Applicazioni di mappatura spazio-temporale e tecniche di analisi delle particelle per quantificare la segnalazione intracellulare Ca2 + In Situ

Summary

Indicatori di codificato geneticamente Ca^{2 +} (GECIs) hanno cambiato radicalmente come in situ Ca^{2 +} imaging viene eseguita. Per massimizzare il recupero dei dati da tali registrazioni, analisi appropriata di Ca^{2 +} segnali è necessaria. I protocolli in questa carta facilitano la quantificazione di Ca^{2 +} segnali registrati in situ utilizzando spatiotemporal mappatura e analisi delle particelle.

Abstract

CA^{2 +} imaging di cellule isolate o tipi specifici di cellule all’interno dei tessuti intatti spesso rivela modelli complessi di segnalazione di Ca^{2 +} . Questa attività richiede un’attenta e approfondite analisi e quantificazione di catturare quante più informazioni possibili sugli eventi sottostanti. Spaziale, temporale e i parametri di intensità intrinseci di Ca^{2 +} segnali quali frequenza, durata, propagazione, velocità e ampiezza possono fornire qualche informazione biologiche necessarie per la segnalazione intracellulare. Alta risoluzione Ca^{2 +} imaging in genere comporta la successiva acquisizione di file di dati di grandi dimensioni che richiedono molto tempo al processo in termini di tradurre le informazioni di imaging in dati quantificabili e questo processo può essere suscettibile di pregiudizi e di errore umano. Analisi di Ca^{2 +} segnali dalle cellule in situ in genere si basa su misure di intensità semplice da arbitrariamente selezionate regioni di interesse (ROI) all’interno di un campo visivo (FOV). Questo approccio ignora gran parte le informazioni di segnalazione importante contenute nel FOV. Quindi, al fine di massimizzare il recupero di informazioni da tali registrazioni ad alta risoluzione ottenute con Ca^{2 +}coloranti o optogenetica Ca^{2 +} imaging, appropriata analisi spaziale e temporale dei segnali Ca^{2 +} è necessario. I protocolli illustrati in questo articolo descriverò come un volume elevato di dati possa essere ottenuto da Ca^{2 +} imaging registrazioni per facilitare la più completa analisi e quantificazione del Ca^{2 +} segnali registrati dalle celle usando una combinazione di Mappa spazio-temporale (STM)-basato su analisi e analisi basate su particelle. I protocolli descrivono anche come diversi modelli di Ca^{2 +} segnalazione osservata in cellule diverse popolazioni in situ possono essere analizzati in modo appropriato. Per l’illustrazione, esaminerà il metodo Ca^{2 +} segnalazione in una popolazione specializzata di cellule nel piccolo intestino, cellule interstiziali di Cajal (ICC), utilizzando GECIs.

Introduction

CA^{2 +} è un messaggero intracellulare onnipresente che controlla una vasta gamma di processi cellulari, come muscolo contrazione^1,2, metabolismo³, cella proliferazione^{3,4, 5}, stimolazione del rilascio di neurotrasmettitore a nervo terminali^6,7e l’attivazione della trascrizione fattori nel nucleo. ⁷ intracellulare Ca^{2 +} segnali spesso assumere la forma di aumenti transitori in citosolico Ca^{2 +}, e questi possono essere spontanee o derivano dalla stimolazione agonista a seconda il tipo di cella⁸. Spaziale, temporale e i parametri di intensità intrinseci di Ca^{2 +} segnali come frequenza, durata, propagazione, velocità e ampiezza possono fornire le informazioni biologiche necessarie per segnalazione intracellulare^{5, 7 , 9}. citoplasmatica Ca^{2 +} segnali possono derivare dall’afflusso di Ca^{2 +} dallo spazio extracellulare o tramite rilascio di Ca^{2 +} dal reticolo endoplasmico (ER) tramite canali del Ca^{2 +} rilascio come recettori della rianodina (RyRs) e recettori di inositolo-tri-fosfato (IP₃Rs)¹⁰. RyRs e IP₃Rs può contribuire alla generazione di Ca^{2 +} segnali e l’apertura concertata di questi canali, che combinato con vari Ca^{2 +} afflusso meccanismi può causare una miriade di Ca^{2 +} modelli di segnalazione che sono modellati dai numeri e aprire la probabilità di canali del Ca^{2 +} afflusso, il profilo di espressione di canali di rilascio di Ca^{2 +} , la prossimità fra afflusso di Ca^{2 +} e canali di rilascio ed espressione e la distribuzione di Ca^{2 +} proteine della ricaptazione ed estrusione. CA^{2 +} segnali possono assumere la forma di uniforme, di lunga durata, oscillazioni globali ad alta intensità che può durare per diversi secondi o addirittura minuti, moltiplicazione intracellulare e intercellulare Ca^{2 +} onde che possono attraversare distanze intracellulare oltre 100 µm^{10,11,12,13,14,15,16}, o più brevi, spazialmente localizzati eventi come Ca^{2 +} scintille e Ca^{2 +} sbuffi che si verificano su decine di millisecondi scale cronologiche e sviluppa meno di 5 µm^17,18,19,20.

