Aplicaciones de la cartografía espacio-temporal y técnicas de análisis de partículas para cuantificar Ca intracelular2 + señalización In Situ

Summary

Ca^{2 +} indicadores genético codificados (GECIs) han cambiado radicalmente cómo in situ Ca^{2 +} proyección de imagen se realiza. Para maximizar la recuperación de datos de esas grabaciones, análisis apropiado de señales de Ca^{2 +} se requiere. Los protocolos en este trabajo facilitan la cuantificación de Ca^{2 +} señales grabadas in situ utilizando Cartografía espacio-temporal y el análisis de partículas.

Abstract

CA^{2 +} proyección de imagen de células aisladas o tipos específicos de células dentro de tejidos intactos a menudo revela patrones complejos de Ca^{2 +} señalización. Esta actividad requiere cuidadosos y profundo análisis y cuantificación para capturar toda la información sobre los eventos subyacentes como sea posible. Espacial, temporal y los parámetros de intensidad intrínsecos al Ca^{2 +} señales tales como frecuencia, duración, propagación, velocidad y amplitud pueden proporcionar información biológica necesaria para la señalización intracelular. Alta resolución Ca^{2 +} la proyección de imagen típicamente resultados en la adquisición de grandes archivos de datos que son lentos al proceso en cuanto a la traducción de la información de imagen en datos cuantificables y este proceso puede ser susceptible a sesgo y error humano. Análisis de Ca^{2 +} señales de células in situ por lo general se basa en mediciones de intensidad simple de arbitrariamente las regiones de interés (ROI) dentro de un campo de visión (FOV). Este enfoque ignora gran parte de la información de señalización importante contenida en el FOV. Por lo tanto, para maximizar la recuperación de la información de tales grabaciones de alta resolución obtenidos con tintes de Ca^{2 +}o optogenetic Ca^{2 +} imagen, adecuado análisis espacial y temporal de las señales de Ca^{2 +} se requiere. Los protocolos descritos en este artículo describen cómo se puede obtener un gran volumen de datos de Ca^{2 +} proyección de imagen las grabaciones para facilitar el más completo análisis y cuantificación de Ca^{2 +} señales de las células usando una combinación de mapa espacio-temporal (STM)-basado en el análisis y el análisis de partículas. Los protocolos también describen cómo diferentes patrones de Ca^{2 +} señalización observada en células diferentes poblaciones in situ pueden ser analizadas adecuadamente. Por ejemplo, el método examinará Ca^{2 +} en una población especializada de células en el intestino, células intersticiales de Cajal (ICC), usando GECIs.

Introduction

CA^{2 +} es un mensajero intracelular ubicuo que controla una amplia gama de procesos celulares, tales como músculo contracción^1,2, metabolismo³, celular proliferación^{3,4, 5}, estimulación de liberación de neurotransmisor en el nervio terminales^6,7y la activación de la transcripción de factores en el núcleo. ⁷ Ca intracelular^{2 +} señales muchas veces tomar la forma de elevaciones transitorias en citosólica Ca^{2 +}, y estos pueden ser espontáneos o surgen de la estimulación agonista dependiendo el tipo de célula⁸. Espacial, temporal y los parámetros de intensidad intrínsecos al Ca^{2 +} señales tales como frecuencia, duración, propagación, velocidad y amplitud pueden proporcionar la información biológica necesaria para la señalización intracelular^{5, 7 , 9}. citoplasmática de Ca^{2 +} señales pueden resultar de la afluencia de Ca^{2 +} desde el espacio extracelular o a través de Ca^{2 +} liberación desde el retículo endoplásmico (ER) a través de canales de Ca^{2 +} lanzamiento como receptores de Ryanodina (RyRs) y receptores de inositol-tri-fosfato (IP₃Rs)¹⁰. RyRs y IP₃Rs pueden contribuir a la generación de señales de Ca^{2 +} y la apertura concertada de estos canales, que combinado con diversos mecanismos de Ca^{2 +} afluencia puede resultar en una miríada de Ca^{2 +} patrones de señalización que son formados por los números y abre la probabilidad de Ca^{2 +} flujo canales, el perfil de la expresión de canales de Ca^{2 +} liberación, la proximidad entre el Ca^{2 +} afluencia y canales de la libertad y expresión y distribución de Ca^{2 +} las proteínas de reabsorción y de la protuberancia. CA^{2 +} señales pueden tomar la forma de uniforme, duradero, las oscilaciones globales de intensidad alta que puede durar varios segundos o incluso minutos, multiplicación intracelulares e intercelulares Ca^{2 +} ondas que pueden cruzar distancias intracelulares más de 100 μm^{10,11,12,13,14,15,16}, o más breve, espacialmente localizados eventos como Ca^{2 +} chispas y Ca^{2 +} soplos que se producen en decenas de milisegundo plazos y menos de 5 μm^17,18,19,20.

