세포내 캘리포니아2 + 제자리에서 신호 계량 Spatio 시간적 매핑 및 입자 분석 기법에의 응용

Summary

유전자 인코딩된 Ca^{2 +} 지표 (GECIs) 근본적으로 어떻게 현장에서 캘리포니아^{2 +} 이미징 수행 달라졌다. 이러한 녹음에서 데이터 복구를 최대화 하기 위해 캘리포니아^{2 +} 신호의 적절 한 분석이 필요 합니다. 이 종이에 프로토콜 캘리포니아^{2 +} 신호를 원래의 spatiotemporal 매핑 및 입자 기반 분석을 사용 하 여 기록의 정량화를 촉진 한다.

Abstract

캘리포니아^{2 +} 이미징 격리 된 셀 또는 그대로 조직 내의 세포의 특정 종류의 종종 캘리포니아^{2 +} 신호의 복잡 한 패턴을 보여준다. 이 활동에는 신중 하 고 깊이 있는 분석과 정량화 가능한 기본 이벤트에 대 한 많은 정보를 필요 합니다. 공간, 시간 및 강도 매개 변수 캘리포니아^{2 +} 신호 주파수, 기간, 전파, 속도 진폭 등 본질적인 세포내 신호 전달에 필요한 몇 가지 생물 학적 정보를 제공할 수 있습니다. 고해상도 캘리포니아^{2 +} 시간이 걸릴 정량 데이터 이미징 정보 번역의 관점에서 프로세스 및이 프로세스는 큰 데이터 파일의 인수에 결과 일반적으로 이미징 인간의 오류와 편견에 감염 될 수 있습니다. 캘리포니아^{2 +} 세포 제자리에서 신호 분석 일반적으로 시야 (FOV) 내의 관심 (ROI)의 임의로 선택한 영역에서 간단한 강도 측정에 의존합니다. 이 이렇게 많은 FOV에 포함 된 중요 한 신호 정보를 무시 합니다. 따라서, 캘리포니아^{2 +}염료 또는 optogenetic Ca^{2 +} 얻은 같은 고해상도 녹음에서 정보의 복구를 최대화 하기 위해 이미징, 적절 한 공간 및 시간 분석 Ca^{2 +} 신호는 필요 합니다. 이 문서에 설명 된 프로토콜 어떻게 대용량 데이터의 더 완전 한 분석 및 캘리포니아^{2 +} 신호의 조합을 사용 하 여 셀에서 기록의 정량화를 촉진 하기 위하여 캘리포니아^{2 +} 영상 녹음에서 얻어질 수 있다 설명 spatiotemporal 지도 (STM)-분석 및 입자 기반 분석을 기반으로. 프로토콜은 또한의 캘리포니아^{2 +} 인구 현장에서 적절 하 게 분석 될 수 있다 다른 셀에서 관찰 된 신호 어떻게 다른 패턴을 설명 합니다. 이해를 돕기 위해 메서드를 검사 합니다 Ca^{2 +} 중간 셀의 Cajal (ICC), GECIs를 사용 하 여 작은 창 자에 있는 세포의 특수 인구에 신호.

Introduction

캘리포니아^{2 +} 는 다양 한 근육 수축^1,2, 신진 대사³, 셀 확산^3,4, 등의 세포 프로세스를 제어 하는 유비 쿼터 스 세포내 메신저 ⁵, 신경 터미널^6,7, 신경 전달 물질 방출의 자극과 활성화 전사의 핵에 있는 요인. ⁷ 세포내 캘리포니아^{2 +} 신호 종종 cytosolic 캘리포니아^{2 +}, 과도 고도의 형태를 걸릴 및 이러한 자발적인 수 수 또는 셀 유형⁸따라 주 작동 근 자극에서 발생 한다. 공간, 시간 및 강도 매개 변수 캘리포니아^{2 +} 신호 주파수, 기간, 전파, 속도, 진폭 등 본질적인 세포내 신호^5, 에 필요한 생물 정보를 제공할 수 있습니다. ^{7 , 9}. 세포질 캘리포니아^{2 +} 신호는 캘리포니아^{2 +} 릴리스 채널 ryanodine 수용 체 등을 통해 캘리포니아^{2 +} 또는 캘리포니아^{2 +} 릴리스 바인딩과 그물 (응급실)에서 세포 외 공간에서의 유입에서 발생할 수 있습니다 (RyRs)과 이노 시 톨-트라이-인산 염 수용 체 (IP₃Rs)¹⁰. RyRs 및 IP₃Rs 두 캘리포니아^{2 +} 신호 발생에 기여할 수 있으며 다양 한 Ca^{2 +} 유입 메커니즘 결합이 채널의 공동된 여 캘리포니아^{2 +} 신호 패턴의 무수 한 발생할 수 있습니다. 그 숫자에 의해 형성 및 확률 캘리포니아^{2 +} 유입 채널, 캘리포니아^{2 +} 유입 및 릴리스, 그리고 식 채널과 Ca^{2의 근접에 캘리포니아2 + 릴리스 채널의 식의 프로필을 열고 +} 단백질을 재흡수 및 압출. 캘리포니아^{2 +} 신호 형태의 유니폼, 오래 지속, 강도 높은 글로벌 진동 전파 세포내와 세포 Ca^{2 +} 파 세포내 거리 교차 수 있습니다. 몇 초 또는 분, 마지막 수 있습니다. 걸릴 수 있습니다. 100 µ m^{10,11,12,13,,1415,16}또는 캘리포니아 2 +^{와 같은 더 간단한, 공간적 지역화 된 이벤트} 불꽃 및 캘리포니아^{2 +} 퍼프 미만 5 µ m^17,18,,1920확산 수십 밀리초 timescales에 발생 하는.

