонкой кишки служит прекрасным примером для этой демонстрации, поскольку существует два класса МУС, которые анатомически разделены и могут быть визуализированы самостоятельно: я) ICC расположены в районе между круговой и продольных гладких мышц слои, окружающие myenteric сплетение (ICC-MY). Эти клетки служат кардиостимулятор клетки и генерации электрической активности, известный как медленные волны^46,47,,4849; II) ICC также расположены среди сплетения, богатые в терминалах двигательных нейронов (глубокие мышечные сплетения, таким образом ICC-DMP). Эти клетки служат посредниками ответов на кишечные мотор синапсах^37,,3940,50. ICC-MY и ICC-DMP морфологически отличаются, и их Ca^{2 +} сигнализации поведения радикально отличаются для решения их конкретных задач. ICC-MY севрюги в форме и образуют сеть взаимосвязанных клеток через разрыв соединения^51,52. CA^{2 +} сигналов в ICC-мой манифест как краткие и пространственно-локализованных Ca^{2 +} релиз событий, происходящих на нескольких сайтах асинхронно через ICC-моя сеть как визуализация в ПЗ (образы с 60 X цель)³⁸. Эти асинхронные сигналы височно организованы в 1 секунду кластеров, что, когда Табулированы вместе, сумма нетто 1 s сотовой увеличение Ca^{2 +}. Эти сигналы распространения ячеек в пределах сети МУС и поэтому организовать Ca^{2 +} сигнализации, сгенерированные из субклеточном сайты ткани широкие Ca^{2 +} волна. Височной группирования и суммирования Ca^{2 +} сигналов в ICC-мой был назван Ca^{2 +} переходных кластеры (CTCs)³⁸. ЦОК происходит ритмично (например очень похожи длительностей и аналогичные периоды между CTCs) 30 раз в минуту в мыши. И наоборот ICC-DMP шпинделя формы клетки, некоторые с вторичных процессов, которые распределить между SMCs и варикозной нервных процессов, а не самостоятельно формируют сети^51,52. ICC-DMP формы разрыв соединения с SMCs, однако и функции в рамках этой более синцития, известный как SIP синцития⁵³. CA^{2 +} сигналы происходят в нескольких местах вдоль длины клеток, но эти переходные процессы не увлекаемого или височно кластеризованный, как отмечено в ICC-мой³⁷. CA^{2 +} сигналов в ICC-DMP происходят на основе стохастической, с переменной интенсивности, длительности и пространственных характеристик. Протоколы ниже, на примере Ca^{2 +} сигнализации в ICC-мой и ICC-DMP, описывают методы для анализа сложных сигналов в конкретных типах клеток на месте. Мы использовали индуцибельной Cre-Lox p системы выразить GCaMP6f исключительно в МУС, после вызывающих активацию Cre-рекомбиназа (Cre) обусловлен конкретной промоутера ICC (комплект).

Protocol

Все животные и протоколы, в этом исследовании были в соответствии с национальных институтов здравоохранения руководство для ухода и использования лабораторных животных. Все процедуры были утверждены Комитетом правомерного использования животных и уход на Университет Невады в Рено.</…

Representative Results

С помощью мыши Kit-Cre-GCaMP6F (рис. 1), динамические Ca2 + сигнализации что поведение ICC в желудочно-кишечном тракте может отражаться на месте. С помощью конфокальной микроскопии изображения с высоким разрешением конкретных популяций МУС могут быть приобр…

Discussion

CA^{2 +} изображений конкретных типов клеток в пределах нетронутыми тканей или сети клеток часто показывает сложные узоры Ca^{2 +} транзиентов. Эта деятельность требует тщательного и углубленного анализа и количественной оценки, чтобы захватить столько информации об основных событ…

Materials

Image J software	NIH	1.5a	Image J software
Volumetry	GWH	Volumetry 8Gd	Custom made analysis software
Isoflurane	Baxter, Deerfield, IL, USA	NDC 10019-360-60
Tamoxifen	Sigma	T5648
GCaMP6F mice	Jackson Laboratory	Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D
Kit-Cre mice	Gifted From Dr. Dieter Saur	c-Kit+/Cre-ERT2
Ethanol	Pharmco-Aaper	SDA 2B-6