Kombinere ikke-reduserende SDS-side analyse og kjemisk Cross Linking å oppdage Multimeric komplekser stabilisert av disulfide sammenhengene i pattedyrceller i kultur

Summary

Disulfide sammenhengene har lenge vært kjent for å stabilisere strukturen av mange proteiner. En enkel metode for å analysere multimeric komplekser stabilisert av disse sammenhengene er gjennom ikke-reduserende SDS-side analyse. Her er denne metoden illustrert ved å analysere den kjernefysiske isoformen av dUTPase fra den menneskelige bein osteosarcoma cellelinje U-2 OS.

Abstract

Strukturene av mange proteiner er stabilisert gjennom kovalente disulfide sammenhengene. I nyere arbeid, har dette obligasjonslån også blitt klassifisert som en post-translational modifikasjon. Dermed er det viktig å kunne studere denne endringen i levende celler. En enkel metode for å analysere disse cystein-stabilisert multimeric komplekser er gjennom en to-trinns metode for ikke-reduserende SDS-side analyse og formaldehyd Cross-Linking. Denne to-trinns metoden er fordelaktig som første skritt for å avdekke multimeric komplekser stabilisert av disulfide sammenhengene på grunn av sin tekniske letthet og lave kostnader for drift. Her er den menneskelige bein osteosarcoma cellelinje U-2 OS brukes til å illustrere denne metoden ved spesielt å analysere den kjernefysiske isoformen av dUTPase.

Introduction

Disulfide sammenhengene har lenge vært kjent for å stabilisere strukturen av mange proteiner. I nyere arbeid, har dette obligasjonslån også blitt klassifisert som en reversibel post-translational modifikasjon, som fungerer som en cystein-basert “Redox Switch” som gir mulighet for modulering av protein funksjon, plassering og samhandling^{1,2, 3,4}. Dermed er det viktig å kunne studere denne endringen. En enkel metode for å analysere disse cystein-stabilisert multimeric komplekser er gjennom ikke-reduserende SDS-side analyse⁵. SDS-PAGE analyse er en teknikk som brukes i mange laboratorier, hvor resultatene kan fås og tolkes raskt, enkelt, og med minimale kostnader, og er fordelaktig over andre teknikker som brukes til å identifisere disulfide sammenhengene som masse massespektrometri^{6 ,7} og sirkulære dichroism⁸.

Et viktig skritt i å avgjøre om denne metoden er en hensiktsmessig teknikk for å hjelpe i en studie er å grundig undersøke den primære sekvensen av protein av interesse for å forsikre det er cystein rester (er) til stede. Et annet nyttig skritt er å forske på eventuelle tidligere krystallstrukturer publisert eller bruke en bioinformatikk program for å utforske de tredimensjonale strukturen av protein av interesse for å visualisere hvor cystein rester (s) kan være plassert. Hvis rester (er) er til stede på utsiden overflaten kan det være en bedre kandidat til å danne en disulfide sammenheng i stedet for en cystein rester begravd på innsiden av strukturen. Det er imidlertid viktig å merke seg at proteiner kan gjennomgå strukturelle endringer på substrat interaksjoner eller protein-protein interaksjoner slik at disse rester til da bli eksponert for miljøet også.

Identifiserte multimeric komplekser kan deretter verifiseres med kjemisk krysskobling ved hjelp av formaldehyd. Formaldehyd er et ideelt kryss-linker for denne verifiserings teknikken på grunn av høy celle permeabilitet og korte kryss-linking span av ~ 2-3 å, sikre påvisning av spesifikke protein-protein interaksjoner^9,10. Her er denne metoden illustrert ved å analysere den kjernefysiske isoformen av dUTPase fra den menneskelige bein osteosarcoma cellelinje U-2 OS¹¹. Imidlertid kan denne protokollen tilpasses andre cellelinjer, vev og organismer.