La microscopia fluorescente è stata utilizzata ampiamente per monitorare Ca^{2 +} segnalazione in cellule isolate e coltivate e nei tessuti intatti. Tradizionalmente, questi esperimenti prevedevano l’utilizzo di indicatori fluorescenti per Ca^{2 +} , raziometrici e non-raziometrici coloranti quali Fura2, Fluo3/4 o Rhod2, tra gli altri ^21,22,23. Questi indicatori sono stati progettati per essere permeabile alle membrane delle cellule e quindi diventare intrappolati nelle cellule tramite la fenditura di un gruppo di estere tramite esterasi endogene. Associazione di Ca^{2 +} per gli indicatori di alta affinità causato cambiamenti in fluorescenza quando le cellule e tessuti sono stati illuminati da adeguate lunghezze d’onda della luce. L’uso di cellulare permeabile Ca^{2 +} indicatori notevolmente migliorato la nostra comprensione di Ca^{2 +} segnalazione in cellule viventi e consentito la risoluzione spaziale e la quantificazione di questi segnali che non era possibile analizzando Ca^{2 +} segnali attraverso altri mezzi, ad esempio di elettrofisiologia. Tuttavia, Ca^{2 +} gli indicatori tradizionali presentano alcune limitazioni, ad esempio photobleaching che si verifica nel corso di periodi di registrazione estesa²⁴. Mentre più recente^{2 +} indicatore di Ca coloranti come Cal520/590 hanno notevolmente migliorato segnale ai rapporti di rumore e la capacità di rilevare locale Ca^{2 +} segnali²⁵, problemi con photobleaching possono ancora rimangono una preoccupazione per alcuni ricercatori ^26,27,28. Precipitosa photobleaching limita anche l’ingrandimento, tasso di acquisizione dell’immagine, e la risoluzione che può essere utilizzata per le registrazioni, come richiedono maggiore potenza oggettiva e più alti tassi di acquisizione immagine aumentata intensità di luce di eccitazione che aumenta photobleaching.

Queste limitazioni di tradizionale Ca^{2 +} indicatore coloranti sono esacerbati durante la registrazione di Ca^{2 +} segnali in situ, ad esempio quando registrazione intracellulare di Ca^{2 +} segnali dai tessuti intatti. A causa di problemi di cui sopra, visualizzazione di Ca^{2 +} segnali in situ tramite cellulare permeabile Ca^{2 +} indicatori è stato limitato a basso ingrandimento e ridotto i tassi di cattura delle immagini, vincolando la capacità degli investigatori per registrare e quantificare il Ca^{2 +} segnali subcellulari temporalmente o spazialmente limitati. Così, è stato difficile catturare, analizzare e apprezzare la complessità spaziale e temporale di Ca^{2 +} segnali, che può essere importante nella generazione di risposte biologiche desiderate, come indicato in precedenza. Analisi di Ca^{2 +} segnali dalle cellule in situ in genere si basa su misure di intensità semplice da determinate regioni di interesse (ROI) all’interno di un campo visivo (FOV). Scelta arbitraria del numero, dimensione e posizione di ROIs, dipendente per il capriccio del ricercatore, gravemente può influenzare i risultati ottenuti. Così come intrinseca parzialità con analisi del ROI, questo approccio ignora gran parte delle importanti informazioni contenute nel FOV, come Ca^{2 +} gli eventi dinamici all’interno di un arbitrariamente scelto di segnalazione ROI sono selezionati per l’analisi. Inoltre, analisi di ROIs non riesce a fornire informazioni circa le caratteristiche spaziali del Ca^{2 +} segnali osservati. Ad esempio, potrebbe non essere possibile distinguere tra un aumento del Ca^{2 +} risultanti da una moltiplicazione Ca^{2 +} onda e altamente localizzata Ca^{2 +} rilascio evento da tabulazioni di Ca^{2 +} segnali all’interno di un ROI.