Microscopía fluorescente se ha utilizado ampliamente para controlar Ca^{2 +} señalización en células aisladas y cultivadas y en los tejidos intactos. Tradicionalmente, estos experimentos incluyeron el uso de fluorescentes Ca^{2 +} indicadores, proporcionales y no proporcionales tintes como Fura2, Fluo3/4 o Rhod2, entre otros ^21,22,23. Estos indicadores fueron diseñados para ser permeable a las membranas celulares y luego queda atrapado en las células por el clivaje de un grupo éster mediante esterasas endógenas. Unión del Ca^{2 +} en los indicadores de alta afinidad provocó cambios en la fluorescencia, cuando las células y los tejidos se iluminan por las correspondientes longitudes de onda de la luz. El uso de celular permeable al Ca^{2 +} indicadores mejorado enormemente nuestra comprensión de Ca^{2 +} señalización en las células vivas y permite la resolución espacial y cuantificación de estas señales que no era posible analizando las señales de Ca^{2 +} a través de otros medios, como la electrofisiología. Sin embargo, tradicional Ca^{2 +} indicadores tienen varias limitaciones, como el fotoblanqueo que ocurre durante períodos de grabación extendida²⁴. Mientras que el indicador de Ca^{2 +} nuevos tintes como Cal520/590 tienen mucho mejor señal a proporción de ruido y la capacidad para detectar locales Ca^{2 +} señales²⁵, problemas con el fotoblanqueo pueden todavía sigue siendo una preocupación para algunos investigadores ^2627,de^,28. Fotoblanqueo precipitada también restringe el aumento, tasa de adquisición de la imagen, y resolución que se puede utilizar para las grabaciones, como aumentar la potencia objetivo y tasas de adquisición de imágenes requieren mayor intensidad de luz de excitación que aumenta el fotoblanqueo.

Estas limitaciones de tradicional Ca^{2 +} indicador de tintes se agravan cuando grabación de Ca^{2 +} señales in situ, por ejemplo cuando grabación intracelular Ca^{2 +} señales de tejidos intactos. Debido a los problemas mencionados, visualización de Ca^{2 +} señales in situ usando celular permeable al Ca^{2 +} indicadores ha sido limitada a aumento de la energía baja y redujo las tasas de captura de la imagen, restricción de la capacidad de los investigadores para registrar y cuantificar el Ca^{2 +} señales subcelulares temporal o espacialmente restringidas. Así, ha sido difícil de capturar, analizar y apreciar la complejidad espacial y temporal de Ca^{2 +} señales, que pueden ser importantes en la generación de respuestas biológicas deseadas, como se indicó anteriormente. Análisis de Ca^{2 +} señales de células in situ por lo general se basa en mediciones de intensidad simple de las regiones de interés (ROI) dentro de un campo de visión (FOV). La opción arbitraria del número, tamaño y posición del ROI, dependiente en el capricho del investigador, severamente puede sesgar los resultados obtenidos. Así como el sesgo inherente con análisis del ROI, este enfoque ignora gran parte de la importante información contenida en el campo de visión, como dinámica Ca^{2 +} eventos dentro de un arbitrariamente elegido de señalización ROI son seleccionados para el análisis. Además, análisis de ROI no proporcionan información sobre las características espaciales de las Ca^{2 +} señales observadas. Por ejemplo, no es posible distinguir entre un aumento de Ca^{2 +} resultante de una propagación de onda de Ca^{2 +} y un altamente localizada Ca^{2 +} liberan evento de tabulaciones de Ca^{2 +} señales dentro de un retorno de la inversión.