형광 현미경 검사 법은 모니터링할 Ca^{2 +} 신호 분리 및 배양 세포에 그대로 조직에서 널리 사용 되었습니다. 전통적으로,이 실험 형광 캘리포니아^{2 +} 지표, 비율의 사용 및 비 비율 염료 Fura2, Fluo3/4 등 Rhod2, 다른 사람의 사이에서 ^21,,2223. 이러한 표시기는 세포 막에 융 화 되 고 다음 생 esterases 통해 에스테 르 그룹의 분열에 의해 세포에 갇혀 될 하도록 설계 되었습니다. 캘리포니아^{2 +} 높은 선호도 지표의 바인딩 세포와 조직 적합 한 파장의 빛에 의해 조명 되었다 형광에 변경 발생 합니다. 세포 투과성 캘리포니아^{2 +} 지표를 사용 하 여 크게 캘리포니아^{2 +} 살아있는 세포에서 신호 및 공간 해상도 Ca^{2 +} 신호 시 금에 의해 불가능 했던이 신호의 정량화를 허용의 우리의 이해를 향상 통해 전기 생리학 등 다른 의미 합니다. 그러나, 전통적인 캘리포니아^{2 +} 지표 확장된 녹음 기간²⁴이상 발생 하는 photobleaching 같은 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 새로운 Ca^{2 +} 표시기 염료와 같은 Cal520/590는 크게 향상 된 신호 소음 비율 및 로컬 Ca^{2 +} 신호²⁵를 감지 하는 능력을, 하는 동안 photobleaching 문제 일부 조사 ^{에 대 한 우려가 남아 수 있습니다. 26,,2728}. 깎아지른 듯한 photobleaching 또한 확대, 이미지 수집, 속도 제한 및 해상도 증가 객관적인 전력 및 이미지 수집의 요구 대로 녹음에 사용할 수 있는 여기 빛의 강도 증가 하는 photobleaching을 증가합니다.

전통적인 캘리포니아^{2 +} 표시기 염료는 캘리포니아^{2 +} 신호 제자리를 기록할 때 더욱 악화의 이러한 제한, 예를 들어 때 녹음 세포내 캘리포니아^{2 +} 신호 그대로 조직에서. 위의 문제로 인해 한 세포 침투성 캘리포니아^{2 +} 지표를 사용 하 여 제자리에 캘리포니아^{2 +} 신호 낮은 전력 확대에 국한 되었으며 이미지 캡처, 기록 조사 관의 능력 제한의 속도 감소 하 고 일시적으로 또는 공간적으로 제한 된 subcellular 캘리포니아^{2 +} 신호 계량. 따라서, 그것은 어려운 캡처, 분석, 및 캘리포니아^{2 +} 신호, 위에서 설명한 대로 원하는 생물학 응답의 생성에 중요 한 될 수 있는 공간 및 시간 복잡 감사 되었습니다. 캘리포니아^{2 +} 세포 제자리에서 신호 분석 일반적으로 관심 (ROI) 한 시야 (FOV) 내의 선택된 영역에서 간단한 강도 측정에 의존합니다. 수, 크기 및 ROIs, 연구원의 변덕에 의존의 위치 임의 선택 결과 편견 심각 수 있습니다. 고유한 바이어스 ROI 분석, 뿐만 아니라이 이렇게 무시 많은 중요 한 신호 정보는 임의로 선택한 내 동적 캘리포니아^{2 +} 이벤트로는 FOV에 포함 된 투자 수익 분석을 위해 선택 됩니다. 또한, 분석 ROIs의 Ca^{2 +} 신호 관찰의 공간적 특성에 대 한 정보를 제공 하기 위해 실패 합니다. 예, 그것은 가능 하지 않을지도 상승 캘리포니아^{2 +} 는 전파 발생 사이 구별 하 캘리포니아^{2 +} 파와는 매우 지역화 된 Ca^{2 +} 릴리스 캘리포니아^{2 +} 신호는 투자 수익의 도표가에서 이벤트.