L’avvento di codificato geneticamente Ca^{2 +} indicatori (GECIs) ha cambiato radicalmente come Ca^{2 +} formazione immagine possa essere eseguite in situ^{29,30,31,32,33} . Ci sono molti vantaggi di utilizzare GECIs sopra coloranti. La più importante è forse che espressione di GECI possa essere eseguite in modo specifico delle cellule, che riduce la contaminazione di fondo indesiderati dalle cellule non di interesse. Un altro vantaggio di GECIs in Ca^{2 +} gli indicatori tradizionali è che photobleaching è ridotta (come fluorescenza e conseguenza photobleaching si verifica solo quando le cellule sono attive), rispetto agli esemplari di tintura-caricato, particolarmente ad alta ingrandimento e alti tassi di immagine catturano³⁴. Così, con GECIs, di imaging, come la serie GCaMP di sensori optogenetica, offre gli investigatori la capacità di registrare brevi, localizzato sub-cellulare Ca^{2 +} segnali in situ e indagare Ca^{2 +} segnalazione in cellule all’interno di loro ambienti nativi che non stato possibili in precedenza. Per massimizzare il recupero di informazioni da tali registrazioni ad alta risoluzione, opportune analisi spaziale e temporale dei segnali Ca^{2 +} è necessario. Dovrebbe essere notato che mentre GECIs può offrire che alcuni vantaggi evidenti, recenti studi hanno rivelato che il Ca^{2 +} formazione immagine può essere eseguita con successo da grandi popolazioni di neurochemical diverse classi di neuroni simultaneamente utilizzando convenzionali CA^{2 +} indicatori che non sono geneticamente codificati nel animale³⁵. Questo approccio utilizzato post-hoc immunohistochemistry per rivelare più diverse classi di neuroni sparando ad alta frequenza in modalità burst, sincronizzato ed evitato il potenziale che le modificazioni genetiche dell’animale possono interferire con il fisiologico comportamento l’investigatore cerca di comprendere^35,36.