El advenimiento de genéticamente codificados Ca^{2 +} indicadores (GECIs) ha cambiado radicalmente como Ca^{2 +} la proyección de imagen puede ser realizado en situ^{29,30,31,32,33} . Hay varias ventajas al uso de GECIs sobre tintes. El más importante quizás es que la expresión de GECI puede realizarse en una manera específica de la célula, que reduce la contaminación de fondo no deseados de las células no de interés. Otra ventaja de GECIs sobre tradicional Ca^{2 +} indicadores es eso fotoblanqueo se reduce (como fluorescencia y consecuencialmente fotoblanqueo sólo ocurre cuando las células están activas), en comparación con muestras, cargado de tinte, particularmente a alta Ampliación y las altas tasas de imagen capturan³⁴. Así, la proyección de imagen con GECIs, tales como la serie de GCaMP de optogenetic sensores, ofrece a los investigadores la capacidad para registrar breve, localizada celular Ca^{2 +} señales en situ e investigar Ca^{2 +} en células dentro de su ambientes nativos que no han sido posibles anteriormente. Para maximizar la recuperación de la información de tales grabaciones de alta resolución, análisis espacial y temporal adecuado de las señales de Ca^{2 +} se requiere. Cabe señalar que mientras GECIs puede ofrecer que algunas ventajas claras, estudios recientes han revelado que Ca^{2 +} la proyección de imagen puede ser realizada con éxito de grandes poblaciones de diferentes clases neuroquímicas de neuronas simultáneamente con las convencionales CA^{2 +} en los indicadores que no están genéticamente codificados en los animales³⁵. Este enfoque utiliza inmunohistoquímica post-hoc para revelar varias clases diferentes de neuronas disparar en alta frecuencia en explosiones sincronizadas y evita el potencial que las modificaciones genéticas a los animales pueden haber interferido con el fisiológico comportamiento el investigador busca comprender^35,36.

