Combinación de análisis de SDS-página no-reducción y reticulación química para detectar complejos multiméricos estabilizados por enlaces de disulfuro en células de mamíferos en la cultura
Summary
Durante mucho tiempo se ha sabido que los vínculos de disulfuro estabilizan la estructura de muchas proteínas. Un método simple para analizar complejos multiméricos estabilizados por estos vínculos es mediante el análisis de SDS-PAGE no reductor. Aquí, este método se ilustra mediante el análisis de la isoforma nuclear de dUTPase de la línea de células de osteosarcoma ósea humana U-2 OS.
Abstract
Las estructuras de muchas proteínas se estabilizan a través de enlaces de disulfuro covalente. En los trabajos recientes, este vínculo también se ha clasificado como una modificación post-translacional. Por lo tanto, es importante poder estudiar esta modificación en las células vivas. Un método simple para analizar estos complejos multiméricos de la cisteína estabilizada es a través de un método de dos pasos de no reducir el análisis de SDS-PAGE y la reticulación de formaldehído. Este método de dos pasos es ventajoso como el primer paso para descubrir complejos multiméricos estabilizados por enlaces de disulfuro debido a su facilidad técnica y bajo costo de operación. Aquí, la línea de células osteosarcoma ósea humana U-2 OS se utiliza para ilustrar este método mediante el análisis específico de la isoforma nuclear de dUTPase.
Introduction
Durante mucho tiempo se ha sabido que los vínculos de disulfuro estabilizan la estructura de muchas proteínas. En los trabajos recientes, este lazo también se ha clasificado como una modificación post-translacional reversible, actuando como un “interruptor redox” basado en la cisteína que permite la modulación de la función de la proteína, ubicación e interacción1,2, 3,4. Por lo tanto, es importante poder estudiar esta modificación. Un método simple para analizar estos complejos multiméricos de la cisteína estabilizada es a través de análisis de SDS-PAGE no-reducción5. El análisis de SDS-PAGE es una técnica utilizada en muchos laboratorios, donde los resultados se pueden obtener e interpretar de forma rápida, fácil y con costos mínimos, y es ventajoso sobre otras técnicas utilizadas para identificar enlaces de disulfuro como la espectrometría de masas6 ,7 y dicroísmo circular8.
Un paso importante para determinar si este método es una técnica apropiada para ayudar en un estudio es examinar a fondo la secuencia primaria de la proteína de interés para asegurar que hay residuos de cisteína presentes. Otro paso útil es investigar cualquier estructura cristalina anterior publicada o utilizar una aplicación de bioinformática para explorar las tres estructuras dimensionales de la proteína de interés para visualizar donde pueden estar localizados los residuos de cisteína. Si el residuo (s) está presente en la superficie exterior puede ser un mejor candidato para formar un enlace de disulfuro en lugar de un residuo de cisteína enterrado en el interior de la estructura. Sin embargo, es importante tener en cuenta que las proteínas pueden someterse a cambios estructurales en las interacciones de sustrato o interacciones proteína-proteína permitiendo que estos residuos a continuación, se exponen al medio ambiente, así.
Los complejos multiméricos identificados se pueden verificar con la reticulación química utilizando formaldehído. El formaldehído es un enlace cruzado ideal para esta técnica de verificación debido a la alta permeabilidad de las células y a la corta distancia cruzada de ~ 2-3 Å, asegurando la detección de interacciones proteína-proteína específicas9,10. Aquí, este método se ilustra mediante el análisis de la isoforma nuclear de dUTPase de la línea de células osteosarcoma ósea humana U-2 OS11. Sin embargo, este protocolo puede ser adaptado para otras líneas celulares, tejidos y organismos.
Protocol
Representative Results
Discussion
El método descrito aquí da un protocolo recto para el análisis de complejos multiméricos estabilizados a través de enlaces de disulfuro. Este protocolo se puede adaptar fácilmente a otras líneas de cultivo celular, tejidos y organismos que permiten una amplia gama de aplicaciones.
Un paso importante en este procedimiento es garantizar que los enlaces de disulfuro no sean una consecuencia del procedimiento de extracción. Cualquier residuo de cisteína libre puede ser bloqueado usando io…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos gratamente los esfuerzos realizados por la Dra. Jennifer Fischer para la purificación del anticuerpo policlonales de dUTPase y Kerri ciccaglione por todos sus esfuerzos para ayudar a editar este manuscrito. Esta investigación fue apoyada parcialmente por una subvención de la Fundación de salud de Nueva Jersey (Grant #PC 11-18).
Materials
| 16% precast TGX gels | ThermoFisher | Xp00160 | |
| 175 cm2 Flask | Cell star | 658175 | |
| 18CO | ATCC | CRL-1459 | |
| 6 cm2 dish | VWR | 10861-588 | |
| A549 | ATCC | CCL-185 | |
| Amersham ECL detection kit | GE | 16817200 | |
| Blot transfer apparatus | Biorad | 153BR76789 | |
| BME | Sigma Aldrich | M3148 | |
| Bradford protein reagent | Biorad | 5000006 | |
| Bromophenol Blue | |||
| BSA | Cell signaling | 99985 | |
| Cell lysis buffer | Cell signaling | 9803 | |
| Centrifuge | Eppendor | 5415D | |
| DMEM | Gibco | 11330-032 | |
| Drill | |||
| EDTA | Sigma Aldrich | M101 | |
| Electrophoresis apparatus | Invitrogen | A25977 | |
| Extra thick western blotting paper | ThermoFisher | 88610 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 1932693 | |
| Formaldehyde | ThermoFisher | 28908 | |
| Glass-teflon homogenizer | |||
| Glycerol | Sigma Aldrich | 65516 | |
| Glycine | RPI | 636050 | |
| Heat block | Denville | 10285-D | |
| Hepes | Sigma Aldrich | H0527 | |
| Hydrochloric acid | VWR | 2018010431 | |
| Iodoacetamide | ThermoFisher | 90034 | |
| Kimwipe | Kimtech | 34155 | |
| Methanol | Pharmco | 339000000 | |
| Non-fat dry milk | Cell signaling | 99995 | |
| PBS | Sigma Aldrich | P3813 | |
| PMSF | Sigma Aldrich | 329-98-6 | |
| Posi-click tube | Denville | C2170 | |
| Power supply | Biorad | 200120 | |
| Prestained marker | ThermoFisher | 26619 | |
| PVDF membrane | Biorad | 162-0177 | |
| Rocker | Reliable Scientific | 55 | |
| Saos2 | ATCC | HTB-85 | |
| SDS | Biorad | 161-0302 | |
| Secondary antibody | Cell signaling | 70748 | |
| Small cell scraper | Tygon | S-50HL class VI | |
| Sodium chloride | RPI | S23020 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | ||
| Sonicator | Branson | 450 | |
| Sponge pad for blotting | Invitrogen | E19051 | |
| Stir plate | Corning | PC353 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S-1888 | |
| Tris Base | RPI | T60040 | |
| Tris Buffered Saline, with Tween 20, pH 7.5 | Sigma Aldrich | SRE0031 | |
| Tris-Glycine running buffer | VWR | J61006 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
| U-2 OS | ATCC | HTB-96 | |
| X-ray film | ThermoFisher | 34090 |
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