유전자 인코딩된 Ca^{2 +} 지표 (GECIs)의 출현은 근본적으로 어떻게 캘리포니아^{2 +} 이미징 수행 현장에^{29,30,,3132,33 수 변경} . 염료에 GECIs를 사용 하 여 여러 가지 이점이 있다. 가장 중요 한는 아마 GECI의 표현 하지 관심의 세포에서 원치 않는 배경 오염 감소 셀 특정 방식으로 수행할 수 있습니다 이다. 전통적인 캘리포니아^{2 +} 지표 GECIs의 또 다른 장점은입니다 그 photobleaching 감소 (형광 및 consequentially photobleaching만 발생 때 세포는 활성), 특히 높은에서 염료 로드 표본에 비해 이미지의 확대 및 높은³⁴캡처. 따라서, 브리핑, 지역화 된 하위 세포질 캘리포니아^{2 +} 제자리에서 신호 GCaMP 시리즈 optogenetic 센서, 월급 조사 기록 하는 기능 같은 GECIs와 이미징 및 조사 캘리포니아^{2 +} 셀 내에서 신호 들 이전 가능한 되지 않은 환경에 대 한 네이티브입니다. 이러한 고해상도 녹음에서 정보의 복구를 최대화 하기 위해 적절 한 공간 및 시간 분석 Ca^{2 +} 신호는 필요 합니다. 그것은 그 GECIs 일부 취소 이점을 제공할 수 있습니다, 하는 동안 최근 연구 계시 했다 캘리포니아^{2 +} 이미징 성공적으로 동시에 사용 하 여 기존의 신경의 다른 neurochemical 클래스의 큰 인구에서 수행할 수 있습니다 주목 해야한다 캘리포니아^{2 +} 지표 유전자 동물³⁵로 인코딩된 하지. 이 이렇게는 동기화 된 버스트, 높은 주파수에서 발생 하는 신경의 여러 다른 클래스 공개 포스트 hoc immunohistochemistry를 사용 하 고 동물에 유전 수정 수 있다 방해 하는 생리 적 잠재력을 피했습니다 행동 조사^35,36을 이해 하고자 한다.