Protocol

1. blokkering gratis cystein rester bruke Iodoacetamide Grow U-2 OS celler i en 6 cm2 parabolen til 50%-60% confluency i minimum essensielle medium med høy glukose som inneholder 10% fosterets storfe serum og 1% natrium pyruvat ved 37 ° c i 5% co2. Lag et friskt lager på 10 mM iodoacetamide rett før bruk, og kast deretter ubrukt reagens. Legg 0,1 mM endelige konsentrasjon iodoacetamide direkte til cellen kultur Media. Forsiktig rock parabolen ved romtemperatur i 2 m…

Representative Results

Nuclear dUTPase danner en Intermoleylære disulfide-kobling som danner en stabil dimer konfigurasjon gjennom samspillet mellom to cystein rester plassert på den tredje aminosyren av hver monomere protein11. Dette er demonstrert i figur 1a, B. For å sikre denne disulfide koblingen var ikke en uspesifisert interaksjon på grunn av migrasjon unormalt i ikke-redusert miljø, t inkluderingen av en forsvarlig kontroll var …

Discussion

Metoden skissert her gir en rett fremover protokoll for analyse av multimeric komplekser stabilisert gjennom disulfide sammenhengene. Denne protokollen kan enkelt tilpasses andre cellekultur linjer, vev og organismer som gir et bredt spekter av applikasjoner.

Et viktig skritt i denne prosedyren er å sikre disulfide sammenhengene er ikke en konsekvens av utvinningsprosessen. Eventuelle frie cystein rester kan blokkeres ved hjelp av iodoacetamide¹³. Dette alkylating agen…

Materials

16% precast TGX gels	ThermoFisher	Xp00160
175 cm2 Flask	Cell star	658175
18CO	ATCC	CRL-1459
6 cm2 dish	VWR	10861-588
A549	ATCC	CCL-185
Amersham ECL detection kit	GE	16817200
Blot transfer apparatus	Biorad	153BR76789
BME	Sigma Aldrich	M3148
Bradford protein reagent	Biorad	5000006
Bromophenol Blue
BSA	Cell signaling	99985
Cell lysis buffer	Cell signaling	9803
Centrifuge	Eppendor	5415D
DMEM	Gibco	11330-032
Drill
EDTA	Sigma Aldrich	M101
Electrophoresis apparatus	Invitrogen	A25977
Extra thick western blotting paper	ThermoFisher	88610
Fetal bovine serum	Gibco	1932693
Formaldehyde	ThermoFisher	28908
Glass-teflon homogenizer
Glycerol	Sigma Aldrich	65516
Glycine	RPI	636050
Heat block	Denville	10285-D
Hepes	Sigma Aldrich	H0527
Hydrochloric acid	VWR	2018010431
Iodoacetamide	ThermoFisher	90034
Kimwipe	Kimtech	34155
Methanol	Pharmco	339000000
Non-fat dry milk	Cell signaling	99995
PBS	Sigma Aldrich	P3813
PMSF	Sigma Aldrich	329-98-6
Posi-click tube	Denville	C2170
Power supply	Biorad	200120
Prestained marker	ThermoFisher	26619
PVDF membrane	Biorad	162-0177
Rocker	Reliable Scientific	55
Saos2	ATCC	HTB-85
SDS	Biorad	161-0302
Secondary antibody	Cell signaling	70748
Small cell scraper	Tygon	S-50HL class VI
Sodium chloride	RPI	S23020
Sodium pyruvate	Gibco
Sonicator	Branson	450
Sponge pad for blotting	Invitrogen	E19051
Stir plate	Corning	PC353
Sucrose	Sigma Aldrich	S-1888
Tris Base	RPI	T60040
Tris Buffered Saline, with Tween 20, pH 7.5	Sigma Aldrich	SRE0031
Tris-Glycine running buffer	VWR	J61006
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787
Tween 20	Sigma Aldrich	P9416
U-2 OS	ATCC	HTB-96
X-ray film	ThermoFisher	34090