Disulfide sammenhengene har lenge vært kjent for å stabilisere strukturen av mange proteiner. En enkel metode for å analysere multimeric komplekser stabilisert av disse sammenhengene er gjennom ikke-reduserende SDS-side analyse. Her er denne metoden illustrert ved å analysere den kjernefysiske isoformen av dUTPase fra den menneskelige bein osteosarcoma cellelinje U-2 OS.
Strukturene av mange proteiner er stabilisert gjennom kovalente disulfide sammenhengene. I nyere arbeid, har dette obligasjonslån også blitt klassifisert som en post-translational modifikasjon. Dermed er det viktig å kunne studere denne endringen i levende celler. En enkel metode for å analysere disse cystein-stabilisert multimeric komplekser er gjennom en to-trinns metode for ikke-reduserende SDS-side analyse og formaldehyd Cross-Linking. Denne to-trinns metoden er fordelaktig som første skritt for å avdekke multimeric komplekser stabilisert av disulfide sammenhengene på grunn av sin tekniske letthet og lave kostnader for drift. Her er den menneskelige bein osteosarcoma cellelinje U-2 OS brukes til å illustrere denne metoden ved spesielt å analysere den kjernefysiske isoformen av dUTPase.
Disulfide sammenhengene har lenge vært kjent for å stabilisere strukturen av mange proteiner. I nyere arbeid, har dette obligasjonslån også blitt klassifisert som en reversibel post-translational modifikasjon, som fungerer som en cystein-basert “Redox Switch” som gir mulighet for modulering av protein funksjon, plassering og samhandling1,2, 3,4. Dermed er det viktig å kunne studere denne endringen. En enkel metode for å analysere disse cystein-stabilisert multimeric komplekser er gjennom ikke-reduserende SDS-side analyse5. SDS-PAGE analyse er en teknikk som brukes i mange laboratorier, hvor resultatene kan fås og tolkes raskt, enkelt, og med minimale kostnader, og er fordelaktig over andre teknikker som brukes til å identifisere disulfide sammenhengene som masse massespektrometri6 ,7 og sirkulære dichroism8.
Et viktig skritt i å avgjøre om denne metoden er en hensiktsmessig teknikk for å hjelpe i en studie er å grundig undersøke den primære sekvensen av protein av interesse for å forsikre det er cystein rester (er) til stede. Et annet nyttig skritt er å forske på eventuelle tidligere krystallstrukturer publisert eller bruke en bioinformatikk program for å utforske de tredimensjonale strukturen av protein av interesse for å visualisere hvor cystein rester (s) kan være plassert. Hvis rester (er) er til stede på utsiden overflaten kan det være en bedre kandidat til å danne en disulfide sammenheng i stedet for en cystein rester begravd på innsiden av strukturen. Det er imidlertid viktig å merke seg at proteiner kan gjennomgå strukturelle endringer på substrat interaksjoner eller protein-protein interaksjoner slik at disse rester til da bli eksponert for miljøet også.
Identifiserte multimeric komplekser kan deretter verifiseres med kjemisk krysskobling ved hjelp av formaldehyd. Formaldehyd er et ideelt kryss-linker for denne verifiserings teknikken på grunn av høy celle permeabilitet og korte kryss-linking span av ~ 2-3 å, sikre påvisning av spesifikke protein-protein interaksjoner9,10. Her er denne metoden illustrert ved å analysere den kjernefysiske isoformen av dUTPase fra den menneskelige bein osteosarcoma cellelinje U-2 OS11. Imidlertid kan denne protokollen tilpasses andre cellelinjer, vev og organismer.
Metoden skissert her gir en rett fremover protokoll for analyse av multimeric komplekser stabilisert gjennom disulfide sammenhengene. Denne protokollen kan enkelt tilpasses andre cellekultur linjer, vev og organismer som gir et bredt spekter av applikasjoner.
Et viktig skritt i denne prosedyren er å sikre disulfide sammenhengene er ikke en konsekvens av utvinningsprosessen. Eventuelle frie cystein rester kan blokkeres ved hjelp av iodoacetamide13. Dette alkylating agen…
The authors have nothing to disclose.
Vi takknemlig verdsette innsatsen lagt frem av Dr. Jennifer Fischer for rensing av dUTPase polyklonale antistoff og Kerri Ciccaglione for alle hennes innsats for å hjelpe redigere dette manuskriptet. Denne forskningen ble delvis støttet av et stipend fra New Jersey Health Foundation (Grant #PC 11-18).
16% precast TGX gels | ThermoFisher | Xp00160 | |
175 cm2 Flask | Cell star | 658175 | |
18CO | ATCC | CRL-1459 | |
6 cm2 dish | VWR | 10861-588 | |
A549 | ATCC | CCL-185 | |
Amersham ECL detection kit | GE | 16817200 | |
Blot transfer apparatus | Biorad | 153BR76789 | |
BME | Sigma Aldrich | M3148 | |
Bradford protein reagent | Biorad | 5000006 | |
Bromophenol Blue | |||
BSA | Cell signaling | 99985 | |
Cell lysis buffer | Cell signaling | 9803 | |
Centrifuge | Eppendor | 5415D | |
DMEM | Gibco | 11330-032 | |
Drill | |||
EDTA | Sigma Aldrich | M101 | |
Electrophoresis apparatus | Invitrogen | A25977 | |
Extra thick western blotting paper | ThermoFisher | 88610 | |
Fetal bovine serum | Gibco | 1932693 | |
Formaldehyde | ThermoFisher | 28908 | |
Glass-teflon homogenizer | |||
Glycerol | Sigma Aldrich | 65516 | |
Glycine | RPI | 636050 | |
Heat block | Denville | 10285-D | |
Hepes | Sigma Aldrich | H0527 | |
Hydrochloric acid | VWR | 2018010431 | |
Iodoacetamide | ThermoFisher | 90034 | |
Kimwipe | Kimtech | 34155 | |
Methanol | Pharmco | 339000000 | |
Non-fat dry milk | Cell signaling | 99995 | |
PBS | Sigma Aldrich | P3813 | |
PMSF | Sigma Aldrich | 329-98-6 | |
Posi-click tube | Denville | C2170 | |
Power supply | Biorad | 200120 | |
Prestained marker | ThermoFisher | 26619 | |
PVDF membrane | Biorad | 162-0177 | |
Rocker | Reliable Scientific | 55 | |
Saos2 | ATCC | HTB-85 | |
SDS | Biorad | 161-0302 | |
Secondary antibody | Cell signaling | 70748 | |
Small cell scraper | Tygon | S-50HL class VI | |
Sodium chloride | RPI | S23020 | |
Sodium pyruvate | Gibco | ||
Sonicator | Branson | 450 | |
Sponge pad for blotting | Invitrogen | E19051 | |
Stir plate | Corning | PC353 | |
Sucrose | Sigma Aldrich | S-1888 | |
Tris Base | RPI | T60040 | |
Tris Buffered Saline, with Tween 20, pH 7.5 | Sigma Aldrich | SRE0031 | |
Tris-Glycine running buffer | VWR | J61006 | |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
U-2 OS | ATCC | HTB-96 | |
X-ray film | ThermoFisher | 34090 |