Los protocolos descritos en este documento facilitan más completo análisis y cuantificación de Ca^{2 +} señales grabadas desde células in situ usando una combinación de mapa espacio-temporal (STM)-basado en el análisis y el análisis de partículas. Los protocolos también describen cómo diferentes patrones de Ca^{2 +} señalización observada en células diferentes poblaciones in situ pueden ser analizadas adecuadamente. Por ejemplo, el método examinará Ca^{2 +} en una población especializada de células en el intestino, células intersticiales de Cajal (ICC). ICC son las células especializadas en el tracto gastrointestinal (GI) que presentan dinámica intracelular Ca^{2 +} señalización, como visualizar usando los ratones que expresaban GCaMPs^{37,38,39,40, 41,42}. CA^{2 +} transitorios en ICC están vinculados a la activación de Ca^{2 +}-activa Cl^– (codificados por Ano1) los canales que son importantes en la regulación de la excitabilidad del músculo liso intestinal células (SMCs)^{43, 44,45}. Así, el estudio de Ca^{2 +} en ICC es fundamental para comprender la motilidad intestinal. El intestino murino ofrece un excelente ejemplo de esta demostración, ya que hay dos clases de ICC que están separadas anatómicamente y pueden visualizarse de forma independiente: i) ICC están situados en la zona entre el músculo liso circular y longitudinal capas, que rodean el plexo mientérico (ICC-mi). Estas células sirven como células marcapasos y generan la actividad eléctrica conocida como ondas lentas^46,47,48,49; II) ICC también se encuentran entre un plexo rico en los terminales de las neuronas motoras (plexo muscular profundo, así ICC-DMP). Estas células sirven como mediadores de las respuestas a la neurotransmisión entéricas de motor^37,39,40,50. ICC-mi y ICC-DMP son morfológicamente distintos, y sus comportamientos señalización Ca^{2 +} se diferencian radicalmente para realizar sus tareas específicas. ICC-mi son radiados en la forma y forman una red de células interconectadas a través de las ensambladuras de gap^51,52. CA^{2 +} señales en ICC-mi manifiesto como breves y localizadas espacialmente Ca^{2 +} lanzamiento eventos que ocurren en los sitios múltiples asincrónicamente a través de la ICC-mi red como visualizado dentro de un campo de visión (imagen con el objetivo X 60)³⁸. Estas señales asíncronas están organizadas temporalmente en 1 segundo racimos que, cuando se tabulan juntos, equivalen a un neto 1 s celular aumento de Ca^{2 +}. Estas señales de propagación célula a célula, dentro de la red de ICC y por lo tanto organizan Ca^{2 +} señalización, generados a partir de sitios web celular, en una tejido amplio Ca^{2 +} onda. Clustering temporal y la sumatoria de Ca^{2 +} señales en ICC-mi se la ha denominado Ca^{2 +} grupos transitorios (CTC)³⁸. CTC se producen rítmicamente (e.g. bastante similares duraciones y periodos similares entre CTC) 30 veces por minuto en el ratón. Por el contrario, ICC-DMP están las células del huso en forma, algunos con procesos secundarios, que distribuyen entre comités y procesos del nervio varices y no independientemente forman una red^51,52. ICC-DMP forman uniones comunicantes con comités, sin embargo y dentro este sincitio mayor, conocido como el SIP sincicio⁵³. Señales de CA^{2 +} se producen en múltiples sitios a lo largo de la longitud de las células, pero estas oscilaciones no ocluidos o temporal agrupados, como se observa en el ICC-mi³⁷. CA^{2 +} señales en ICC-DMP se producen de manera estocástica, con variable intensidad, duración y características espaciales. Los protocolos por debajo, usando el ejemplo de Ca^{2 +} en ICC-mi y ICC-DMP, describen técnicas para analizar el complejo de señalización en tipos específicos de células in situ. Utilizamos el sistema Cre-Lox inducible para expresar GCaMP6f exclusivamente en la ICC, después de inducir la activación de Cre-Recombinase (Cre) conducida por un promotor específico de la ICC (Kit).

Protocol

Todos los animales utilizados y los protocolos realizados en este estudio estaban de acuerdo con los institutos nacionales de salud guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio. Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de cuidado en la Universidad de Nevada, Reno y uso institucional de Animal. 1. generación de ratones KitGCaMP6f Cruz Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D (ratones GCaMP6f) y c-Kit+ Cre-ERT2 (Kit-Cre ratones) para generar ICC GCaMP6f expresando ani…

Representative Results

Utilizando ratones de Kit-Cre-GCaMP6F (figura 1), dinámica Ca2 + señalización comportamientos de ICC en el tracto gastrointestinal pueden ser reflejadas en situ. Con microscopía confocal, imágenes de alta resolución de poblaciones específicas de ICC pueden ser adquiridos sin contaminar las señales de otras poblaciones de CPI dentro del mismo tejido pero en planos anatómico distintos del foco (figura 2A)<sup cl…

Discussion

CA^{2 +} proyección de imagen de tipos específicos de células dentro de tejidos intactos o dentro de las redes de las células a menudo revela patrones complejos de transitorios de Ca^{2 +} . Esta actividad requiere cuidadosos y profundo análisis y cuantificación para capturar toda la información sobre los eventos subyacentes y la cinética de estos eventos como sea posible. STM y PTCL análisis proporcionan una oportunidad para maximizar la cantidad de datos cuantitativos rindió de grabaciones de …

Materials

Image J software	NIH	1.5a	Image J software
Volumetry	GWH	Volumetry 8Gd	Custom made analysis software
Isoflurane	Baxter, Deerfield, IL, USA	NDC 10019-360-60
Tamoxifen	Sigma	T5648
GCaMP6F mice	Jackson Laboratory	Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D
Kit-Cre mice	Gifted From Dr. Dieter Saur	c-Kit+/Cre-ERT2
Ethanol	Pharmco-Aaper	SDA 2B-6