더 완전 한 분석을 촉진 하는이 문서에서 설명 하는 프로토콜 및 캘리포니아^{2 +} 의 정량화 신호 세포 spatiotemporal 지도 (STM)의 조합을 사용 하 여 현장에서 기록-분석 및 입자 기반 분석을 기반으로. 프로토콜은 또한의 캘리포니아^{2 +} 인구 현장에서 적절 하 게 분석 될 수 있다 다른 셀에서 관찰 된 신호 어떻게 다른 패턴을 설명 합니다. 이해를 돕기 위해 메서드를 검사 합니다 Ca^{2 +} 중간 셀 Cajal (ICC)의 작은 창 자에서 셀의 특수 인구에 신호. ICC는 전시 동적 세포내 캘리포니아^{2 +} 신호, GCaMPs^{38,,3739,40, 표현 하는 마우스를 사용 하 여 시각화 하는 위장 (GI) 지역에 전문된 셀 41,42}. 캘리포니아^{2 +} 과도 ICC에 캘리포니아^{2 +}의 활성화로 연결-활성화 Cl^– 장 평활 근 세포 (SMCs)^{43의 흥분을 조절에 중요 한 채널 ( Ano1인코딩) 44,45}. 따라서, 캘리포니아^{2 +} ICC에 시그널링의 연구 창 자 운동 성 이해에 기본적 이다. 해부학 분리 되 고 독립적으로 구상 될 수 있다 ICC의 두 클래스는 murine 소장이이 데모에 대 한 훌륭한 예를 제공 합니다: 난) ICC 원형 및 경도 평활 근 사이의 영역에 있는 레이어, myenteric 총을 둘러싼 (ICC 내). 이러한 셀 맥 박 조정기 세포 역할 및 느린 파도^46,47,,4849;로 알려진 전기 활동 생성 ii) ICC 모터 신경 (깊은 근육 신경 총, 따라서 ICC DMP)의 터미널에 풍부한 총 들도 있습니다. 이 세포는 장 모터 neurotransmission^37,39,,4050응답의 중재자 역할을 합니다. ICC-내 ICC DMP 형태학 상으로 다른, 그리고 그들의 캘리포니아^{2 +} 신호 동작 차이가 근본적으로 그들의 특정 작업을 수행. ICC-내 방사상 모양에서 그리고 간격 접속점^51,52를 통해 상호 연결 된 세포의 네트워크를 형성. 캘리포니아^{2 +} ICC 내 매니페스트에 짧고 공간 지역화 된 Ca^{2 +} 출시 이벤트로 FOV (60 X 목적으로 몇 군데)³⁸내 시각으로 ICC 내 네트워크를 통해 비동기적으로 여러 사이트에서 발생 하는 신호. 이러한 비동기 신호는 일시적으로 구성 되며 1 초는 클러스터 때 함께 표로, 금액 순 1 s 세포 증가 캘리포니아^{2 +}. 이러한 신호 ICC 네트워크 내에서 셀을 셀을 전파 하 고 따라서 구성 Ca^{2 +} 신호, 조직 넓은 캘리포니아^{2 +} 파로 하위 휴대 전화 사이트에서 생성 된. 일시적인 클러스터링 및 캘리포니아^{2 +} 의 변론에 신호를 ICC 내 불렸다 Ca^{2 +} 과도 클러스터 (CTCs)³⁸. CTCs 발생 리듬 (예: 매우 비슷한 기간과 유사한 기간 CTCs 사이) 마우스에서 분당 30 회. 반대로, ICC DMP 스핀 들 모양의 세포, 보조 프로세스, SMCs와 정 신경 프로세스 간의 배포 하 고 독립적으로 하지 않는 일부 네트워크^51,52형성. 그러나 ICC-DMP와 SMCs, 간격 접속점 형성, 그리고 SIP syncytium⁵³로 알려진이 큰 syncytium 내에서 작동. 캘리포니아^{2 +} 신호 셀의 길이 따라 여러 사이트에서 발생 하지만 이러한 과도 개입 하거나 일시적으로 클러스터, ICC 내³⁷에서 관찰 하지. 캘리포니아^{2 +} 신호 ICC DMP에 변수 강도, 기간 및 공간 특성 확률적 방식으로 발생합니다. 캘리포니아^{2 +} ICC 내에 신호의 예제를 사용 하 여 아래 프로토콜 및 ICC-DMP, 특정 유형의 셀 현장에서 복잡 한 신호를 분석 하는 기법을 설명. 우리는 Cre Recombinase (Cre) ICC 특정 발기인 (키트)에 의해 구동의 활성화를 유도 한 후 ICC에 독점적으로 GCaMP6f을 표현 하는 유도할 수 있는 Cre Lox p 시스템 활용.

Protocol

사용 하는 모든 동물 및 본이 연구에서 실시 하는 프로토콜 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 헬스 가이드의 국가 기관에 따라 했다. 모든 절차는 기관 동물 사용 관리 네바다, Reno의 대학에 위원회에 의해 승인 되었다. 1입니다. KitGCaMP6f 마우스의 세대 Ai95 크로스 (RCL-GCaMP6f)-D (GCaMP6f 마우스)와 c-키트+ Cre ERT2 ICC 특정 GCaMP6f 표현 동물 (마우스 키트-Cre-GCaMP6f)을 생?…

Representative Results

키트-Cre-GCaMP6F 마우스 (그림 1), 동적 캘리포니아2 + 위장에 ICC의 행동 현장에서 몇 군데 수 신호를 사용 하 여. Confocal 현미경 검사 법, ICC의 특정 인구의 고해상도 이미지는 같은 조직 내의 하지만 초점 (그림 2A)37 의 해부학 다른 비행기에 ICC의 다른 인구에서 신호를 오염 없이 취득 될 수 있다 , …

Discussion

캘리포니아^{2 +} 영상 그대로 조직 또는 세포의 네트워크에서 셀의 특정 종류의 종종 캘리포니아^{2 +} 과도의 복잡 한 패턴을 보여준다. 이 활동에는 신중 하 고 깊이 있는 분석과 정량화 가능한 기본 이벤트와 이러한 이벤트의 활동에 대 한 많은 정보를 필요 합니다. STM과 PTCL 분석 이런이 종류의 녹음에서 나왔고 양적 데이터의 양을 최대화 하는 기회를 제공 합니다.

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Materials

Image J software	NIH	1.5a	Image J software
Volumetry	GWH	Volumetry 8Gd	Custom made analysis software
Isoflurane	Baxter, Deerfield, IL, USA	NDC 10019-360-60
Tamoxifen	Sigma	T5648
GCaMP6F mice	Jackson Laboratory	Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D
Kit-Cre mice	Gifted From Dr. Dieter Saur	c-Kit+/Cre-ERT2
Ethanol	Pharmco-Aaper	SDA 2B-6