Quantificazione di Ca^{2 +} segnali registrati dalle cellule in situ utilizzando una combinazione di spatiotemporal mappa (STM) e i protocolli illustrati in questo articolo facilitano l’analisi più completa-base analisi e analisi basate su particelle. I protocolli descrivono anche come diversi modelli di Ca^{2 +} segnalazione osservata in cellule diverse popolazioni in situ possono essere analizzati in modo appropriato. Per l’illustrazione, esaminerà il metodo Ca^{2 +} segnalazione in una popolazione specializzata di cellule nel piccolo intestino, cellule interstiziali di Cajal (ICC). ICC sono cellule specializzate nel tratto gastrointestinale (GI) che esibiscono dinamico intracellulare Ca^{2 +} segnalazione, come visualizzato usando topi che esprimono GCaMPs^{37,38,39,40, 41,42}. CA^{2 +} transitori in ICC sono legati all’attivazione di Ca^{2 +}-attivato Cl^– canali (codificati dal Ano1) che sono importanti nel regolare l’eccitabilità della muscolatura liscia intestinale cellule (SMCs)^{43, 44,45}. Così, lo studio di Ca^{2 +} segnalazione in ICC è fondamentale per comprendere la motilità intestinale. Il piccolo intestino murino offre un eccellente esempio per questa dimostrazione, come ci sono due classi di ICC che anatomicamente sono separate e possono essere visualizzate in modo indipendente: io) ICC si trovano nella zona tra la muscolatura liscia circolare e longitudinale strati, che circonda il plesso mioenterico (ICC-mio). Queste cellule fungono da cellule pacemaker e generano l’attività elettrica conosciuta come onde lente^46,47,48,49; II) ICC si trovano tra un plesso ricco nei terminali dei motoneuroni (plesso muscolare profondo, così ICC-DMP). Queste cellule fungono da mediatori di risposte a enterico neurotrasmissione motore^37,39,40,50. ICC-MY e ICC-DMP sono morfologicamente distinte, e i loro comportamenti segnalazione Ca^{2 +} differiscono radicalmente per svolgere i loro compiti specifici. ICC-MY sono stellari in forma e formano una rete di cellule interconnesse tramite gap junctions^51,52. CA^{2 +} segnali nel ICC-MY manifesto come brevi e spazialmente localizzati Ca^{2 +} rilascio eventi che si verificano in più siti in modo asincrono attraverso la rete ICC-MY come visualizzati all’interno di un FOV (imaged con un obiettivo 60x)³⁸. Questi segnali asincroni sono organizzati temporaneamente in 1 secondo cluster che, quando tabulati insieme, ammontano ad un netto aumento di 1 s cellulare in Ca^{2 +}. Questi segnali si propagano cellula–cellula all’interno della rete ICC e pertanto organizzano Ca^{2 +} segnalazione, generati da siti sub-cellulare, in un tessuto largo Ca^{2 +} dell’onda. Clustering temporale e la sommatoria di Ca^{2 +} segnali ICC-MY è stato chiamato Ca^{2 +} cluster transitoria (CTCs)³⁸. CTCs verificarsi ritmicamente (ad es. abbastanza simili durate e periodi simili tra CTCs) 30 volte al minuto nel topo. Al contrario, ICC-DMP sono cellule fusiformi, alcuni con processi secondari, che distribuiscono tra SMC e processi del nervo varicose e non in modo indipendente formano una rete^51,52. Giunzioni di gap di forma di ICC-DMP con paesi del Mediterraneo meridionale, tuttavia e funzione all’interno di questo maggiore del sincizio, conosciuto come il SIP del sincizio⁵³. CA^{2 +} segnali si verificano in più siti lungo le lunghezze delle cellule, ma questi transitori non sono trascinati o raggruppati temporaneamente, come osservato in ICC-MY³⁷. CA^{2 +} segnali in ICC-DMP si verificano in modo stocastico, con intensità variabile, durate e caratteristiche spaziali. I protocolli di seguito, utilizzando l’esempio di Ca^{2 +} segnalazione in ICC-MY e ICC-DMP, descrivono le tecniche per analizzare segnali complessi in tipi specifici di cellule in situ. Abbiamo utilizzato il sistema inducibile di Cre-Lox p per esprimere GCaMP6f esclusivamente in ICC, dopo che inducono l’attivazione di Cre-Recombinase (Cre) guidato da un promotore di specifiche ICC (Kit).

Protocol

Tutti gli animali utilizzati e i protocolli effettuati in questo studio erano in conformità con l’istituti nazionali di salute Guida per la cura e l’uso di animali da laboratorio. Tutte le procedure sono state approvate dal comitato di cura presso la University of Nevada, Reno e uso animale istituzionale. 1. generazione di topi KitGCaMP6f Attraversare Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D (GCaMP6f topi) e c-Kit+ / Cre-ERT2 (Kit-Cre topi) per generare animali di GCaMP6f specifici ICC di es…

Representative Results

Utilizzando topi Kit-Cre-GCaMP6F (Figura 1), dinamica Ca2 + segnalazione di comportamenti di ICC nel tratto gastrointestinale possono essere imaged in situ. Con la microscopia confocale, immagini ad alta risoluzione di specifiche popolazioni di ICC possono essere acquisite senza contaminare i segnali provenienti da altre popolazioni di ICC all’interno del tessuto stesso, ma in anatomicamente distinti piani di messa a fuoco (Fig…

Discussion

CA^{2 +} imaging di tipi specifici di cellule all’interno dei tessuti intatti o all’interno di reti di cellule spesso rivela complessi pattern di transitori di Ca^{2 +} . Questa attività richiede un’attenta e approfondite analisi e quantificazione di catturare quante più informazioni possibili sugli eventi sottostanti e la cinetica di questi eventi. STM e analisi PTCL offrono l’opportunità di massimizzare la quantità di dati quantitativi risultanti dalle registrazioni di questo tipo.

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Materials

Image J software	NIH	1.5a	Image J software
Volumetry	GWH	Volumetry 8Gd	Custom made analysis software
Isoflurane	Baxter, Deerfield, IL, USA	NDC 10019-360-60
Tamoxifen	Sigma	T5648
GCaMP6F mice	Jackson Laboratory	Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D
Kit-Cre mice	Gifted From Dr. Dieter Saur	c-Kit+/Cre-ERT2
Ethanol	Pharmco-Aaper	SDA 2B-6